Summary
Här presenterar vi ett verktyg som kan användas för att studera posttranscriptional modulering av en utskrift i primära alveolar epitelceller med hjälp av ett inducerbart uttryck system kopplat till en pipett elektroporation teknik.
Abstract
Att studera posttranscriptional reglering är grundläggande för att förstå moduleringen av en viss budbärare RNA (mRNA) och dess inverkan på cellhomeostas och metabolism. Fluktuationer i avskriftuttryck kan ändra översättningseffektiviteten och i slutändan cellaktiviteten för en utskrift. Flera experimentella metoder har utvecklats för att undersöka halveringstiden för mRNA även om vissa av dessa metoder har begränsningar som förhindrar korrekt studie av posttranscriptional modulering. Ett promotorinduktionssystem kan uttrycka en gen av intresse under kontroll av en syntetisk tetracyklinreglerad promotor. Denna metod gör det möjligt att uppskatta halveringstiden av en given mRNA under något experimentellt tillstånd utan att störa cellhomeostas. En viktig nackdel med denna metod är nödvändigheten av transfect celler, som begränsar användningen av denna teknik i isolerade primära celler som är mycket resistenta mot konventionella transfection tekniker. Alveolar epitelceller i primärkulturen har använts i stor utsträckning för att studera alveolarepitels cell- och molekylärbiologi. De unika egenskaperna och fenotypen av primära alveolarceller gör det viktigt att studera posttranskriptionella modulering av gener av intresse för dessa celler. Därför var vårt mål att utveckla ett nytt verktyg för att undersöka posttranscriptionella moduler ingav mRNAs av intresse för alveolar epitelceller i primärkulturen. Vi utformade ett snabbt och effektivt transienta transfection protokoll för att infoga ett transkriptionsstyrt plasmid uttrycksystem i primära alveolar epitelceller. Denna kloning strategi, med hjälp av en viral epitope att märka konstruktionen, möjliggör enkel diskriminering av konstruera uttryck från endogena mRNAs. Med hjälp av en modifierad ΔΔ kvantifieringscykel (Cq) metod kan uttrycket av avskriften sedan kvantifieras med olika tidsintervall för att mäta dess halveringstid. Våra data visar effektiviteten i denna nya metod för att studera posttranscriptional reglering i olika patofysiologiska förhållanden i primära alveolar epitelceller.
Introduction
Flera tekniker har utvecklats för att bestämma halveringstiden för mRNAs. Pulsjakten spånteknik, som använder märkta mRNAs, möjliggör samtidig utvärdering av en stor pool av mRNAs med minimal cellulära störningar. Detta tillvägagångssätt tillåter dock inte en direkt uppskattning av halveringstiden för en enda genavskrift och kan inte genomföras för att studera posttranscriptional modulering av en mRNA efter stimulering med tillväxtfaktorer, ROS, alarminer eller inflammation1.
Användningen av transkriptionshämmare, såsom aktinomycin D och α-amanitin, är en relativt enkel metod för att mäta mRNA-nedbrytningskinetik över tiden. En stor fördel med detta tillvägagångssätt jämfört med tidigare tekniker, (dvs puls-chase) bygger på förmågan att direkt uppskatta halveringstiden för en viss utskrift och jämföra hur olika behandlingar kan påverka dess nedbrytning kinetik. Emellertid, den betydande skadliga effekten av transkriptionshämmare på cellfysiologi utgör en stor nackdel med metoden2. Faktum är att hämningen av hela celltranskriptomen med dessa läkemedel har den negativa bieffekten av att störa syntesen av viktiga element som är involverade i mRNA-stabilitet, såsom microRNAs (miRNAs), samt uttryck och syntes av RNA-bindande proteiner, som är viktiga för mRNA-nedbrytning och stabilitet. Den allvarliga störningen av gentranskription av dessa läkemedel kan därför artefactually ändra nedbrytningskurvorna av transkriptioner.
Det promotoriska induktionssystemet representerar en tredje metod för att mäta halveringstiden för en specifik mRNA. Denna metod mäter nedbrytningen av en specifik mRNA på ett liknande sätt som metoder som använder transkriptionshämmare. Två typer av induktionssystem används ofta: serum-inducerad c-fos promotorn3 och Tet-Off inducible system4. Med c-fos-systemet behövs inte användning av transkriptionshämmare som kan vara giftiga för cellen. Den här metoden kräver dock synkronisering av cellcykeln, vilket förhindrar utvärdering av den faktiska stabiliteten i en utskrift under interfas5. Tet-Off-systemet gör däremot det starka uttrycket av den intressegen (GOI) som kontrolleras av en syntetisk tetracyklinreglerad promotor. Detta system kräver att förekomsten av två element som måste cotransfected i cellen för att fungera. Den första plasmid (pTet-Off) uttrycker det reglerande proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkriptionsfaktor som består av prokaryota förtryckeren TetR (från Escherichia coli) smält till tre transkriptiontransaktiveringdomäner från viralproteinet HSV VP16. Den goi klonas i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (PTight),bestående av den minimala sekvensen av cytomegalovirus (CMV) promotorn smält till sju upprepningar av tetO operatören sekvens. Transkriptionen av genen nedströms PTight är beroende av interaktionen mellan TetR med tetO. I närvaro av tetracyklin eller dess derivat, doxycyklin, tetr förtryckeren förlorar sin affinitet för tetO operatören, vilket leder till ett upphörande av transkription4. Egenskaperna hos Tet-Off-systemet gör det till en idealisk modell för studier av specifika mRNA uttryck i eukaryota celler samtidigt som man undviker potentiella pleiotropa effekter som är sekundära till frånvaron av prokaryota regleringssekvenser i eukaryota cell6. Vanligtvis, dubbelt stabila Tet-Off cellinjer (HEK 293, HeLa och PC12) används med detta system för att integrera kopior av regulatorn och svar plasmids för bekväm tillgång till kontrollerbara genuttryck7,8,9.
Flera modeller av alveolar epitelceller i kultur har använts för att studera den cellulära och molekylära biologin av alveolar epitel. I åratal har forskare i stor utsträckning använt mänskliga eller gnagare primära celler10,11 samt förevigade cellinjer såsom mänskliga A549 eller råtta RLE-6TN celler12,13. Även om de i allmänhet är mindre proliferativa och svårare att odla och transfect, alveolar epitelceller i primärkultur förblir guldmyntfoten för studier av funktionen och dysfunktion av alveolar epitel i fysiologiska och patologiska tillstånd. I själva verket uppvisar förevigade cellinjer som A549-celler inte de komplexa egenskaperna och fenotyperna av primära celler, medan alveolar epitelceller i primärkulturen rekapitulerade de viktigaste egenskaperna hos alveolarepitelet, särskilt förmågan att bilda en polariserad och stram barriär14,15. Tyvärr, dessa celler är mycket resistenta mot konventionella transfection tekniker, såsom de som använder liposomer, vilket gör användningen av en promotor-inducerad system som Tet-Off mycket svårt.
Posttranscriptional modulering av mRNAs är en av de mest effektiva metoderna för att snabbt modulera genen uttryck av en utskrift16. Den oöversatta regionen mRNA 3 (3' UTR) spelar en viktig roll i denna mekanism. Det har visat sig att det, till skillnad från 5 ' UTR, finns ett exponentiellt samband mellan längden på 3 ' UTR och cellulära och morfologiska komplexiteten hos en organism. Denna korrelation tyder på att 3 ' UTR, liksom mRNA kodning regioner, har utsatts för naturligt urval för att möjliggöra allt mer komplexa posttranscriptional modulering helaevolutionen 17. 3' UTR innehåller flera bindningsplatser för proteiner och miRNAs som påverkar stabiliteten och översättningen av avskriften.
I det aktuella arbetet utvecklade vi ett verktyg för att undersöka rollen av mycket bevarade domäner i 3 ' UTR av en GOI för kontroll av utskrift stabilitet. Vi fokuserade på epitelial natriumkanal, alfa underavdelning (αENaC), som spelar en nyckelroll i alveolar epitelfysiologi18. Alveolar epitelceller i primärkultur var framgångsrikt övergående transfected med de två komponenterna i Tet-Off-systemet, vilket möjliggör studier av rollen av 3 UTR i mRNA stabilitet med ett system som minimalt påverkar cellfysiologi och metabolism i jämförelse med användningen av transkriptionshämmare med andra protokoll. En kloningsstrategi utvecklades för att skilja uttryck för de kinesiska direktionerna från den endogena genen med hjälp av en nonendogenously uttryckt epitop (V5). Responsen och regulatoriska plasmider överfördes sedan till alveolarepitelceller med hjälp av en pipettelektroporationsteknik. Därefter mättes uttrycket av avskriften genom att inkubera cellerna med doxycyklin med olika tidsintervall. Halveringstiden för avskriften utvärderades av RT-qPCR med en modifierad Cq-metod med hjälp av den transinfekterade tTA-Ad mRNA-produkten för normalisering. Genom vårt protokoll erbjuder vi ett bekvämt sätt att studera posttranscriptional modulering av en utskrift under olika förhållanden och definiera deltagande av oöversatta regioner mer i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförfaranden genomfördes i enlighet med riktlinjerna från det kanadensiska rådet för djurvård och godkändes av den institutionella djurvårdskommittén vid Forskningscentret Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Design och generering av responsplasmid som uttrycker genen av intresse (GOI)
- Använd en inducible tetracyklin-off vektor, till exempel pTRE-Tight.
- Analysera sekvensen av GOI och multiplaraven (MCS) för vektorn för att identifiera begränsningsplatserna i MCS som inte finns internt i GOI.Analyze the sequence of the GOI and the multiple clone site (MCS) of the vector to identify the restriction sites in the MCS that are not present internally in the GOI.
- Isolera primära alveolar epitelceller från manliga Sprague-Dawley råtta lungor som beskrivits tidigare19,20.
- Rena den totala RNA från alveolar epitelceller genom RNA-extraktion med hjälp av en standardmetod, såsom fenol/kloroform utvinning eller användning av kiselbaserade RNA-spinnpelare.
- Omvänd transkribera mRNA till kompletterande DNA (cDNA) med oligo(dT) och hifiomvänd transkriptas.
- Använd high-fidelity Taq polymeras e och standard överlappning PCR tekniker för att flankera GOI med två utvalda begränsningar enzym erkännande platser med hjälp av utformade grundfärger.
- Låt den främre primern innehålla en Kozak konsensus ribosom bindande plats21 för att förbättra uttrycksnivåer för att studera proteinuttryck parallellt med mRNA stabilitet. En sekvens som kodar V5-epitetuppströms en goi måste inkluderas för att särskilja uttrycket för den transinfekterade GOI från endogena uttryck (tabell 1).
- Låt den omvända primern innehålla en polyadenylationssignal efter stoppkodonen.
- Mutanter kan genereras genom sekventiell borttagning för att studera effekterna av olika 3 UTR regioner på stabiliteten hos mRNA av INDIENS ORGANISATIONER med hjälp av omvänd primers kodning en polyadenylation webbplats som gradvis tar bort 3 'slutet av GOI 3 ' UTR(figur 6). Alternativt kan PCR-riktad mutagenes användas för att rikta in sig på en viss intresseregion i 3' UTR22.
- Smält den oducible vektorn och insatsen med de tidigare valda begränsningsenzymerna vid lämplig inkubationstemperatur i 1 h, följt av behandling med fosfatas under vektorreaktionen i 30 minuter för att undvika självligering.
- Separera den smälta vektorn och sätt in segment en elektrofores i en 1-1,5% agarose gel (koncentration beroende på skärets storlek).
- Med hjälp av ett blad och ett UV-ljus, samla dna-fragment som innehåller önskad insats och vektor som ska vara ligated.
OBS: Protokollet kan pausas här. - Rena de insamlade segmenten från agarosegeln med hjälp av en kiselbaserad PCR-reningsssats och mät koncentrationen genom spektrofotometri vid 260 nm.
- Ligate GOI och den inducerbara vektorn med T4 DNA ligase med hjälp av en vektor:infoga molar förhållandet 1:3 för att öka sannolikheten för ligering. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur (RT) i 3 h.
- Omvandla ligationsreaktionen till kompetent E. coli (DH5α).
- Tillsätt 1-10 ng vektor och gen till ett rör som innehåller 100 μL behöriga celler. Inkubera cellerna på is i 30 min och värm sedan upp celler vid 42 °C i 45 s. Placera röret på is i 2 min och tillsätt 900 μL RT LB-medium. Inkubera cellerna i 1 h vid 37 °C med skakningar vid 225 varv/min.
- Sprid 100 μL av reaktionen på en LB-agarplatta med ett lämpligt antibiotikum (t.ex. 100 μg/ml ampicillin för pTRE-Tight vektor) för att välja de transformerade bakterierna. Inkubera plattan över natten vid 37 °C.
- Välj enskilda kolonier med hjälp av en inokuleringsslinga eller en 20 μL spets och inkubera över natten i 5 ml LB-medium som innehåller lämpligt antibiotikum vid 37 °C med skakningar. De omvandlade bakterierna kan lagras i glycerollager vid -80 °C vid ett förhållande av 400:600 LB-medel till glycerol.
- Extrahera plasmid-DNA med kiselbaserade plasmidkolonner och mät koncentrationen genom spektrofotometri vid 260 nm. Bekräfta införandet av den kinesiska regeringen genom begränsningsanalys och dess orientering och frånvaron av mutationer som kan införas under RT-PCR genom sekvensering.
2. Transfection av responsplasmid uttrycker genen av intresse (GOI) i primära alveolar epitelceller
- Isolera typ II alveolar epitelceller från råttlungor.
- Seedcellerna med en densitet på 1 x 106 celler/cm2 i 100 mm Petri-rätter med komplett minsta viktiga medium (komplett MEM). Komplett MEM kompletteras med 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycin, Septra (3 μg/mL trimethoprim och 17 μg/mL sulfamethoxazole), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) och 2 mM L-glutamin. Odla cellerna i 24 h vid 37 °C i 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Nästa dag, placera 500 μL komplett MEM utan antibiotika i varje brunn av en ny 12 brunnsplatta och förvärm plattan vid 37 °C i 30 min. Under detta steg är det viktigt att använda fetalt nötkreatur serum fritt från förorenande tetracykliner eller med en nivå för låg för att störa oducibility.
- Förbered 1,5 ml-rör som innehåller plasmiden med den odugliga GOI (GOI plasmid) och regleringsvektorn (t.ex. pTet-Off) genom att lägga till 1 μg GOI plasmid och 1 μg regulatorisk vektor per brunn vid RT. För kouttrycksexperiment med RNA-bindande proteiner (RBP) läggs 1 μg av en konstituerande vektor (t.ex. pcDNA3) som uttrycker RPB av intresse till DNA-blandningen (figur 7).
- Aspirera på mediet och skölj försiktigt cellerna med PBS (utan kalcium och magnesium) förvärmd vid 37 °C.
- Tillsätt 5 ml på 0,05 % trypsin som är förvärmt vid 37 °C och inkubera cellerna tills cellerna lossnar (2-4 min). Neutralisera trypsin genom att lägga till 10 ml komplett MEM utan antibiotika.
- Samla cellsuspensionen i ett 50 ml rör, tvätta Petriskålen med 4 ml medium för att samla så många återstående celler som möjligt och centrifugera sedan cellsuspensionen vid 300 x g i 5 min.
- Sug försiktigt upp och kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml PBS. Räkna och beräkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min. Aspirera försiktigt översupernatanten och återsuspendera pelleten i återsuspensionsbufferten vid en koncentration av 4 x 107 celler/ml. Tillsätt cellerna från 1,5 ml röret beredd i steg 2,4 vid en koncentration av 400.000 celler per brunn och försiktigt blanda dem genom pipetting upp och ner.
- Placera röret i elektroporationsanordningen och fyll det med 3,5 ml elektrolytisk buffert.
- Sätt in en guldpläterad elektrodspets i en pipett genom att trycka på kolven helt. Blanda försiktigt innehållet i 1,5 ml röret och försiktigt aspirera cellerna med pipetten. Var noga med att förhindra att luftbubblor kommer in i spetsen, eftersom detta kommer att orsaka elektrisk ljusbågar under elektroporation och leda till minskad transfection effektivitet.
- Sätt i pipetten i elektroporationsstationen tills det finns ett klickande ljud.
- Välj lämpligt elektroporeringsprotokoll för alveolarepitelceller, motsvarande en pulsspänning på 1 450 V och 2 pulser med en bredd på 20 ms, och tryck på Start på pekskärmen.
- Omedelbart efter transfection, ta bort pipetten och överför cellerna till en brunn som tidigare fyllts med komplett MEM utan antibiotika som har förvärmts till 37 °C.
- Upprepa steg 2.11-2.14 för de återstående exemplen.
- Skaka försiktigt plattan för att sprida cellerna jämnt över brunnsytan. Inkubera cellerna vid 37 °C i 5% CO2 i en fuktad inkubator. Efter 2 dagar, byt ut mediet med komplett MEM med antibiotika.
- Bekräfta transfectionens framgång genom att observera uttrycket av eGFP under ett fluorescensmikroskop eller genom flödecytometri med hjälp av en kontrollvektor (figur 1).
OBS: Det här steget är valfritt och kräver ytterligare ett transfectionsteg med hjälp av en annan plasmid som uttrycker eGFP, till exempel pcDNA3-EGFP.
3. Induktion av transkriptionshämningen av DEN GOI
OBS: Cellerna kan förbehandlas med önskade behandlingar före doxycyklininduktion för att bedöma deras inverkan på mRNA-stabiliteten (figur 5).
- Förbered en doxycyklin lagerlösning av 1 mg/ml i avjoniserat vatten. Förvara lagerlösningen vid -20 °C skyddad mot ljus. Doxycyklin, ett tetracyklinderivat, används istället för tetracyklin eftersom den har en längre halveringstid (2x) än tetracyklin. Dessutom krävs en lägre koncentration av doxycyklin för fullständig inaktivering av tet operon23.
OBS: Doxycyklin kan påverka mRNA uttryck av endogena GOI. För att verifiera detta bör effekten av en behandling på 24 timmar med doxycyklin på alveolarceller testas för att bekräfta frånvaron av ändringar i GOI-uttryck (figur 2). - Bered en färsk 1 μg/mL doxycyklinlösning i fullständig posttransfection MEM 72 h och värm den till 37 °C.
- Byt ut mediet med 1 ml komplett MEM som innehåller 1 μg/mL doxycyklin per brunn för att hämma transkriptionen av den kinesiska regeringen.
- Inkubera flera brunnar vid 37 °C i 5% CO2 för olika tidfrån 15 min-6 h för att bedöma mRNA halveringstiden för GOI.
- I slutet av behandlingen tvättar du cellerna med iskalla PBS och lysa dem med ett kommersiellt tillgängligt fenolkloralRNA-extraktionsgenom att lägga till 500 μL buffert per brunn och skaka plattan för att homogenisera cellerna.
- Isolera RNA enligt tillverkarens protokoll. Bestäm RNA-avkastningen och renhet en spektrofotometri vid 230, 260 och 280 nm. RNA-prover med 260:230 och 260:280 nyckeltal på 1,8 respektive 2,0 anses vara rena.
OBS: Protokollet kan pausas här.
4. Fastställande av de kinesiska ursprungs- och
- Behandla 1 μg total RNA med RNAse-free DNAse I (amplifieringsgrad) för att ta bort alla spår av plasmidDNA som kan störa efterföljande DNA-förstärkning.
- I ett 0,2 ml PCR-rör, kombinera 1 μg total RNA, 1 μL 10x DNase I reaktionsbuffert, 1 μL DNAse I (1 U/μL) och RNAse-fritt vatten för att få en total volym på 10 μL.
- Inkubera reaktionen på RT i 20 min.
- Inaktivera DNAse I genom att lägga till 1 μL på 25 mM EDTA till reaktionsblandningen på 10 μL och inkubera reaktionen vid 70 °C i 10 min.
- Omvänd transkribera DNA-utarmat totala RNA till cDNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt cDNA-synteskit med en blandning av oligo(dT) och slumpmässiga hexamerprimers för att förbättra den omvända transkriptionseffektiviteten.
- Tillsätt kortfattat 4 μL 5x reaktionsblandning, 1 μL omvänd transkriptas och 4 μL RNAse-fritt vatten till 11 μL av den DNA-utarmade totala RNA-blandningen för att erhålla en total reaktionsvolym på 20 μL. Blanda reaktionen väl genom att pipetting det upp och ner.
- Inkubera reaktionen i 5 min vid 25 °C, följt av 20 min vid 46 °C, och inaktivera sedan reaktionen genom att inkubera den vid 95 °C i 1 min. Varje reaktion kommer att ge 50 ng/μL cDNA-produkt.
- Späd cDNA-reaktionen på en koncentration på 5 ng/μL genom att tillsätta 180 μL molekylärbiologiskt vatten till 20 μL reaktionsblandningen. Förvara cDNA-produkterna vid -80 °C eller fortsätt omedelbart till att utföra kvantitativa PCR (qPCR i realtid) i realtid.
OBS: Protokollet kan pausas här.
- Design framåt och bakåt qPCR primers specifika för GOI.
- På grund av indiens endogena uttryck i cellerna måste grundfärger na vara konstruerade för att förstärka en 100-150 bp-förstärkning av V5-epitopen kopplad till INDIENS (tabell 1).
- Interna referensgenprimerer måste också användas som normaliseringskontroller. Vanligtvis används hushållningsgener, såsom betaaktin och hypoxantin fosforöverföring1 gener, som referensgener. Dessa kan dock inte användas med detta induktionssystem på grund av variationen av transfectioneffektivitet. I stället bedöms uttrycket av tTA-Ad-avskriften för normalisering, eftersom dess uttryck är konstituerande i celler på grund av cytomegaloviruspromotorns aktivitet. Varje ändring i dess uttryck mätt med qPCR kommer att vara representativ för transfection effektivitet (primers: framåt 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3" och omvänd 5'-AGT GGG TAT GAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) och kommer att möjliggöra normalisering av uttrycket av de transinfekterade klonerna (figur 3).
- Förbered varje qPCR reaktion i treexemplar med hjälp av en SYBR Grön färgämne master mix.
- Späd 5 ng/μL cDNA-blandningen till en koncentration på 1,25 ng/μL med hjälp av molekylärbiologiskt vatten.
- Kombinera 5 μL SYBR Grön färgämnesblandning (2x), 0,1 μL av molekylärbiologiskt vatten, 0,45 μL av 7,5 μM framåtprimer, 0,45 μL på 7,5 μM omvänd primer och 4 μL av 1,25 ng/μL cDNA för att erhålla en total reaktionsvolym på 10 μL. Blanda väl genom att pipetting upp och ner i en 96 brunn PCR-platta. Använd optisk självhäftande film för att säkerställa att plåtskyddet är förseglat och för att förhindra kontaminering och avdunstning.
- Snurra ner reaktionsblandningen kort genom centrifugering och placera plattan i en qPCR termocycleer.
- Förstärka de V5-märkta GOI- och tTA-Ad-ampliconerna med hjälp av följande qPCR-förhållanden: 95 °C för 10 min som ett denatureringssteg, följt av 40 cykler på 95 °C för 10 s, 58 °C för 15 s och 72 °C för 20 s. En högupplösningssmältkurva måste genereras efter att förstärkningscyklerna har utförts för att bedöma de önskade ampliconernas specifika smälttemperaturer och för att säkerställa frånvaron av bulleramplicontoppar.
- Inkludera negativa kontroller för qRT-PCR genom att utföra qPCR med RNA som en mall utan omvänd transkriptas för att fungera som en kontroll för potentiella plasmid DNA-kontaminering och qPCR utan cDNA läggas till qPCR mix för att säkerställa bristen på primer dimers eller Föroreningar.
- Den optimala cDNA-koncentrationen, primereffektiviteten och koncentrationen måste optimeras enligt INDIENS ORGANISATION med en standardkurva. För att göra detta, utför en seriell utspädning med hjälp av cDNA från obehandlade celler (odlade utan doxycyklin). Standardkurvan genereras genom att cq-värdena ritas mot loggen över cDNA-utspädningsfaktorn, och förstärkningseffektiviteten (E) beräknas enligt lutningen på standardkurvan med hjälp av följande formel:
E = 10-1/lutning
OBS: Förstärkningseffektiviteten bör vara cirka 0,9 till 1,05. Annars måste grundfärger göras om.
- Analysera qPCR-data med hjälp av den jämförande Cq-metoden genom att normalisera uttrycksvärdena för DEN GOI-enheten för att erhålla de relativa uttrycksnivåerna för DEN GOI och för att rapportera dess uttryck som en procentandel av GOI:s mRNA-uttryck i celler från samma djur vid startpunkten (t = 0) (figur 4).
- Halveringstiden bestäms från hastighetskonstanten (K) i NEDBRYTNINGskurvan GOI mRNA med hjälp av följande ekvation:
t1/2 = i 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll användes framgångsrikt för att generera en Tet-Off transkriptionally kontrollerade plasmid uttrycksystem för att utvärdera vikten av olika delar av αENaC 3 UTR i modulering av transkriptionsstabilitet i primära alveolar epitelceller.
Det första steget i genomförandet av detta system var att upprätta en snabb, enkel och effektiv transfection teknik för alveolar epitelceller i primärkultur, som är svåra att transfect. Som visas i figur 1,pipettelektroporation teknik tillåtet för en 25-30% transfection effektivitet, vilket framgår av förhållandet mellan eGFP celler detekteras genom fluorescensmikroskopi och flödecytometri.
Innan detta induktionssystem, som styrs av tetracyklin och dess derivat, kontrollerades effekten av detta läkemedel på uttrycket av vår goi. Alveolar epitelceller behandlades med 1,0 μg/mL doxycyklin för att bedöma dess inverkan på endogena αENaC mRNA uttryck. Behandlingar som utförts under en period av 1-24 h hade ingen betydande inverkan på uttrycket av den endogena utskriften, som visas i figur 2.
Vårt transkriptionsstyrt styrda plasmiduttryckssystem använder en qPCR-normaliseringsteknik som skiljer sig från standardtekniken som använder hushållningsgener. När det gäller uttrycket av V5-αENaC normaliserades signalen enligt tTA-Adv-signalen för att bestämma transfectionens effektivitet med cq-metoden. Figur 3 visar användningen av tTA-Adv-avskriften för att normalisera mRNA-uttrycket.
Tidigare publicerade resultat tyder på att användningen av actinomycin D är olämplig för uppskattning av αENaC avskrift stabilitet, eftersom det anges en onormalt hög mRNA halveringstid (ca 12 h)24. Halveringstiden för αENaC mRNA i närvaro av Tet-Off-systemet (99 min) var upp till 7x kortare än den som finns i närvaro av aktinomycin D, som visas i figur 4. Detta bekräftar att actinomycin D leder till en artefaktuell αENaC mRNA stabilisering.
Detta Tet-Off-system användes också framgångsrikt för att testa om olika cellstressorer som är kända för att påverka αENaC genuttryck kunde modulera αENaC mRNA stabilitet. Som visas i figur 5minskade cycloheximide behandling signifikant stabiliteten (36 min) av avskriften, medan lipopolysackarider (LPS, som används för att efterlikna en smittsam stimuli) inte. Slutligen orsakade den proinflammatoriska cytokinen TNF-α en drastisk minskning av V5-αENaC mRNA-stabilitet (med en halveringstid på 16 min).
I detta arbete var syftet med kloningsstrategin att klargöra 3: s UTR:s bidrag till moduleringen av αENaC-avskriften. Flera sekventiella radering mutanter genererades och testades för att kartlägga bidraget från olika domäner i αENaC 3 ' UTR att avskrift stabilitet. Figur 6 visar de betydande förändringarna i moduleringen av v5-αENaC mRNA-stabiliteten beroende på de borttagna och inkluderade regionerna i 3"UTR.
Slutligen studerades moduleringen av stabiliteten hos αENaC mRNA av RNA-bindande proteiner (RBP) med denna modell. Transkriptionen av αENaC mRNA med V5-epitopen från pTRE-Tight vektorn är under exklusiv kontroll av tTA-Adv. Dhx36, Tial1 och hnRNPK är tre RBPs som är kopplade till 3 ' UTR av αENaC24. Därför skulle varje modulering av uttrycket av V5-αENaC efter koedfection med Dhx36, Tial1, eller hnRNPK, vara en följd av moduleringen av mRNA-stabiliteten och inte av transkriptionsmodulering. Figur 7 visar att överuttryck av Dhx36 eller Tial1, till skillnad från hnRNPK, minskade stabiliteten hos V5-αENaC mRNA jämfört med transfection med den tomma pcDNA3 plasmid, som visar den specifika moduleringen av vissa RBPs.
Sammantaget bekräftade dessa resultat att Tet-Off transkriptionsstyrt kontrollerade plasmid uttrycksystem som vi utvecklat utgör ett lämpligt verktyg för att utvärdera den faktiska halveringstiden för en utskrift och de mekanismer som ingår i dess modulering. Detta verktyg kommer att vara användbart för att förvärva nya insikter i posttranscriptional reglering av viktiga GOIs deltar i funktionen av alveolar epitel i fysiologiska och patologiska tillstånd.
Figur 1: Effektiviteten i transfection av alveolar epitelceller i primärkultur genom pipett elektroporation. Primära alveolar epitelceller var transiently transfected med 2 μg av en pcDNA3 plasmid (tom, kloner #1 och #2) som uttryckte eller inte uttrycka GFP protein. Transfection effektivitet bedömdes 48 h efter transfection av(A)fluorescensmikroskopi eller(B)flöde cytometri. Enkelriktad ANOVA och Bonferroni post hoc-test; *p < 0,001 jämfört med tom. Celler från minst fyra olika råttor (n ≥ 4) användes för varje experimentellt tillstånd. Skala bar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Modulering av endogen αENaC mRNA med doxycyklin i alveolarepitelceller. Alveolar epitelceller behandlades med 1,0 μg/mL doxycyklin under en period av 1-24 h. Uttrycket av αENaC mRNA kvantifierades genom kvantitativRT-PCR och presenterades som uttryck för αENaC mRNA ± SEM jämfört med det i obehandlade celler (Ctrl; t = 0) efter normalisering enligt β-aktinuttryck (enkelriktad ANOVA, n = 4). Doxycyklin modulerade inte endogenαENaC mRNA över tiden. Tidigare publicerad som figur S4 i Migneault et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Normalisering av GOI mRNA-uttryck med en modifierad Cq-metod enligt uttrycket av den reglerande mRNA tTA-Ad. Alveolar epitelceller var transiently cotransfected med pTet-Off plasmid och pTRE-Tight plasmid kodning αENaC cDNA med en V5 epitope uppströms av sin öppna läsram och en komplett 3 UTR sekvens. Uttrycket av V5-αENaC och tTA-Ad mRNAs mättes med kvantitativRT-PCR i obehandlade celler. (A)De deltanormaliserade SYBR Green-lysrörssignalerna (ΔRn) av V5-αENaC och tTA-Ad från två separata transfections (R1 och R2) avbildas. (B)Vänster graf: mRNA uttryck för V5-αENaC och tTA-Ad i varje experiment (R1 och R2) uttrycks som cykeln kvantifiering värde (Cq). Skillnaden mellan V5-αENaC och tTA-Ad mRNA uttryck (ΔCq) presenteras. Höger graf: Använda tTA-Ad mRNA i stället för hushållning genen tillåter effektiv normalisering av uttrycket av GOI, som visade ett relativt uttryck för 0,98 i R1 jämfört med den i R2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Nedbrytningskinetik av V5-αENaC mRNA vid användning av transkriptionsstyrt plasmiduttryckssystem i närvaro och avsaknad av aktinomycin D. Primära alveolar epitelceller var transiently cotransfected med pTet-Off plasmid och pTRE-tight plasmid kodning αENaC cDNA med en V5 epitope uppströms av sin öppna läsram och komplett 3 UTR sekvenser. Celler som förbehandlats eller obehandlade med aktinomycin D (5,0 μg/mL) i 30 min inkuberades därefter med doxycyklin (1,0 μg/ml) i 15 min-6 h. Uttryck för V5-αENaC mRNA mättes med kvantitativ RT-PCR och presenteras som procentandelen ± SEM för V5-αENaC mRNA-uttryck i obehandlade celler (t = 0) efter normalisering enligt uttrycket av tTA-Ad. V5-αENaC mRNA halveringstid uppskattades av en fas sönderfallsickelinjär regression för varje cellberedning. Flera regressionsanalyser visade en statistiskt signifikant skillnad i V5-αENaC mRNA-stabilitet i celler som behandlats med actinomycin D jämfört med i obehandlade celler (p < 0,0001). Celler från minst fyra olika råttor (n ≥ 4) användes för varje experimentellt tillstånd. Tidigare publicerad som figur 1 i Migneault et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Modulering av V5-αENaC mRNA-stabilitet genom olika cellulära och inflammatoriska påfrestningar. Primära alveolar epitelceller var transiently cotransfected med pTet-Off plasmid och pTRE-tight plasmid kodning αENaC cDNA med en V5 epitope uppströms av sin öppna läsram och komplett 3 UTR sekvenser. Cellerna förbehandlades i 30 minuter med 1,0 μM cykloheximid (CHX) (A) eller 15 μg/mL LPS (B)eller 5 timmar med 100 ng/mL TNF-α (C), följt av behandling med 1,0 μg/ml doxycyklin under en period av 15-120 min. Uttryck för V5-αENaC mRNA mättes med kvantitativ RT-PCR och presenteras som procentandelen ± SEM för V5-αENaC mRNA-uttryck i obehandlade celler (t = 0) efter normalisering enligt uttrycket av tTA-Ad. Celler från minst tre olika råttor (n ≥ 3) användes för varje experimentellt tillstånd. (D)Halveringstiden (t1/2)av V5-αENaC mRNA i behandlade celler jämfördes med halveringstiden för mRNA i celler (Ctrl). Halveringstiden mättes enligt frekvenskonstanten (K) i V5-αENaC mRNA-nedbrytningskurvan med hjälp av ekvationen t1/2 = i 2/K och uttrycktes sedan som min ± SEM (enkelriktad ANOVA-provning och Bonferroni-post hoc-test; *p < 0,01 vs kontroll; n ≥ 3). Anpassad från figur 36 tidigare publicerad i Migneault, F.25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Användning av den sekventiella kloningsstrategin för att avslöja rollen för olika regioner i αENaC 3' UTR vid modulering av mRNA-stabilitet. (A)Schemakarta över V5-αENaC-avskriften med hela 3' UTR insatt i pTRE-tightuttrycksvektorn. Den öppna läsramen avbildas som en grå låda, medan 3' UTR visas som en vit låda. 3' UTR-delen av αENaC mRNA avbildas för klonen med hela 3' UTR och för de olika raderingmutanterna (Del 1 till Del 4). (B)Primära alveolar epitelceller var transiently cotransfected med pTRE-tight plasmids kodning olika αENaC 3 UTR borttagning mutanter tillsammans med pTet-Off plasmid, som uttrycker tTA-Ad, för att möjliggöra det specifika uttrycket av konstruktionen och dess hämning genom doxycyklin. Sjuttiotvå h efter införlivandet behandlades celler med doxycyklin (1,0 μg/ml) i 15 min till 6 h. Uttryck för V5-αENaC mRNA mättes med kvantitativ RT-PCR och presenterades som procentandelen ± SEM för V5-αENaC mRNA-uttryck i obehandlade celler (t = 0) efter normalisering enligt uttrycket av tTA-Ad. V5-αENaC mRNA halveringstid för varje konstruktion uppskattades från hastighetskonstanten (K) i V5-αENaC mRNA-nedbrytningskurvan med följande ekvation: t1/2 = ln 2/K. V5-αENaC mRNA-förfallet visas för klonen med hela 3' UTR (Comp) och för utmärningarna av Del 1 till Del 4 3. Halveringstiden (t1/2)av mRNA-förfall ges för varje klon. I den nedre högra kvadranten visar diagrammet en jämförelse av de olika t1/2 ± SEM-värden som uppskattas för varje klon. p < 0,05 mellan de olika grupperna enligt Kruskal-Wallis-testet. *p < 0,05 enligt Dunns post hoc-test jämfört med hela 3' UTR. Φp < 0,05 enligt Dunns post hoc-test jämfört med Del 3. Celler från minst fem olika djur (n ≥ 5) användes för varje försökstillstånd. Anpassad från figurerna 2 och 3 som tidigare publicerats i Migneault et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Posttranscriptional modulering av V5-αENaC mRNA av RNA-bindande proteiner hnRNPK, Dhx36 och Tial1. (A)Primära alveolarepitelceller var cotransfected med pTRE-tight plasmid kodning V5-αENaC mRNA tillsammans med ett uttryck vektor för Dhx36, hnRNPK, eller Tial1 RBPs och pTet-Off plasmid. V5-αENaC mRNA uttryck kvantifierades av RT-qPCR 72 h posttransfection och uttryckt som procentandelen ± SEM av V5-αENaC mRNA uttryck jämfört med den i celler som transfecteds med en tom vektor (pcDNA3) efter normalisering enligt uttrycket tTA-Ad. Överuttryck av Dhx36 och Tial1 hämmade signifikant V5-αENaC mRNA uttryck, medan överuttryck av hnRNPK hade ingen effekt. *p < 0,05 enligt Kruskal-Wallis-testet och Dunns posthoc-test jämfört med tom vektor; n ≥ 3 prover från olika djur testades i två exemplar för varje försökstillstånd. (B)Den proximala delen av αENaC 3' UTR ströks genom kloning av den distala regionen 3' UTR bredvid αENaC-stoppkodonen i pTRE-tightplasmid (V5-αENaC-Del5). (C)Primära alveolar epitelceller var cotransfected med V5-αENaC eller V5-αENaC-Del5 i pTRE-tight vektor tillsammans med pTet-Off plasmid och uttryckvektor för Dhx36 eller Tial1 RBP överuttryck. V5-αENaC mRNA uttryck kvantifierades av RT-qPCR 72 h posttransfection och uttryckt som procentandelen ± SEM av V5-αENaC mRNA uttryck jämfört med det i celler som transfecteds med en tom vektor (pcDNA3) efter normalisering enligt uttrycket av tTA-Ad. Överuttryck av Dhx36 och Tial1 hade ingen effekt på V5-αENaC-Del5 mRNA uttryck. *p < 0,05 enligt Kruskal-Wallis-testet och Dunns posthoc-tester vid jämförelse av de experimentella vektorerna till den tomma vektorn; #p < 0,05 enligt Mann-Whitney U-test vid jämförelse av de experimentella vektorerna till den kompletta 3" UTR mutant; n ≥ 6 för varje experimentellt tillstånd. Anpassad från figurerna 5 och 7 som tidigare publicerats i Migneault et al.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| A | |||
| Mall | 3' UTR | Känsla | Sekvens |
| αENaC cDNA | Komplett | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 (del 2) | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTTGGG-3" |
|
| Del 3 (del 3) | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3" |
|
| Del 4 (del 4) | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 (del 5) | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3" |
||
| B | |||
| Mål | Känsla | Sekvens | |
| V5-αENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3' | ||
Tabell 1: Primers som används i denna studie. (A)Primers som används för kloning och generering av V5-αENaC-mutanterna i den inducerbara pTRE-snäva vektorn. (B)Primers som används för mätning av mRNA-uttryck av kvantitativRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den låga transfection graden av alveolar epitelceller i primärkulturen har varit en allvarlig begränsning för användningen av Tet-Off-systemet för att bedöma mRNA stabilitet i dessa celler. Denna begränsning övervanns dock genom pipettelektroporation, vilket möjliggör en transfectioneffektivitet på 25-30 %(figur 1 och figur 3)26.
Mätningen av transkriptionsstabilitet är grundläggande för att förstå moduleringen av en viss mRNA och dess inverkan på cellhomeostas och metabolism. Variation i biotillgängligheten för en icke-statlig organisation kan ändra översättningseffektiviteten och ha en direkt inverkan på uttrycket av de kinesiska direktierna i cellen. Av dessa skäl har flera tekniker utvecklats för att bestämma halveringstiden för mRNAs. Som diskuterats ovan, var och en av dessa tekniker har begränsningar och begränsningar som förhindrar korrekt studie av en utskrift av intresse. Jämfört med andra tekniker har TET-off-modellen som utvecklats här fördelen av att tillåta halveringstid uppskattning av en viss mRNA under något experimentellt tillstånd. Det tillåter oss dock inte att direkt studera stabiliteten i en endogen utskrift. För att övervinna denna begränsning så mycket som möjligt föreslås att inkludera 5 UTR och 3 UTR-sekvenser av avskriften i plasmiden så att konstruktionen är så lik som möjligt för de endogena avskrifterna. Tillägget av V5 epitope tillåter den specifika förstärkning av målet mRNA av RT-qPCR jämfört med den endogena avskriften. När det gäller kloningsstrategin är valet av sekvensen inströms genen av intresse avgörande för att förhindra förstärkning av ospecifika signaler. Tillägget av V5 epitope sekvens 5 ' av ORF är nödvändigt för den specifika qPCR förstärkning av konstruktionen på grund av dess korta längd och bristen på dess uttryck i alveolar epitelceller. Denna strategi ger också möjlighet att studera moduleringen av proteinöversättning med samma inducerbara system. Trots den lilla storleken på V5 epitope (42 nt), är det fortfarande möjligt att detta kan påverka stabiliteten i transkription. Av denna anledning föreslås det att även testa andra epitoper, såsom influensahemagglutinin (HA) eller någon annan sekvens som inte finns i transkriptomen av alveolar epitelceller.
En begränsning av systemet är användningen av doxycyklin för att hämma transkriptionen av en GOI. Flera rapporter visar att doxycyklin kan ha en betydande inverkan på cellmetabolismen. Användningen av detta antibiotikum i 16HBE14 bronkialceller minskar spridningen och ökar dödligheten på grund av apoptos27. Dessutom har doxycyklin redan visat sig vara involverade i moduleringen av LPS inflammatoriska svar28. Därför kan detta antibiotikum ha off-target effekter som kan påverka mRNA stabiliteten hos en viss GOI. Av dessa skäl bedömde vi effekten av 1 μg/mL doxycyklin under en 24 h-period på icke transinfekterade celler och fann att det inte orsakade någon förändring av endogena αENaC mRNA uttryck(figur 2). Denna koncentration valdes eftersom den ofta används för att helt hämma transkriptionen av Tet-Off-systemet och rekommenderas för att minimera cytotoxiska effekter29. Vi föreslår att du använder denna koncentration i alveolar epitelceller och rekommenderar att validera den optimala koncentrationen för studier av andra gener eller användning av andra celltyper med Tet-Off-systemet.
Vårt system använder det konstituerande uttrycket av GOI tills dess transkription hämmas av doxycyklin. Det har föreslagits att överdriven mRNA koncentrationer kan vara giftiga för cellen och påverka dess ämnesomsättning. Detta kan leda till en förändring i stabiliteten i den kinesiska myndigheten utskrift, orsakar dess snabba nedbrytning på grund av nonphysiological överuttryck30. När det gäller vår Tet-Off-modell observerades inte sådan toxicitet, eftersom de transinfekterade cellerna visade en morfologi liknande dem hos friska icke transinfekterade celler (data visas inte). I enlighet med Tani et al.31, som visade giltigheten av Tet-Off-systemet vid fastställandet av halveringstiden för en mRNA, visade våra resultat att Tet-Off-systemet inte är giftigt i alveolar epitelceller och ger en halveringstid för αENaC mRNA som inte återspeglar den överstabilisering som rapporterades i närvaro av transkriptionshämmare såsom actyycinom in(figur 4).
Utvecklingen av detta system för att mäta halveringstiden för mRNA utmanar de resultat som observerats när stabiliteten i utskrifter mättes i närvaro av transkriptionshämmare såsom actinomycin D. Denna metod visar att en utskrift halveringstid kan vara mycket kortare än tidigare mätt.
Vår modell är mycket lämplig för att studera posttranscriptional modulering av en specifik avskrift under olika förhållanden, inklusive proinflammatoriska tillstånd eller RBP överuttryck, samt efter behandling med tysta RNA. Dessutom tillåter det karakterisering av oöversatta regioner som är viktiga för posttranscriptional modulering av mRNAs i patofysiologiska förhållanden som påverkar alveolar epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Francis Migneault stöddes av ett stipendium från Quebec Respiratory Health Network och Canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungutbildningsprogram, ett studentskap från FRSQ och ett studentskap från Faculté des Études Supérieures et Postdoktorer, Université de Montréal. Detta arbete stöddes av Gosselin-Lamarre ordförande i klinisk forskning och den kanadensiska Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
