Summary
Här presenterar vi en metod för screening anti-hepatit B-virala medel som hämmar HBX-DDB1 interaktion med hjälp av en Split luciferas assay system. Detta system möjliggör enkel detektering av protein-proteininteraktioner och är lämplig för att identifiera hämmare av sådana interaktioner.
Abstract
Det finns ett akut behov av nya terapeutiska medel för infektion med hepatit B-virus (HBV). Även om för närvarande tillgängliga nukleos (t) IDE analoger kraftigt hämmar viral replikering, de har ingen direkt effekt på uttrycket av virala proteiner transkriberas från en viral kovalent slutna cirkulära DNA (cccdna). Eftersom hög viral antigen belastning kan spela en roll i denna kroniska och HBV-relaterade carcinogenes, är målet med HBV-behandling att utrota virala proteiner. HBV reglerande protein X (HBx) binder till värden DNA-skadebindande protein 1 (DDB1) protein för att försämra strukturellt underhåll av kromosomer 5/6 (Smc5/6), vilket resulterar i aktivering av viral transkription från cccDNA. Här, med hjälp av en Split luciferas kompletterings analyssystem, presenterar vi ett omfattande sammansatt screening system för att identifiera hämmare av HBX-DDB1 interaktion. Vårt protokoll möjliggör enkel detektering av interaktionsdynamik i realtid inom levande celler. Denna teknik kan bli en viktig analys för att upptäcka nya terapeutiska medel för behandling av HBV-infektion.
Introduction
Hepatit B-virus (HBV) infektion är ett stort folkhälsoproblem över hela världen, med årliga uppskattningar av 240 000 000 personer kroniskt infekterade med HBV och 90 000 dödsfall på grund av komplikationer från infektionen, inklusive cirros och Hepatocellulär cancer (HCC)1. Även om den nuvarande anti-HBV terapeutiska medel, nukleos (t) IDE-analoger, tillräckligt hämma viral omvänd Transkription, de sällan uppnå eliminering av virala proteiner, vilket är det långsiktiga kliniska målet. Deras dåliga effekt på viral proteineliminering beror på deras avsaknad av direkt effekt på viral transkription från episomalt viral kovalent slutna cirkulära DNA (cccdna) minikromosomer i hepatocyte Nucleus2.
HBV-transkription aktiveras av HBV Regulatory X (HBx) protein3. Nyligen genomförda studier visade att HBX försämrar strukturellt underhåll av kromosomer 5/6 (Smc5/6), en värd begränsning faktor som blockerar HBV transkription från cccdna, via kapning en DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin Ligase Complex4,5,6. Därför är ett viktigt steg för att främja viral transkription från cccDNA tros vara HBx-DDB1 interaktion. Föreningar som kan hämma bindningen mellan HBx och DDB1 kan blockera viral transkription, och faktiskt nitazoxanide identifierades som en hämmare av HBx-DDB1 interaktion via ett screening system som utvecklats i vårt laboratorium7.
Här presenterar vi vår bekväma screening system som används för att identifiera hämmare av HBX-DDB1 interaktion, som utnyttjar en Split luciferas kompletterande analys7,8. Split luciferas subenheter är smält till HBX och DDB1, och HBX-DDB1 interaktion ger subenheter i närheten för att bilda ett funktionellt enzym som genererar en ljus självlysande signal. Eftersom interaktionen mellan subenheterna är reversibel kan systemet detektera HBx-DDB1-proteiner snabbt (figur 1). Med hjälp av detta system, en stor sammansatt bibliotek kan lätt screenas, vilket kan resultera i upptäckten av nya föreningar som kan effektivt hämma HBx-DDB1 interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: en schematisk representation av Split luciferas-analysen visas i figur 1A, och analysprocessen beskrivs i figur 1B. Interaktionsdynamiken kan mätas i realtid utan cell Lys.
1. cell beredning
- Bibehålla odlade HEK293T celler i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% v/v fetalt Nötkreaturserum (FBS), 1x penicillin/streptomycin vid 37 ° c i 20% O2 och 5% Co2.
- Utsäde 5 x 106 celler i en 100 mm maträtt med 10 ml DMEM och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Transitivt transfect 1 μg HBx och DDB1 med Split luciferases i cellerna enligt följande metod.
Anmärkning: mängden plasmid DNA transfekterade kan bero på transfektion Regent används. Den optimala positionen av Split luciferas smält till målproteinet måste bestämmas i förväg. I detta fall, HBX smält till lgbit vid C-terminus av HBX (HBX-lgbit) och DDB1 smält till smbit vid N-Terminus av DDB1 (smbit-DDB1) förutsatt att de bästa resultaten (dvs, den ljusaste luciferas signaler). Denna process har tidigare rapporterats i detalj7.- Späd ut 1 μg HBx-LgBit som uttrycker DNA-plasmid och 1 μg SmBit-DDB1 som uttrycker DNA-plasmid (tabell över material) i DNA-kondensbuffert (tabell över material) till en total volym på 300 μl.
- Tillsätt 16 μl av förstärkare lösning (tabell över material) och blanda genom vortexa för 1 s.
- Inkubera provet i rumstemperatur i 3 minuter.
- Tillsätt 60 μl transfektionsreagens (tabell över material) till provet och blanda med vortexa i 10 s.
- Inkubera provet i rumstemperatur i 8 minuter.
- Under inkubering, aspirera odlingsmediet från skålen (bereds i steg 1,2), och tvätta celler med 5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS genom aspiration och tillsätt 7 mL DMEM.
- Tillsätt 3 mL DMEM till röret som innehåller transfektionkomplexen. Blanda genom att Pipettera och tillsätt transfektionkomplexen på cellen i 10 cm skålen.
- Inkubera cellerna vid 37 ° c i en inkubator under 5% CO2 för 10 h.
- Reseed cellerna i en vit 96 väl tallrik vid 5 x 104 celler/brunn i 50 μl av medel/brunn enligt följande metod.
- Ta bort det förbrukade cell odlingsmediet och tvätta cellerna med 5 mL PBS.
- Ta bort PBS genom aspiration, tillsätt 1 mL 0,25% trypsin-EDTA, och inkubera vid 37 ° c i 5 minuter för att lossa celler.
- Tillsätt 4 mL DMEM och skingra mediet genom att Pipettera över ytan på cell skiktet flera gånger. Överför cellsuspensionen till ett rör.
- Centrifugera celler vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och Kassera supernatanten.
- Späd cellpelleten med buffrat cellodlingsmedium (tabell över material) kompletterat med 10% FBS till en sådd täthet på 1,0 x 106 celler/ml.
- Pipettera 50 μL cellsuspension i varje brunn på en 96-brunn och returnera cellerna till inkubatorn.
- Inkubera celler vid 37 ° c under 5% CO2 för 10 h.
2. sammansatt screening
- Under inkubationen späder man ut screening föreningarna (tabell över material) och spädningsvätskan (dimetylsulfoxid [DMSO]) vid 13,5 x koncentration. Till exempel, om beståndet är 10 mM och screening koncentrationen är 10 μM, tillsätt 1 μL stamlösning till 73,1 μL buffrat cell odlingssubstrat.
- Tillsätt 12,5 μl självlysande substrat (tabell över material) till varje brunn och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
Obs: som negativa kontroller bör brunnarna i båda ändarna av plattan (dvs kolumnerna 1 och 12) inte innehålla något självlysande substrat. - Mät baslinjen luminiscens med hjälp av en luminometern (tabell över material).
- Omedelbart efter den initiala mätningen, tillsätt 5 μL av föreningar och kontroll DMSO späddes i steg 2,1 till varje brunn.
Obs: den slutliga koncentrationen kommer att vara 10 μm. - Mät luminiscens värden var 30 min för 2 h.
Observera: plattan ska inkuberas i mörker vid rumstemperatur. - Beräkna de hämmande effekterna genom jämförelse med kontroll DMSO behandling efter normalisering till baslinjen signaler.
Anmärkning: screening varje förening i två eller tre exemplar kan minska variationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat efter användning av detta protokoll visas i figur 2A, B. Signal-till-bakgrund förhållandet var större än 80 och Z ' faktor9 (guldmynt standard kvalitetsindex för hög genomflöde screening) var större än 0,5, vilket tyder på att detta analyssystem var acceptabelt för hög genomströmning screening. Med tröskeln inställd på > 40% hämning jämfört med kontrollen (DMSO endast), identifierade vi nitazoxanide som en kandidat drog7. Med hjälp av detta system, bättre kandidatläkemedel kan hittas genom screening andra, större sammansatta bibliotek.
Figur 1: schematisk representation av Split luciferas analys av HBX-DDB1 interaktion. (A) principen bakom detektion av HBX-DDB1 bindning med hjälp av Split luciferas kompletterande analyssystem. Den separerade luciferas subunits, lgbit och smbit, smält till HBX och DDB1, respektive. Den HBX-DDB1 interaktion ger subenheter i närheten för att bilda ett funktionellt enzym som genererar en självlysande signal. Interaktionen mellan subenheterna är reversibel. B) split luciferas-analys. Efter Co-transfektion av plasmider för uttryck av HBx smält till LgBit och DDB1 smält till SmBit, celler var åter seedade till en 96 väl tallrik. Tillsatsen av självlysande substrat möjliggör mätning av luciferas aktivitet utan ett cell Lys steg. Luciferase verksamhet kan mätas efter tillsats av screening föreningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: framgångsrika resultat av Split luciferas-analysen. A) representativa luminescerande signaler från en 96-välskylt. Luciferase intensitet representeras av siffror och färger. Kolumnerna 1 och 12 är kontroller där det självlysande underlaget inte har lagts till. Z-faktorn var större än 0,5. (B) representativ tidsserie resultat av relativa luciferas aktivitetsnivåer efter tillsats av screening föreningar till en 96 väl tallrik. X-axeln representerar de hämmande effekter som beräknats jämfört med kontroll (DMSO) efter standardisering till baslinjen luciferas aktivitet. Den mest effektiva föreningen var nitazoxanide. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade en bekväm screeningmetod med hjälp av en Split luciferas analys för att hitta HBX-DDB1 bindande hämmare. Interaktiondynamiken kan upptäckas i realtid i levande celler utan behov av celllys. Hämning av HBx-DDB1 interaktion leder till återställande av Smc5/6, vilket resulterar i dämpning av viral transkription, proteinuttryck, och cccDNA produktion7. Denna nya mekanism för antiviral åtgärder kan övervinna bristerna i nuvarande HBV-terapier.
Även om det finns ett antal metoder för att undersöka protein-proteininteraktioner i levande celler, är det fortfarande svårt att undersöka dessa interaktioner10. Vårt förfarande är enkelt och kräver bara en kort tid att skärmen 1 96 bra tallrik. Dessutom var screening kvaliteten tillfredsställande med en hög Z-poäng, guldmynt standard kvalitetsindex för hög genomströmning screening9. Vår analys kan vara lämplig för Robotic Automation11 och är en effektiv analys för Drug discovery.
Medan det protokoll som beskrivs här används den HEK293T cellinjer eftersom dess höga transfektion effekt och hög spridning förmåga är lämpliga för hög genomströmning screening, denna screeningmetod kan utföras med hjälp av andra cellinjer (t. ex., HepG2) utan ändringar7. Som en realistisk strategi för screening av föreningar, HEK293T celler kan användas i den första screening följt av HepG2 celler i en andra validering screening. Vissa föreningar kan inte Visa signifikanta resultat i olika cellinjer när effekterna är beroende av indirekta mekanismer.
Eftersom vår avsikt var att utveckla en högpresterande screeningmetod, är efterföljande valideringsstudier nödvändiga för att bekräfta om de identifierade föreningarna fungerar som interaktions hämmare. Minskade nivåer av självlysande signaler i denna analys inte alltid motsvarar hämning av HBX-DDB1 interaktion. Cytotoxicitetstester, Co-immunoprecipitation studier, och ytterligare anti-HBV experiment är viktiga för att bekräfta effekterna7.
Även om vi tidigare identifierat nitazoxanid som en hämmare av HBx-DDB1 interaktion genom screening en relativt liten skala bibliotek7, ytterligare studier med screening av mycket större sammansatta bibliotek kan lätt utföras för att identifiera nya föreningar som kan hämma protein-protein interaktioner mer effektivt. När du utför en sådan ytterligare screening, nitazoxanide kan användas som en positiv kontroll för analysen. Dessutom kan det system som beskrivs här tillämpas på andra protein-protein interaktioner. Protein-proteininteraktioner är en viktig klass av drogen mål12. Faktum är att många andra virus interagerar med värd faktorer för att replikera eller uttrycka sin patogenicitet13,14. Den Split luciferase-baserade analysen beskrivs här, som riktar samspelet mellan viral och värd proteiner, kan ge en ny strategi för att utveckla botemedel mot HBV och andra infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag-in-Aid från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan (#19H03430 och #17K09405 till M.O., och #19J11829 till K.S.), genom ett bidrag-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden (#18H05024 till M.O.), av forskningsprogrammet om hepatit från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling, AMED (till M.O., #JP19fk021005), genom program för innovativ utveckling och tillämpning av nya läkemedel för hepatit B (#JP19fk0310102 till KK) från AMED, genom bidrag från Japan Stiftelsen för tillämpad Enzymologi och från Kobayashi Stiftelsen för cancer forskning (till M.O.), av GSK Japan Research Grant 2018 (till K.S.), och genom ett bidrag från Miyakawa Memorial Research Foundation (till K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
