Summary
Her presenterer vi et verktøy som kan brukes til å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon i primære alveolære epitelceller ved hjelp av et utilbørlig uttrykkssystem koblet til en pipetteelektroporasjonsteknikk.
Abstract
Å studere posttranskripsjonsregulering er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gitt budbringer RNA (mRNA) og dens innvirkning på cellehomeostase og metabolisme. Faktisk kan svingninger i transkripsjonsuttrykk endre oversettelseseffektiviteten og til slutt den cellulære aktiviteten til en transkripsjon. Flere eksperimentelle tilnærminger er utviklet for å undersøke halveringstiden til mRNA, selv om noen av disse metodene har begrensninger som forhindrer riktig studie av posttranskripsjonsmodulasjon. Et promotorinduksjonssystem kan uttrykke et gen av interesse under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert promotor. Denne metoden tillater halveringstidestimering av en gitt mRNA under enhver eksperimentell tilstand uten forstyrrende celle homeostase. En stor ulempe med denne metoden er nødvendigheten av transfect celler, som begrenser bruken av denne teknikken i isolerte primære celler som er svært motstandsdyktigmot konvensjonelle transfection teknikker. Alveolære epitelceller i primærkulturen har blitt brukt mye for å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. De unike egenskapene og fenotypen til primære alveolære celler gjør det viktig å studere posttranskripsjonsmodulasjonene av gener av interesse i disse cellene. Derfor var vårt mål å utvikle et nytt verktøy for å undersøke posttranskripsjonsmodulasjonene til mRNAs av interesse for alveoriske epitelceller i primærkulturen. Vi designet en rask og effektiv forbigående transfection protokoll for å sette inn et transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem i primære alveolære epitelceller. Denne kloningstrategi, ved hjelp av en viral epitope for å tagge konstruksjonen, gjør det mulig for enkel diskriminering av konstruere uttrykk fra endogene mRNAs. Ved hjelp av en modifisert ΔΔ quantification syklus (Cq) metode, kan uttrykket av transkripsjonen deretter kvantifiseres med forskjellige tidsintervaller for å måle halveringstiden. Våre data viser effektiviteten av denne nye tilnærmingen i å studere posttranskripsjonsregulering i ulike patofysiologiske forhold i primære alveolære epitelceller.
Introduction
Flere teknikker er utviklet for å bestemme halveringstiden til mRNAs. Pulsjagende forfallsteknikk, som benytter merkede mRNAer, gjør det mulig å samtidig evaluering av et stort basseng av mRNAer med minimal cellulær forstyrrelse. Denne tilnærmingen tillater imidlertid ikke en direkte estimering av halveringstiden til en enkelt gentranskripsjon og kan ikke implementeres for å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en mRNA etter stimulering med vekstfaktorer, ROS, alarmer eller betennelse1.
Bruk av transkripsjonshemmere, som actinomycin D og α-amanitin, er en relativt enkel metode for måling av mRNA nedbrytningskinetikk over tid. En stor fordel med denne tilnærmingen over tidligere teknikker, (dvs. pulsjakt) er avhengig av evnen til å direkte estimere halveringstiden til en gitt transkripsjon og sammenligne hvordan ulike behandlinger kan påvirke nedbrytningskinetikken. Den betydelige skadelige virkningen av transkripsjonshemmere på cellefysiologi representerer imidlertid en stor ulempe for tilnærmingen2. Faktisk har hemmingen av hele celletranskripsjonen med disse stoffene den negative bivirkningen av å perturbing syntesen av viktige elementer involvert i mRNA stabilitet, som microRNAs (miRNAs), samt uttrykk og syntese av RNA-bindende proteiner, som er viktige for mRNA nedbrytning og stabilitet. Den alvorlige perturbasjonen av gentranskripsjon av disse legemidlene kan derfor artefactually endre nedbrytningskurvene av transkripsjoner.
Arrangørens induksjonssystem representerer en tredje tilnærming for å måle halveringstiden til en bestemt mRNA. Denne metoden måler nedbrytningen av en bestemt mRNA på samme måte som metoder som bruker transkripsjonshemmere. To typer induksjonssystemer brukes ofte: serumindusert c-fos-promotor3 og Tet-Off induserbart system4. Med c-fos-systemet er bruk av transkripsjonshemmere som kan være giftige for cellen ikke nødvendig. Denne metoden krever imidlertid synkronisering av cellesyklus, som forhindrer evaluering av den faktiske stabiliteten til en transkripsjon under interfase5. I motsetning tillater Tet-Off-systemet det sterke uttrykket av genet av interesse (GOI) under kontroll av en syntetisk tetracyklinregulert arrangør. Dette systemet krever tilstedeværelse av to elementer som må være cotransfected inn i cellen for å være funksjonell. Den første plasmid (pTet-Off) uttrykker det regulatoriske proteinet tTA-Adv, en hybrid syntetisk transkripsjonsfaktor som består av den prokaryotiske undertrykkeren TetR (fra Escherichia coli) smeltet til tre transkripsjonstransaktiveringsdomener fra det virale proteinet HSV VP16. GOI er klonet inn i pTRE-Tight plasmid under kontroll av en syntetisk promotor (PTight),bestående av den minimale sekvensen av cytomegalovirus (CMV) arrangør smeltet til syv gjentakelser av tetO operatør sekvens. Transkripsjonen av genet nedstrøms av PTight er avhengig av samspillet mellom TetR med tetO. I nærvær av tetracyklin eller dets derivat, doxycyklin, mister TetR-undertrykkeren sin affinitet for tetO-operatøren, noe som fører til en opphør av transkripsjon4. Egenskapene til Tet-Off-systemet gjør det til en ideell modell for studiet av spesifikke mRNA-uttrykk i eukaryyotiske celler samtidig som det unngår potensielle pleiotropiske effekter som er sekundære til fraværet av prokaryotiske regulatoriske sekvenser i eukaryotisk celle6. Vanligvis brukes dobbelt stabile Tet-Off cellelinjer (HEK 293, HeLa og PC12) med dette systemet til å integrere kopier av regulatoren og responsplasmider for praktisk tilgang til kontrollerbart genuttrykk7,8,9.
Flere modeller av alveolære epitelceller i kulturen har blitt brukt til å studere alveolær- og molekylærbiologien til alveolærepitelet. I årevis har forskere i stor grad utnyttet menneskelige eller gnagerprimære celler10,11 samt udødelige cellelinjer som menneskelig A549 eller rotte RLE-6TN celler12,13. Selv om de generelt er mindre proliferative og vanskeligere å kultur og transfect, alveolære epitelceller i primærkulturen forblir gullstandarden for studiet av funksjonen og dysfunksjonen av alveolær epitel i fysiologiske og patologiske forhold. Faktisk viser udødeliggjortcellelinjer som A549-celler ikke de komplekse egenskapene og fenotypene til primærceller, mens alveorene epitelceller i primærkultur rekapitulerer hovedegenskapene til alveolærepitelet, spesielt evnen til å danne en polarisert og stram barriere14,15. Dessverre er disse cellene svært motstandsdyktige mot konvensjonelle transfection teknikker, for eksempel de som bruker liposomer, noe som gjør bruk av et promotor-indusert system som Tet-Off svært vanskelig.
Den posttranskripsjonelle moduleringen av mRNAs er en av de mest effektive metodene for raskt å modulere genuttrykket til en transkripsjon16. MRNA 3' uoversatte region (3' UTR) spiller en viktig rolle i denne mekanismen. Det har vist seg at det, i motsetning til 5' UTR, er en eksponentiell sammenheng mellom lengden på 3' UTR og de cellulære og morfologiske kompleksitetene til en organisme. Denne korrelasjonen antyder at 3' UTR, som mRNA-kodeområdene, har blitt utsatt for naturlig utvalg for å tillate stadig mer kompleks posttranskripsjonsmodulasjon gjennom evolusjon17. 3' UTR inneholder flere bindende steder for proteiner og miRNAer som påvirker stabiliteten og oversettelsen av transkripsjonen.
I det nåværende arbeidet utviklet vi et verktøy for å undersøke rollen som svært bevarte domener i 3' UTR av en GOI for kontroll av transkripsjonsstabilitet. Vi fokuserte på epitelnatriumkanalen, alfa-underenheten (αENaC), som spiller en nøkkelrolle i alveolær epitelfysiologi18. Alveolære epitelceller i primærkulturen ble vellykket transiently transfected med de to komponentene i Tet-Off-systemet, noe som gjør det mulig for studiet av rollen til 3 ' UTR i mRNA stabilitet med et system som minimalt påvirker cellefysiologi og metabolisme i forhold til bruk av transkripsjonshemmere med andre protokoller. En kloningstrategi ble utviklet for å skille uttrykket av GOI fra det endogene genet ved hjelp av en nonendogenously uttrykt epitop (V5). Responsen og regulatoriske plasmider ble deretter overført til alveolære epitelceller ved hjelp av en pipetteelektroporasjonsteknikk. Deretter ble uttrykket av transkripsjonen målt ved å inkubere cellene med doxycyklin med forskjellige tidsintervaller. Halveringstiden av transkripsjonen ble evaluert av RT-qPCR med en modifisert Cq-metode ved hjelp av det transinfiserte tTA-Ad mRNA-produktet for normalisering. Gjennom vår protokoll tilbyr vi en praktisk måte å studere posttranskripsjonsmoduleringen av en transkripsjon under forskjellige forhold og definere involveringav de uoversatte regionene mer detaljert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fra Canadian Council on Animal Care og ble godkjent av Institutional Animal Care Committee of the Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Design og generering av responsen plasmid uttrykker genet av interesse (GOI)
- Bruk en indusibel tetracyklin-off vektor, for eksempel pTRE-Tight.
- Analyser sekvensen av GOI og flere kloning området (MCS) av vektoren for å identifisere begrensning nettsteder i MCS som ikke er til stede internt i GOI.
- Isolere primære alveolære epitelceller fra mannlige Sprague-Dawley rotte lunger som beskrevet tidligere19,20.
- Rense den totale RNA fra alveolær epitelceller ved RNA-ekstraksjon ved hjelp av en standardmetode, for eksempel fenol/kloroformekstraksjon eller bruk av silikabaserte RNA-spinnkolonner.
- Omvendt transkribere mRNA til komplementære DNA (cDNA) ved hjelp av oligo (dT) og high-fidelity revers transcriptase.
- Bruk high-fidelity Taq polymerase og standard overlappende PCR teknikker for å flankere GOI med to valgte begrensning enzym gjenkjenning nettsteder ved hjelp av designet primere.
- Har den fremre primeren inneholder et Kozak konsensus ribosom bindende sted21 for å forbedre uttrykksnivået for å studere proteinuttrykk parallelt med mRNA stabilitet. En sekvens som koder V5 epitop oppstrøms oppstrøms av GOI må inkluderes for å skille uttrykket av transfected GOI fra endogene uttrykk (Tabell 1).
- Har omvendt primer inneholder et polyadenylasjonssignal etter stoppkodonen.
- Mutanter kan genereres ved sekvensiell sletting for å studere effekten av forskjellige 3' UTR-regioner på stabiliteten til mRNA av GOI ved hjelp av omvendtprimerer som koder et polyadenyleringssted som gradvis sletter 3' slutten av GOI 3' UTR (Figur 6). Alternativt kan PCR-rettet mutagenese brukes til å målrette mot en bestemt interesseregion i 3' UTR22.
- Fordøye den utilbørlige vektoren og innsatsen med de tidligere valgte begrensningsenzymene ved riktig inkubasjonstemperatur i 1 h, etterfulgt av behandling med fosfatase under vektorreaksjonen i 30 min for å unngå selvligasjon.
- Skill den fordøyde vektoren og sett inn segmenter av elektroforese i en 1-1,5% agarose gel (konsentrasjon avhengig av størrelsen på innsatsen).
- Ved hjelp av et blad og et UV-lys samler du DNA-fragmentene som inneholder ønsket innsats og vektor som skal ligated.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Rense de oppsamlede segmentene fra agarosegelen ved hjelp av et silikabasert PCR-rensesett og mål konsentrasjonen ved spektrotometri ved 260 nm.
- Ligate GOI og den udukbare vektoren med T4 DNA ligase ved hjelp av en vektor:sett inn molar ratio på 1:3 for å øke sannsynligheten for ligation. Inkuber reaksjonen ved romtemperatur (RT) i 3 timer.
- Forvandle ligation reaksjonen til kompetent E. coli (DH5α).
- Tilsett 1-10 ng av vektor og gen i et rør som inneholder 100 μL kompetente celler. Inkuber cellene på is i 30 min og deretter varmesjokkceller ved 42 °C i 45 s. Plasser røret på is i 2 min og tilsett 900 μL RT LB medium. Inkuber cellene i 1 time ved 37 °C ved risting ved 225 o/min.
- Spre 100 μL av reaksjonen på en LB agar plate med et egnet antibiotika (f.eks 100 μg / ml ampicillin for pTRE-Tight vektor) for å velge de transformerte bakteriene. Inkuber platen over natten ved 37 °C.
- Velg individuelle kolonier ved hjelp av en inokulasjonssløyfe eller en 20 μL-spiss og inkuber over natten i 5 ml LB-medium som inneholder egnet antibiotika ved 37 °C med risting. De transformerte bakteriene kan lagres i glyserolbestander ved -80 °C med et forhold på 400:600 lb medium til glyserol.
- Trekk ut plasmid DNA ved hjelp av silikabaserte plasmid kolonner og måle konsentrasjonen ved spektrotometri på 260 nm. Bekreft innsettingen av GOI ved å restriksjonsanalyse og dens orientering og fravær av mutasjoner som potensielt kan introduseres under RT-PCR ved sekvensering.
2. Overføring av responsplasmid som uttrykker genet av interesse (GOI) til primære alveolære epitelceller
- Isoler type II alveor epitelceller fra rottelunger.
- Frø cellene med en tetthet på 1 x 106 celler / cm2 i 100 mm Petri retter med komplett minimum viktig medium (komplett MEM). Komplett MEM er MEM supplert med 10% FBS, 0,08 mg / L tobramycin, Septra (3 μg / ml trimethoprim og 17 μg / ml sulfamethoxazole), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) og 2 mM L-glutamin. Kultur cellene i 24 timer ved 37 °C i 5% CO2 i en fuktet inkubator.
- På neste dag, plasser 500 μL av komplett MEM uten antibiotika i hver brønn av en ny 12 brønnplate og forvarm platen ved 37 °C i 30 min. I løpet av dette trinnet er det viktig å bruke fosterets storfeserum uten forurensende tetracykliner eller med et nivå for lavt til å forstyrre indusibiliteten.
- Forbered 1,5 ml rør som inneholder plasmid med den utilbørlige GOI (GOI plasmid) og den regulatoriske vektoren (f.eks. pTet-Off) ved å legge til 1 μg GOI plasmid og 1 μg regulatorisk vektor per brønn ved RT. For kouttrykkseksperimenter med RNA-bindende proteiner (RBP) tilsettes 1 μg av en konstitutiv vektor (f.eks. pcDNA3) som uttrykker RPB av interesse til DNA-blandingen (figur 7).
- Aspirer mediet og skyll cellene forsiktig med PBS (uten kalsium og magnesium) førvarmet ved 37 °C.
- Tilsett 5 ml 0,05% trypsin forvarmet ved 37 °C og inkuber cellene til cellene er løsrevet (2-4 min). Nøytraliser trypsin ved å legge til 10 ml komplett MEM uten antibiotika.
- Samle cellesuspensjonen i et 50 ml rør, vask petriskålen med 4 ml medium for å samle så mange gjenværende celler som mulig, og sentrifuger deretter cellesuspensjonen på 300 x g i 5 min.
- Slå forsiktig av og kast supernatanten og resuspendpelleten i 1 ml PBS. Telle og beregne antall celler ved hjelp av et hemocytometer.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min. Forsiktig aspirere supernatant og resuspend pellet i resuspensjon buffer i en konsentrasjon på 4 x 107 celler / ml. Tilsett cellene fra 1,5 ml røret utarbeidet i trinn 2.4 i en konsentrasjon på 400.000 celler per brønn og bland dem forsiktig ved å pipetting opp og ned.
- Plasser røret i elektroporasjonsenheten og fyll det med 3,5 ml elektrolytisk buffer.
- Sett en gullbelagt elektrodespiss inn i en pipette ved å trykke helt på stempelet. Bland forsiktig innholdet i 1,5 ml røret og forsiktig aspirere cellene med pipetten. Vær forsiktig med å forhindre at luftbobler kommer inn i spissen, da dette vil føre til elektrisk buering under elektroporasjon og føre til redusert transfection effektivitet.
- Sett pipetten inn i elektroporasjonsstasjonen til det er en klikkelyd.
- Velg riktig elektroporasjonsprotokoll for alveolære epitelceller, tilsvarende en pulsspenning på 1450 V og 2 pulser med en bredde på 20 ms, og trykk start på berøringsskjermen.
- Umiddelbart etter transfection, fjern pipette og overføre cellene til en brønn tidligere fylt med komplett MEM uten antibiotika som har blitt førvarer til 37 °C.
- Gjenta trinn 2.11-2.14 for de gjenværende prøvene.
- Rist forsiktig platen for å spre cellene jevnt over brønnoverflaten. Inkuber cellene ved 37 °C i 5 % CO2 i en fuktet inkubator. Etter 2 dager, erstatt mediet med komplett MEM med antibiotika.
- Bekreft suksessen til transfection ved å observere uttrykket av eGFP under et fluorescensmikroskop eller ved å strømme cytometri ved hjelp av en kontrollvektor (Figur 1).
MERK: Dette trinnet er valgfritt og krever et ekstra transfection trinn ved hjelp av en annen plasmid uttrykke eGFP, for eksempel pcDNA3-EGFP.
3. Induksjon av transkripsjonshemmingen av GOI
MERK: Cellene kan forhåndsbehandles med de ønskede behandlingene før doxycyklininduksjon for å vurdere deres innvirkning på mRNA-stabilitet (figur 5).
- Forbered en doxycyklinlageroppløsning på 1 mg/ml i deionisert vann. Oppbevar lageroppløsningen ved -20 °C beskyttet mot lys. Doxycycline, en tetracyklin derivat, brukes i stedet for tetracyklin fordi den har en lengre halveringstid (2x) enn tetracyklin. Videre er det nødvendig med en lavere konsentrasjon av doxycyklin for fullstendig inaktivering av tet operon23.
MERK: Doxycyklin kan påvirke mRNA-uttrykket til den endogene GOI. For å bekrefte dette bør effekten av en 24 h behandling med doxycyklin på alveolære celler testes for å bekrefte fraværet av endringer i GOI-uttrykk (figur 2). - Forbered en frisk 1 μg/ml doxycyklinoppløsning i fullstendig MEM 72 h posttransfection og varm den til 37 °C.
- Erstatt mediet med 1 ml komplett MEM som inneholder 1 μg/ml doxycyklin per brønn for å hemme transkripsjonen av GOI.
- Inkuber flere brønner ved 37 °C i 5 % CO2 for ulike mengder tid fra 15 min-6 h for å vurdere mRNA-halveringstiden til GOI.
- På slutten av behandlingen, vask cellene med iskald PBS og lyse dem med et kommersielt tilgjengelig fenol-kloroform RNA ekstraksjonssett ved å legge til 500 μL buffer per brønn og ristplaten for å homogenisere cellene.
- Isoler RNA i henhold til produsentens protokoll. Bestem RNA-utbyttet og renheten ved spektrotometri ved 230, 260 og 280 nm. RNA-prøver med 260:230 og 260:280-forhold på henholdsvis 1,8 og 2,0 anses som rene.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
4. Bestemme mRNA-stabiliteten til GOI
- Behandle 1 μg av total RNA med RNAse-fri DNAse I (forsterkningsgrad) for å fjerne eventuelle spor av plasmid DNA som kan forstyrre etterfølgende DNA-forsterkning.
- I et 0,2 ml PCR-rør, kombiner 1 μg totalt RNA, 1 μL av 10x DNase I reaksjonsbuffer, 1 μL DNAse I (1 U/μL) og RNAse-fritt vann for å oppnå et totalt volum på 10 μL.
- Inkuber reaksjonen ved RT i 20 min.
- Deaktiver DNAse I ved å tilsette 1 μL av 25 mM EDTA til 10 μL reaksjonsblanding og inkuber reaksjonen ved 70 °C i 10 min.
- Omvendt transkriberet den DNA-utarme de DNA-utarmet totale RNA i cDNA ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig cDNA-syntesesett med en blanding av oligo(dT) og tilfeldige hexamer primere for å forbedre omvendt transkripsjonseffektivitet.
- Legg kort til 4 μL med 5x reaksjonsblanding, 1 μL reverstranskripsjonsase og 4 μL RNAse-fritt vann til 11 μL av den DNA-utarme totale RNA-blandingen for å oppnå et totalt reaksjonsvolum på 20 μL. Bland reaksjonen godt ved å pipe den opp og ned.
- Inkuber reaksjonen i 5 min ved 25 °C, etterfulgt av 20 min ved 46 °C, og inaktiver deretter reaksjonen ved å inkubere den ved 95 °C i 1 min. Hver reaksjon vil gi 50 ng/μL av cDNA-produktet.
- Fortynn cDNA-reaksjonen til en konsentrasjon på 5 ng/μL ved å tilsette 180 μL molekylærbiologivann til 20 μL reaksjonsblanding. Oppbevar cDNA-produktene ved -80 °C eller fortsett umiddelbart til å utføre kvantitativ PCR i sanntid (qPCR).
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
- Design forover og bakover qPCR primere som er spesifikke for GOI.
- På grunn av det endogene uttrykket av GOI i cellene, må primere utformes for å forsterke en 100-150 bp amplicon av V5 epitopkoblet til GOI (Tabell 1).
- Interne referansegenprimere må også brukes som normaliseringskontroller. Vanligvis brukes rengjøringsgener, som beta-actin og hypoksaninfosforibosyltransferase 1 gener, som referansegener. Disse kan imidlertid ikke brukes med dette induksjonssystemet på grunn av variasjonen av transfection-effektiviteten. I stedet vurderes uttrykket for tTA-Ad-transkripsjonen med henblikk på normalisering, fordi uttrykket er konstitutivt i celler på grunn av aktiviteten til cytomegalovirusarrangøren. Enhver variasjon i uttrykket målt ved qPCR vil være representativ for transfection effektivitet (primere: fremover 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3 ' og reversere 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) og vil tillate normalisering av uttrykket av transfected kloner (Figur 3).
- Forbered hver qPCR reaksjon i triplicate ved hjelp av en SYBR Green dye master mix.
- Fortynn 5 ng/μL cDNA-blandingen til en konsentrasjon på 1,25 ng/μL ved bruk av molekylærbiologigrad.
- Kombiner 5 μL SYBR Grønn dye master mix (2x), 0,1 μL molekylærbiologi-grade vann, 0,45 μL av 7,5 μM fremover primer, 0,45 μL av 7,5 μM omvendt primer, og 4 μL av 1,25 ng / μL cDNA for å oppnå et totalt reaksjonsvolum på 10 μL. Bland godt ved pipettering opp og ned i en 96 brønn PCR. Bruk optisk klebende film for å sikre at platedekselet er forseglet og for å forhindre kontaminering og fordampning.
- Sentrifuger og legg platen i en qPCR termocycler.
- Forsterke v5-merket GOI og tTA-ad amplicons ved hjelp av følgende qPCR forhold: 95 °C i 10 min som en avnaturering trinn, etterfulgt av 40 sykluser av 95 °C for 10 s, 58 °C for 15 s, og 72 °C for 20 s. En smeltekurve med høy oppløsning må genereres etter at forsterkningssyklusene utføres for å vurdere de spesifikke smeltetemperaturene til de ønskede ampleicons og for å sikre fravær av støyamplicontopper.
- Inkluder negative kontroller for qRT-PCR ved å utføre qPCR med RNA som en mal uten omvendt transkripsjonase for å tjene som en kontroll for potensiell plasmid DNA-kontaminering og qPCR uten cDNA lagt til qPCR-blandingen for å sikre mangel på primerdimmere eller Forurensninger.
- Den optimale cDNA-konsentrasjonen, primereffektiviteten og konsentrasjonen må optimaliseres i henhold til GOI med en standard kurveanalyse. For å gjøre dette, utfør en seriell fortynning ved hjelp av cDNA fra ubehandlede celler (dyrket uten doxycyklin). Standardkurven genereres ved å plotte Cq-verdiene mot loggen av cDNA-fortynningsfaktoren, og forsterkningseffektiviteten (E) beregnes i henhold til skråningen av standardkurven ved hjelp av følgende formel:
E = 10-1/helling
MERK: Forsterkningseffektiviteten bør være ca. 0,9 til 1,05. Ellers må primere redesignet.
- Analyser qPCR-dataene ved hjelp av komparativ Cq-metoden ved å normalisere uttrykksverdiene til GOI til uttrykket av tTA-Ad for å få de relative uttrykksnivåene til GOI og rapportere uttrykket som en prosentandel av mRNA-uttrykket til GOI i celler fra samme dyr ved utgangspunktet (t = 0) (Figur 4).
- Halveringstiden bestemmes fra hastighetskonstanten (K) for GOI mRNA-nedbrytningskurven ved hjelp av følgende ligning:
t1/2 = ln 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble vellykket brukt til å generere et Tet-Off transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for å evaluere betydningen av ulike deler av αENaC 3 ' UTR i modulering av transkripsjonstabilitet i primære alveolære epitelceller.
Det første trinnet i gjennomføringen av dette systemet var å etablere en rask, enkel og effektiv transfection teknikk for alveolære epitelceller i primærkulturen, som er vanskelig å transfect. Som vist i figur 1, tillot pipetteelektroporasjonsteknikken en 25-30% transfection effektivitetshastighet, som vist av forholdet mellom eGFP-celler oppdaget ved fluorescensmikroskopi og flow cytometri.
Før du bruker dette induksjonssystemet, som styres av tetracyklin og dets derivater, ble virkningen av dette stoffet på uttrykket av vår GOI verifisert. Alveolære epitelceller ble behandlet med 1,0 μg/ml doxycyklin for å vurdere dens innvirkning på endogene αENaC mRNA-uttrykk. Behandlinger utført over en periode på 1-24 h hadde ingen signifikant innvirkning på uttrykket av den endogene transkripsjonen, som vist i figur 2.
Vårt transkripsjonsstyrte plasmid uttrykkssystem bruker en qPCR normaliseringsteknikk som avviker fra standardteknikken som bruker rengjøringsgener. I tilfelle av uttrykket av V5-αENaC, ble signalet normalisert i henhold til tTA-Adv-signalet for å bestemme effektiviteten av transfection ved hjelp av Cq-metoden. Figur 3 viser bruken av tTA-Adv-transkripsjonen for å normalisere mRNA-uttrykket.
Tidligere publiserte resultater tyder på at bruk av actinomycin D er upassende for estimering av αENaC transkripsjon stabilitet, da det indikerte en unormalt høy mRNA halveringstid (ca. 12 h)24. Halveringstiden til αENaC mRNA i nærvær av Tet-Off-systemet (99 min) var opptil 7x kortere enn det som finnes i nærvær av actinomycin D, som vist i figur 4. Dette bekrefter at actinomycin D fører til en artifactual αENaC mRNA stabilisering.
Dette Tet-Off-systemet ble også brukt med hell for å teste om forskjellige cellestressorer som er kjent for å påvirke αENaC genuttrykk, kunne modulere αENaC mRNA-stabilitet. Som vist i figur 5reduserte cykloheximidbehandling signifikant stabiliteten (36 min) av transkripsjonen, mens lipopolysakkarider (LPS, som brukes til å etterligne en smittsom stimuli) ikke. Til slutt forårsaket den proinflammatoriske cytokinTNF-α en drastisk nedgang i V5-αENaC mRNA-stabilitet (med en halveringstid på 16 min).
I dagens arbeid var kloningsstrategien ment å belyse bidraget fra 3' UTR til modulering av αENaC-transkripsjon. Flere sekvensielle slettingmutanter ble generert og testet for å kartlegge bidraget fra ulike domener i αENaC 3' UTR for å transkripsjonstabilitet. Figur 6 viser de betydelige endringene i moduleringen av stabiliteten til V5-αENaC mRNA avhengig av de slettede og inkluderte regionene i UTR.
Til slutt ble moduleringen av stabiliteten til αENaC mRNA ved RNA-bindende proteiner (RBP) studert med denne modellen. Transkripsjonen av αENaC mRNA med V5 epitop fra pTRE-Tight vektoren er under eksklusiv kontroll av tTA-Adv. Dhx36, Tial1 og hnRNPK er tre RBPs som er knyttet til 3 ' UTR av αENaC24. Derfor vil enhver modulering av uttrykket av V5-αENaC etter kotransfection med Dhx36, Tial1 eller hnRNPK, være konsekvensen av modulering av mRNA-stabiliteten og ikke transkripsjonsmodulering. Figur 7 viser at overuttrykket av Dhx36 eller Tial1, i motsetning til hnRNPK, reduserte stabiliteten til V5-αENaC mRNA sammenlignet med transfection med den tomme pcDNA3 plasmid, som viser spesifikk modulering av noen RBPs.
Til sammen bekreftet disse resultatene at Tet-Off transkripsjonsstyrt plasmid uttrykkssystem som vi utviklet representerer et passende verktøy for å evaluere den faktiske halveringstiden til en transkripsjon og mekanismene som er involvert i moduleringen. Dette verktøyet vil være nyttig for å skaffe ny innsikt i posttranskripsjonsreguleringen av viktige GOI-er som er involvert i funksjonen til alveolærepitelet i fysiologiske og patologiske forhold.
Figur 1: Effektiviteten av transfection av alveolære epitelceller i primærkulturen ved pipetteelektroporasjon. Primære alveolære epitelceller ble forbigående transfected med 2 μg av en pcDNA3 plasmid (tomme, kloner #1 og #2) som uttrykte eller ikke uttrykte GFP protein. Transfection effektivitet ble vurdert 48 h etter transfection av (A) fluorescens mikroskopi eller (B) flow cytometri. Enveis ANOVA og Bonferroni post hoc test; *p < 0,001 kontra tom. Celler fra minst fire forskjellige rotter (n ≥ 4) ble brukt for hver eksperimentelle tilstand. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Modulering av endogene αENaC mRNA ved doksysoksin i alveolære epitelceller. Alveolære epitelceller ble behandlet med 1,0 μg/ml doxycyklin i en periode på 1-24 timer. Uttrykket av αENaC mRNA ble kvantifisert av kvantitativ RT-PCR og presentert som uttrykk for αENaC mRNA ± SEM sammenlignet med det i ubehandlede celler (Ctrl; t = 0) etter normalisering i henhold til β-actin uttrykk (enveis ANOVA, n = 4). Doxycyklin modulerte ikke endogene αENaC mRNA over tid. Tidligere publisert som Figur S4 i Migneault et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Normalisering av GOI mRNA-uttrykk med en modifisert Cq-metode i henhold til uttrykket til den regulatoriske mRNA tTA-Ad. Alveolære epitelceller ble forbigående kotransinfisert med pTet-Off plasmid og pTRE-Tight plasmid koding αENaC cDNA bærer en V5 epitop oppstrøms av sin åpne leseramme og en komplett 3 'UTR sekvens. Uttrykket for V5-αENaC og tTA-Ad mRNAs ble målt ved kvantitativ RT-PCR i ubehandlede celler. (A) De delta-normaliserte SYBR Grønne lysrørene (ΔRn) på V5-αENaC og tTA-Ad fra to separate transfections (R1 og R2) er avbildet. (B) Venstre graf: mRNA uttrykk for V5-αENaC og tTA-Ad i hvert eksperiment (R1 og R2) uttrykkes som syklus kvantifisering verdi (Cq). Forskjellen mellom V5-αENaC og tTA-Ad mRNA uttrykk (ΔCq) presenteres. Høyre graf: Ved hjelp av tTA-Ad mRNA i stedet for rengjøringsgenet tillater effektiv normalisering av uttrykket av GOI, som viste et relativt uttrykk på 0,98 i R1 sammenlignet med det i R2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Nedbrytningskinetikk av V5-αENaC mRNA ved bruk av transkripsjonsstyrt plasmid uttrykkssystem i nærvær og fravær av actinomycin D. Primære alveolære epitelceller ble forbigående cotransfected med pTet-Off plasmid og pTRE-tight plasmid koding αENaC cDNA bærer en V5 epitop oppstrøms av sin åpne leseramme og fullføre 3 ' UTR sekvenser. Celler som ble forhåndsbehandlet eller ubehandlet med actinomycin D (5,0 μg/ml) i 30 min ble inkubert deretter med doksysyklin (1,0 μg/ml) i 15 min-6 timer. Uttrykk for V5-αENaC mRNA ble målt ved kvantitativ RT-PCR og presentert som prosentandelen ± SEM av V5-αENaC mRNA-uttrykk i ubehandlede celler (t = 0) etter normalisering i henhold til uttrykket av tTA-Ad. V5-αENaC mRNA halveringstid ble estimert av enfaset forfall ikke-lineær regresjon for hver celleforberedelse. Flere regresjonsanalyser viste en statistisk signifikant forskjell i V5-αENaC mRNA-stabilitet hos celler behandlet med actinomycin D sammenlignet med det i ubehandlede celler (p < 0,0001). Celler fra minst fire forskjellige rotter (n ≥ 4) ble brukt for hver eksperimentelle tilstand. Tidligere publisert som figur 1 i Migneault et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Modulering av V5-αENaC mRNA-stabilitet ved ulike cellulære og inflammatoriske påkjenninger. Primære alveolære epitelceller ble forbigående cotransfected med pTet-Off plasmid og pTRE-tight plasmid koding αENaC cDNA bærer en V5 epitop oppstrøms av sin åpne leseramme og fullføre 3 ' UTR sekvenser. Cellene ble forbehandlet i 30 min med 1,0 μM cykloheximid (CHX) (A) eller 15 μg/ml LPS (B) eller i 5 timer med 100 ng/ml TNF-α (C), etterfulgt av behandling med 1,0 μg/ml doxycyklin i en periode på 15-120 min. Uttrykk for V5-αENaC mRNA ble målt ved kvantitativ RT-PCR og presentert som prosentandelen ± SEM av V5-αENaC mRNA-uttrykk i ubehandlede celler (t = 0) etter normalisering i henhold til uttrykket av tTA-Ad. Celler fra minst tre forskjellige rotter (n ≥ 3) ble brukt for hver eksperimentelle tilstand. (D) Halveringstiden (t1/2) av V5-αENaC mRNA i behandlede celler ble sammenlignet med halveringstiden til mRNA i celler (Ctrl). Halveringstiden ble målt i henhold til hastighetskonstanten (K) av V5-αENaC mRNA-nedbrytningskurven ved hjelp av ligningen t1/2 = ln 2/K og deretter uttrykt som min ± SEM (enveis ANOVA-test og Bonferroni post hoc test; *p < 0,01 vs. kontroll; n ≥ 3). Tilpasset fra figur 36 tidligere publisert i Migneault, F.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bruk av den sekvensielle slettingkloningsstrategien for å avsløre rollen til ulike regioner i αENaC 3' UTR i moduleringen av mRNA-stabilitet. (A) Skjematisk kart over V5-αENaC-transkripsjonen med hele 3' UTR satt inn i pTRE-tight uttrykksvektoren. Den åpne leserammen er avbildet som en grå boks, mens 3' UTR vises som en hvit boks. 3' UTR-delen av αENaC mRNA er avbildet for klone bærer en komplett 3 ' UTR og for de forskjellige sletting mutanter (Del 1 til Del 4). (B) Primær alveolær epitelceller ble forbigående kotransinfisert med pTRE-tight plasmids koding forskjellige αENaC 3 ' UTR sletting mutanter sammen med pTet-Off plasmid, som uttrykker tTA-Ad, for å tillate det spesifikke uttrykket av konstruksjonen og dens hemming av doxycyklin. Syttito timer etter transfection, celler ble behandlet med doxycycline (1,0 μg/ml) i 15 min til 6 h. Uttrykk for V5-αENaC mRNA ble målt ved kvantitativ RT-PCR og presentert som prosentandelen ± SEM av V5-αENaC mRNA uttrykk i ubehandlede celler (t = 0) etter normalisering i henhold til uttrykket av tTA-Ad. V5-αENaC mRNA halveringstid for hver konstruksjon ble estimert fra hastighetskonstanten (K) for V5-αENaC mRNA-nedbrytningskurven ved hjelp av følgende ligning: t1/2 = ln 2/K. V5-αENaC mRNA-forfallet er vist for klone med hele 3' UTR (Comp) og for Del 1 til Del 4 3' UTR-slettingmutanter. Halveringstiden (t1/2) av mRNA-forfall er gitt for hver klone. I nedre høyre kvadrant viser grafen en sammenligning av de forskjellige t1/2 ± SEM-verdiene som er estimert for hver klone. p < 0,05 mellom de ulike gruppene i henhold til Kruskal-Wallis-testen. *p < 0,05 i henhold til Dunns post hoc-test sammenlignet med den komplette UTR-en på 3. Φp < 0,05 i henhold til Dunns post hoc-test sammenlignet med Del 3. Celler fra minst fem forskjellige dyr (n ≥ 5) ble brukt for hver eksperimentelle tilstand. Tilpasset fra figur 2 og 3 tidligere publisert i Migneault et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Posttranskripsjonsmodulasjon av V5-αENaC mRNA av RNA-bindende proteiner hnRNPK, Dhx36 og Tial1. (A) Primær alveolær epitelceller ble kotransinfisert med pTRE-tight plasmid koding V5-αENaC mRNA sammen med et uttrykk vektor for Dhx36, hnRNPK, eller Tial1 RBPs og pTet-Off plasmid. V5-αENaC mRNA-uttrykket ble kvantifisert av RT-qPCR 72 h posttransfection og uttrykt som prosentandel ± SEM av V5-αENaC mRNA-uttrykk sammenlignet med det i celler transfected med en tom vektor (pcDNA3) etter normalisering i henhold til uttrykket tTA-Ad. Overuttrykk av Dhx36 og Tial1 hemmet v5-αENaC mRNA-uttrykk, mens overuttrykk av hnRNPK ikke hadde noen effekt. *p < 0,05 i henhold til Kruskal-Wallis-testen og Dunns post hoc-test sammenlignet med tom vektor; n ≥ 3 prøver fra forskjellige dyr ble testet i duplikat for hver eksperimentelle tilstand. (B) Den proksimale delen av αENaC 3' UTR ble slettet ved kloning av den distale regionen av 3 ' UTR ved siden av αENaC stop codon i pTRE-tight plasmid (V5-αENaC-Del5). (C) Primær alveolære epitelceller ble kotransinfisert med V5-αENaC eller V5-αENaC-Del5 i pTRE-tight vektor sammen med pTet-Off plasmid og uttrykksvektoren for Dhx36 eller Tial1 RBP overuttrykk. V5-αENaC mRNA-uttrykket ble kvantifisert av RT-qPCR 72 h posttransfection og uttrykt som prosentandel ± SEM av V5-αENaC mRNA-uttrykk sammenlignet med det i celler transfected med en tom vektor (pcDNA3) etter normalisering i henhold til uttrykket av tTA-Ad. Overuttrykk av Dhx36 og Tial1 hadde ingen effekt på V5-αENaC-Del5 mRNA uttrykk. *p < 0,05 i henhold til Kruskal-Wallis-testen og Dunns post hoc-tester ved sammenligning av de eksperimentelle vektorene til den tomme vektoren; #p < 0,05 i henhold til Mann-Whitney U-testen ved sammenligning av de eksperimentelle vektorene til den komplette 3' UTR mutant; n ≥ 6 for hver eksperimentelle tilstand. Tilpasset fra figur 5 og 7 tidligere publisert i Migneault et al.24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| A | |||
| Mal | 3' UTR (andre er i verk) | Følelse | Sekvens |
| αENaC cDNA | Fullstendig | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT (Andre) CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 (andre kan være på | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT Gagggacagtgaaag-3' |
|
| Del 2 (andre siden) | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTTGGG-3' |
|
| Del 3 (andre siden) | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGTGTCC Ctgaaggcagtgaggc-3' |
|
| Del 4 (andre kan være på | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 (andre kan være på denne | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Målet | Følelse | Sekvens | |
| V5-αENaC (andre versjon) | F | 5'-CCTAACCCTCTCCTCGGTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv (andre betydninger) | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTGTCC-3' | ||
Tabell 1: Primere som brukes i denne studien. (A) Primerer som brukes til kloning og generering av V5-αENaC mutanter i den udukantpTRE-tette vektoren. (B) Primerer som brukes til måling av mRNA-uttrykk av kvantitativRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lave transfection rate av alveolære epitelceller i primærkulturen har vært en alvorlig begrensning for bruk av Tet-Off-systemet for å vurdere mRNA stabilitet i disse cellene. Denne begrensningen ble imidlertid overvunnet av pipetteelektroporasjon, slik at en 25-30% transfection effektivitet (Figur 1 og figur 3)26.
Målingen av transkripsjonstabilitet er grunnleggende for å forstå moduleringen av en gitt mRNA og dens innvirkning på celle homeostase og metabolisme. Variasjon i biotilgjengeligheten av en GOI kan endre oversettelseseffektiviteten og ha en direkte innvirkning på uttrykket av GOI i cellen. Av disse grunnene er det utviklet flere teknikker for å bestemme halveringstiden til mRNAer. Som beskrevet ovenfor, har hver av disse teknikkene begrensninger og begrensninger som forhindrer riktig studie av en transkripsjon av interesse. Sammenlignet med andre teknikker har TET-off-modellen som er utviklet her, fordelen av å tillate halveringsestimering av en gitt mRNA under enhver eksperimentell tilstand. Det tillater oss imidlertid ikke å direkte studere stabiliteten til en endogen transkripsjon. For å overvinne denne begrensningen så mye som mulig, er det foreslått å inkludere 5 ' UTR og 3 ' UTR sekvenser av transkripsjonen i plasmid slik at konstruksjonen er så lik som mulig til endogene utskrifter. Tillegg av V5 epitope tillater spesifikk forsterkning av målet mRNA av RT-qPCR versus den endogene transkripsjonen. Når det gjelder kloningsstrategien, er valget av sekvensen satt oppstrøms av genet av interesse avgjørende for å forhindre forsterkning av uspesifikke signaler. Tillegg av V5 epitopsekvens5' av ORF er nødvendig for den spesifikke qPCR forsterkningen av konstruksjonen på grunn av sin korte lengde og mangel på uttrykket i alveolære epitelceller. Denne strategien gir også mulighet til å studere modulering av proteinoversettelse ved hjelp av det samme indusible systemet. Til tross for den lille størrelsen på V5 epitop (42 nt), er det fortsatt mulig at dette kan påvirke stabiliteten av transkripsjon. Av denne grunn foreslås det å også teste andre epitoper, for eksempel humaninfluensahemagglutinin (HA) eller noen annen sekvens som ikke finnes i transkripsjonen av alveolære epitelceller.
En begrensning av systemet er bruk av doxycyklin for å hemme transkripsjonen av en GOI. Flere rapporter viser at doxycycline kan ha en betydelig innvirkning på cellemetabolismen. Bruken av dette antibiotika i 16HBE14 bronkialceller reduserer spredning og øker dødeligheten på grunn av apoptose27. I tillegg har doxycyklin allerede vist seg å være involvert i moduleringen av LPS inflammatorisk respons28. Derfor kan dette antibiotika ha off-target effekter som kan påvirke mRNA stabiliteten til en gitt GOI. Av disse grunnene vurderte vi virkningen av 1 μg/ml doxycyklin over en 24-hperiode på ikke-transinfiserte celler og fant at det ikke induserte noen endring i endogene αENaC mRNA-uttrykk (figur 2). Denne konsentrasjonen ble valgt fordi den er mye brukt til å fullstendig hemme transkripsjonen av Tet-Off-systemet og anbefales å minimere cytotoksiske effekter29. Vi foreslår at du bruker denne konsentrasjonen i alveolære epitelceller og anbefaler å validere den optimale konsentrasjonen for studiet av andre gener eller bruk av andre celletyper med Tet-Off-systemet.
Vårt system benytter det konstitutive uttrykket av GOI til transkripsjonen er hemmet av doxycyklin. Det har blitt foreslått at overdreven mRNA konsentrasjoner kan være giftig for cellen og påvirke stoffskiftet. Dette kan føre til en endring i stabiliteten til GOI-transkripsjonen, noe som forårsaker rask nedbrytning på grunn av ikke-fysiologisk overuttrykk30. I tilfelle av vår Tet-Off-modell ble slik toksisitet ikke observert, fordi de transinfiserte cellene viste en morfologi som ligner på friske ikke-transinfiserte celler (data som ikke ble vist). I samsvar med Tani et al.31, som demonstrerte gyldigheten av Tet-Off-systemet i å bestemme halveringstiden til en mRNA, viste våre resultater at Tet-Off-systemet ikke er giftig i alveolære epitelceller og gir en halveringstid for αENaC mRNA som ikke gjenspeiler overstabiliseringen som ble rapportert i nærvær av transkripsjonshemmere som actinomycin D (Figur 4).
Utviklingen av dette systemet for å måle halveringstiden av mRNA utfordrer resultatene som ble observert når stabiliteten av transkripsjoner ble målt i nærvær av transkripsjonshemmere som actinomycin D. Denne metoden viser at en transkripsjonshalveringstid kan være mye kortere enn tidligere målt.
Vår modell er svært hensiktsmessig for å studere posttranskripsjonsmodulering av en bestemt transkripsjon under forskjellige forhold, inkludert proinflammatoriske tilstander eller RBP-overuttrykk, samt etter behandling med deaktivering av RNA. I tillegg tillater det karakterisering av uoversatte regioner som er avgjørende for posttranskripsjonsmodulering av mRNAs i patofysiologiske forhold som påvirker alveolære epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Francis Migneault ble støttet av et fellesskap levert av Quebec Respiratory Health Network og Canadian Institutes of Health Research (CIHR) lungetreningsprogram, et studentskap fra FRSQ og et studentskap fra Faculté des Études Supérieures et Postdoktor, Université de Montréal. Dette arbeidet ble støttet av Gosselin-Lamarre Chair i klinisk forskning og Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M. The transcription stress response. Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).
- Ross, J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
