Summary
Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.
Abstract
Das Studium der posttranskriptionalen Regulation ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen Boten-RNA (mRNA) und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Tatsächlich könnten Schwankungen des Transkriptsausdrucks die Übersetzungseffizienz und letztlich die zelluläre Aktivität eines Transkripts verändern. Mehrere experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNA zu untersuchen, obwohl einige dieser Methoden Einschränkungen haben, die die ordnungsgemäße Untersuchung der posttranskriptiellen Modulation verhindern. Ein Promotor-Induktionssystem kann ein Gen von Interesse unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors ausdrücken. Diese Methode ermöglicht die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung ohne störende Zellhomöostase. Ein großer Nachteil dieser Methode ist die Notwendigkeit, Zellen zu transfekten, was den Einsatz dieser Technik in isolierten Primärzellen einschränkt, die sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken sind. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden ausgiebig verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolar-Epithels zu untersuchen. Die einzigartigen Eigenschaften und der Phänotyp der primären Alveolarzellen machen es wichtig, die posttranskriptionalen Modulationen von Genen zu untersuchen, die für diese Zellen von Interesse sind. Daher war es unser Ziel, ein neuartiges Werkzeug zu entwickeln, um die posttranskriptionischen Modulationen von mRNAs von Interesse in alveolar epitheliaalen Zellen in der Primärkultur zu untersuchen. Wir haben ein schnelles und effizientes transientes Transfektionsprotokoll entwickelt, um ein transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem in primäre Alveolar-Epithelzellen einzufügen. Diese Klonstrategie, die ein virales Epitop verwendet, um das Konstrukt zu markieren, ermöglicht die einfache Diskriminierung des Konstruktausdrucks von der von endogenen mRNAs. Mit der modifizierten Methode des Quantifizierungszyklus (Cq) kann die Expression des Transkripts dann in verschiedenen Zeitintervallen quantifiziert werden, um seine Halbwertszeit zu messen. Unsere Daten zeigen die Effizienz dieses neuartigen Ansatzes bei der Untersuchung der posttranskriptionalen Regulation unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen in primären Alveolarepithelzellen.
Introduction
Mehrere Techniken wurden entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Die Puls-Chase-Zerfallstechnik, die markierte mRNAs verwendet, ermöglicht die gleichzeitige Auswertung eines großen Pools von mRNAs mit minimaler zellulärer Störung. Dieser Ansatz erlaubt jedoch keine direkte Schätzung der Halbwertszeit eines einzelnen Gentranskripts und kann nicht implementiert werden, um die posttranskriptionelle Modulation einer mRNA nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren, ROS, Alarminen oder Entzündungen zu untersuchen1.
Die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, wie Actinomycin D und Amanitin, ist eine relativ einfache Methode zur Messung der mRNA-Abbaukinetik im Laufe der Zeit. Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes gegenüber früheren Techniken (d. h. Pulse-Chase) beruht auf der Fähigkeit, die Halbwertszeit eines bestimmten Transkripts direkt abzuschätzen und zu vergleichen, wie verschiedene Behandlungen seine Abbaukinetik beeinflussen könnten. Die signifikante schädliche Wirkung von Transkriptionsinhibitoren auf die Zellphysiologie stellt jedoch einen großen Nachteil des Ansatzes2dar. Tatsächlich hat die Hemmung des gesamten Zelltranskriptoms mit diesen Medikamenten die negative Nebenwirkung, die Synthese von Schlüsselelementen, die an der mRNA-Stabilität beteiligt sind, wie z. B. microRNAs (miRNAs), sowie die Expression und Synthese von RNA-bindenden Proteinen, die für den mRNA-Abbau und die Stabilität wichtig sind, zu stören. Die starke Störung der Gentranskription durch diese Medikamente könnte daher die Abbaukurven von Transkripten arteffakt verändern.
Das Promotor-Induktionssystem stellt einen dritten Ansatz zur Messung der Halbwertszeit einer bestimmten mRNA dar. Diese Methode misst den Abbau einer spezifischen mRNA in ähnlicher Weise wie Methoden, die Transkriptionsinhibitoren verwenden. Häufig kommen zwei Arten von Induktionssystemen zum Einsatz: der seruminduzierte c-fos-Promoter3 und das Tet-Off Induzierbare System4. Mit dem c-fos-System ist die Verwendung von Transkriptionsinhibitoren, die toxisch für die Zelle sein können, nicht erforderlich. Diese Methode erfordert jedoch eine Zellzyklussynchronisierung, die die Auswertung der tatsächlichen Stabilität eines Transkripts während der Interphase5verhindert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Tet-Off-System die starke Expression des Gens von Interesse (GOI) unter der Kontrolle eines synthetischen Tetracyclin-regulierten Promotors. Dieses System erfordert das Vorhandensein von zwei Elementen, die in die Zelle kotransfiziert werden müssen, um funktionsfähig zu sein. Das erste Plasmid (pTet-Off) drückt das regulatorische Protein tTA-Adv aus, einen hybriden synthetischen Transkriptionsfaktor, der aus dem prokaryotischen Repressor TetR (aus Escherichia coli) besteht, das zu drei Transkriptionstransaktivierungsdomänen aus dem viralen Protein HSV VP16 verschmolzen ist. Die GOI wird unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors (PTight) in das pTRE-Tight-Plasmid geklont, das die minimale Sequenz des Cytomegalievirus-Promotors (CMV) umfasst, die zu sieben Wiederholungen der tetO-Operatorsequenz verschmolzen ist. Die Transkription des Gens flussabwärts von PTight ist abhängig von der Wechselwirkung von TetR mit tetO. In Gegenwart von Tetracyclin oder seinem Derivat Doxycyclin verliert der TetR-Repressor seine Affinität zum tetO-Operator, was zu einer Einstellung der Transkription4führt. Die Eigenschaften des Tet-Off-Systems machen es zu einem idealen Modell für die Untersuchung der spezifischen mRNA-Expression in eukaryotischen Zellen unter Vermeidung potenzieller pleiottroper Effekte, die sekundär zum Fehlen prokaryotischer regulatorischer Sequenzen in der eukaryotischen Zelle6sind. Normalerweise werden doppelt stabile Tet-Off-Zelllinien (HEK 293, HeLa und PC12) mit diesem System verwendet, um Kopien des Reglers und Reaktionsplasmide für einen bequemen Zugriff auf die kontrollierbare Genexpression7,8,9zu integrieren.
Mehrere Modelle von Alveolar-Epithelzellen in der Kultur wurden verwendet, um die Zell- und Molekularbiologie des Alveolarenepithels zu untersuchen. Seit Jahren nutzen Forscher ausgiebig menschliche oder Nagetier-Primärzellen10,11 sowie verewigte Zelllinien wie menschliche A549- oder Ratten-RLE-6TN-Zellen12,13. Obwohl sie im Allgemeinen weniger proliferativ und schwieriger zu kultur- und transfektionsmittel sind, bleiben Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur der Goldstandard für die Untersuchung der Funktion und Dysfunktion des Alveolarers epithel unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Tatsächlich weisen verewigte Zelllinien wie A549-Zellen nicht die komplexen Eigenschaften und Phänotypen von Primärzellen auf, während alveolare Epithelzellen in der Primärkultur die Haupteigenschaften des Alveolarenepithels rekapitulieren, insbesondere die Fähigkeit, eine polarisierte und enge Barriere14,15zu bilden. Leider sind diese Zellen sehr resistent gegen herkömmliche Transfektionstechniken, wie diejenigen, die Liposomen verwenden, was den Einsatz eines Promotor-induzierten Systems wie Tet-Off sehr schwierig macht.
Die posttranskriptionelle Modulation von mRNAs ist eine der effektivsten Methoden zur schnellen Modulation der Genexpression eines Transkripts16. Die mRNA 3' unübersetzte Region (3' UTR) spielt in diesem Mechanismus eine wichtige Rolle. Es hat sich gezeigt, dass im Gegensatz zur 5' UTR eine exponentielle Korrelation zwischen der Länge der 3' UTR und den zellulären und morphologischen Komplexitäten eines Organismus besteht. Diese Korrelation legt nahe, dass die 3' UTR, wie die mRNA-Codierungsregionen, einer natürlichen Selektion unterzogen wurde, um eine immer komplexere posttranskriptive Modulation während der gesamten Evolution17zu ermöglichen. Die 3' UTR enthält mehrere Bindungsstellen für Proteine und miRNAs, die die Stabilität und Übersetzung des Transkripts beeinflussen.
In der vorliegenden Arbeit haben wir ein Werkzeug entwickelt, um die Rolle hochkonservierter Domänen in der 3' UTR einer GOI zur Kontrolle der Transkriptstabilität zu untersuchen. Wir konzentrierten uns auf den epithelialen Natriumkanal, die Alpha-Untereinheit (ENaC), die eine Schlüsselrolle in der alveolar epithelialen Physiologie18spielt. Alveolare Epithelzellen in der Primärkultur wurden erfolgreich transfiziert mit den beiden Komponenten des Tet-Off-Systems transfiziert, was die Untersuchung der Rolle der 3' UTR in der mRNA-Stabilität mit einem System ermöglicht, das die Zellphysiologie und den Stoffwechsel im Vergleich zur Verwendung von Transkriptionsinhibitoren mit anderen Protokollen minimal beeinflusst. Es wurde eine Klonstrategie entwickelt, um die Expression der goI von der des endogenen Gens unter Verwendung eines nicht endogen exprimierten Epitops (V5) zu unterscheiden. Die Reaktions- und regulatorischen Plasmide wurden dann mit hilfe einer Pipettenelektroporationstechnik in Alveolar-Epithelzellen übertragen. Anschließend wurde die Expression des Transkripts durch Inkubation der Zellen mit Doxycyclin in unterschiedlichen Zeitintervallen gemessen. Die Halbwertszeit des Transkripts wurde von RT-qPCR mit einer modifizierten Cq-Methode unter Verwendung des transfizierten tTA-Ad mRNA-Produkts zur Normalisierung bewertet. Durch unser Protokoll bieten wir eine bequeme Möglichkeit, die posttranskriptionelle Modulation eines Transkripts unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen und die Einbeziehung der nicht übersetzten Regionen genauer zu definieren.
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Protocol
Alle tierischen Eingriffe wurden nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Institutional Animal Care Committee des Research Center of Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) genehmigt.
1. Entwurf und Generierung des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse ausdrückt (GOI)
- Verwenden Sie einen induzierbaren Tetracyclin-Off-Vektor, z. B. pTRE-Tight.
- Analysieren Sie die Reihenfolge der GOI und der Multiple-Klon-Site (MCS) des Vektors, um die Einschränkungssites im MCS zu identifizieren, die intern nicht in der unternehmenseigenen Stelle vorhanden sind.
- Isolieren Sie primäre Alveolar-Epithelzellen aus männlichen Sprague-Dawley-Rattenlungen, wie zuvor beschrieben19,20.
- Reinigen Sie die gesamte RNA aus den Alveolar-Epithelzellen durch RNA-Extraktion mit einer Standardmethode, wie phenol/chloroform-Extraktion oder der Verwendung von Siliziumdioxid-basierten RNA-Spin-Säulen.
- Reverse-Transcribe der mRNA in komplementäre DNA (cDNA) mit Oligo(dT) und High-Fidelity Reverse Transkriptase.
- Verwenden Sie Hochtreue-Taq-Polymerase und Standard-Überlappungs-PCR-Techniken, um die GOI mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzymerkennungsstellen mit entworfenen Primern zu flankieren.
- Lassen Sie die Vorwärtsgrundierung eine Kozak-Konsensribosome-Bindungsstelle21 enthalten, um die Expressionskonzentration enparieren zu lassen, um die Proteinexpression parallel zur mRNA-Stabilität zu untersuchen. Eine Sequenz, die das V5-Epitop vor der goI kodiert, muss enthalten sein, um den Ausdruck der transfizierten goI von endogenen Expressionen (Tabelle 1) zu unterscheiden.
- Lassen Sie die umgekehrte Grundierung ein Polyadenylierungssignal nach dem Stop-Codon enthalten.
- Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener 3' UTR-Regionen auf die Stabilität der mRNA der GOI mit Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die das 3' Ende der GOI 3' UTR schrittweise löscht (Abbildung 6). Alternativ kann PCR-gesteuerte Mutagenese verwendet werden, um eine bestimmte Interessensregion in der 3' UTR22anzusprechen.
- Verdauen Sie den induzierbaren Vektor und den Einsatz mit den zuvor gewählten Restriktionsenzymen bei der entsprechenden Inkubationstemperatur für 1 h, gefolgt von der Behandlung mit Phosphatase während der Vektorreaktion für 30 min, um eine Selbstligation zu vermeiden.
- Trennen Sie den verdauten Vektor und fügen Sie Segmente durch Elektrophorese in einem 1-1,5% Agarose-Gel ein (Konzentration abhängig von der Größe des Einsatzes).
- Sammeln Sie mit einer Klinge und einem UV-Licht die DNA-Fragmente, die den gewünschten Einsatz und vektor enthalten.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Reinigen Sie die gesammelten Segmente aus dem Agarose-Gel mit einem pcR-Reinigungskit auf Kieselsäurebasis und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm.
- Ligate die GOI und den induzierbaren Vektor mit T4 DNA Ligase mit einem Vektor: einfügen Molar Verhältnis von 1:3, um die Wahrscheinlichkeit der Ligation zu erhöhen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (RT) für 3 h.
- Verwandeln Sie die Ligationsreaktion in kompetente E. coli (DH5).
- Fügen Sie 1-10 ng Vektor und Gen in eine Röhre mit 100 l kompetenten Zellen. Inkubieren Sie die Zellen 30 min auf Eis und dann Wärmeschockzellen bei 42 °C für 45 s. Legen Sie die Röhre für 2 min auf Eis und fügen Sie 900 l RT LB Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 37 °C mit Schütteln bei 225 Rpm.
- Verteilen Sie 100 l der Reaktion auf eine LB-Agarplatte mit einem geeigneten Antibiotikum (z. B. 100 g/ml Ampicillin für den pTRE-Tight-Vektor), um die transformierten Bakterien auszuwählen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C.
- Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer Impfschleife oder einer 20-L-Spitze aus und inkubieren Sie über Nacht in 5 ml LB-Medium, das das geeignete Antibiotikum bei 37 °C mit Schütteln enthält. Die transformierten Bakterien können in Glycerinvorräten bei -80 °C im Verhältnis 400:600 lb Medium zu Glycerin gelagert werden.
- Extrahieren Sie die Plasmid-DNA mit Kieselsäure-basierten Plasmidsäulen und messen Sie die Konzentration mittels Spektrophotometrie bei 260 nm. Bestätigen Sie die Einfügung der goI durch Restriktionsanalyse und ihre Ausrichtung sowie das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der RT-PCR durch Sequenzierung eingeführt werden.
2. Transfektion des Antwortplasmids, das das Gen von Interesse (GOI) in primäre Alveolar-Epithelzellen ausdrückt
- Isolieren Sie Typ II Alveolare Epithelzellen aus rattenlunge.
- Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/cm2 in 100 mm Petrischalen mit komplettem minimalen essentiellen Medium (komplettes MEM). Komplettes MEM ist MEM, ergänzt durch 10% FBS, 0,08 mg/L Tobramycin, Septra (3 g/mL Trimethoprim und 17 g/ml Sulfamethoxazol), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) und 2 mM L-Glutamin. Die Zellen für 24 h bei 37 °C in 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator skulturen.
- Am nächsten Tag 500 l komplettes MEM ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte legen und die Platte 30 min bei 37 °C vorwärmen. Während dieses Schritts ist es wichtig, fetales Rinderserum frei von kontaminierenden Tetracyclinen oder mit einem zu niedrigen Niveau zu verwenden, um die Induzierbarkeit zu stören.
- Bereiten Sie 1,5 ml-Röhrchen vor, die das Plasmid mit dem induzierbaren GOI (GOI-Plasmid) und dem regulatorischen Vektor (z. B. pTet-Off) enthalten, indem Sie 1 g GOI-Plasmid und 1 g regulatorischen Vektor pro Bohrwert bei RT hinzufügen. Für Coexpression-Experimente mit RNA-bindenden Proteinen (RBP) wird dem DNA-Mix 1 g eines konstitutiven Vektors (z.B. pcDNA3), der das RPB von Interesse ausdrückt, zugesetzt (Abbildung 7).
- Das Medium ansaugen und die Zellen vorsichtig mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium) vorwärmiert bei 37 °C abspülen.
- Fügen Sie 5 ml 0,05% Trypsin vorgewärmt bei 37 °C hinzu und inkubieren Sie die Zellen, bis die Zellen abgetrennt sind (2-4 min). Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 10 ml komplettes MEM ohne Antibiotikum hinzufügen.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml Rohr, waschen Sie die Petrischale mit 4 ml Medium, um so viele verbleibende Zellen wie möglich zu sammeln, und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min.
- Den Überstand vorsichtig ansaugen und entsorgen und das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Zählen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet im Resuspensionspuffer in einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml wieder aufsetzen. Fügen Sie die Zellen aus dem 1,5 ml Rohr in Schritt 2.4 bei einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Brunnen vorbereitet und mischen Sie sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten.
- Legen Sie das Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie es mit 3,5 ml Elektrolysepuffer.
- Legen Sie eine vergoldete Elektrodenspitze durch vollständiges Drücken des Kolbens in eine Pipette ein. Mischen Sie den Inhalt des 1,5 ml Rohres vorsichtig und saugen Sie die Zellen vorsichtig mit der Pipette an. Achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht in die Spitze gelangen, da dies während der Elektroporation zu lichten Lichtbögen führt und zu einer verminderten Transfektionseffizienz führt.
- Legen Sie die Pipette in die Elektroporationsstation ein, bis ein Klickgeräusch vorliegt.
- Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für alveolare Epithelzellen, das einer Pulsspannung von 1.450 V und 2 Impulsen mit einer Breite von 20 ms entspricht, und drücken Sie auf dem Touchscreen Start.
- Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen zuvor mit komplettem MEM gefüllten Brunnen ohne Antibiotikum übertragen, das auf 37 °C vorgewärmt wurde.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.14 für die verbleibenden Proben.
- Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig über die Brunnenoberfläche zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2 in einem befeuchteten Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach 2 Tagen durch komplettes MEM durch Antibiotika.
- Bestätigen Sie den Erfolg der Transfektion, indem Sie die Expression von eGFP unter einem Fluoreszenzmikroskop oder durch Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor(Abbildung 1) beobachten.
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und erfordert einen zusätzlichen Transfektionsschritt mit einem anderen Plasmid, das eGFP exsep, wie pcDNA3-EGFP, exzessischt.
3. Induktion der Transkriptionshemmung der GOI
HINWEIS: Die Zellen können mit den gewünschten Behandlungen vor doxycyclin induktion vorbehandelt werden, um ihre Auswirkungen auf die mRNA-Stabilität zu bewerten (Abbildung 5).
- Bereiten Sie eine Doxycyclin-Stammlösung von 1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor. Bewahren Sie die Lagerlösung bei -20 °C vor Licht schutzfrei auf. Doxycyclin, ein Tetracyclin-Derivat, wird anstelle von Tetracyclin verwendet, weil es eine längere Halbwertszeit (2x) als Tetracyclin hat. Darüber hinaus ist eine geringere Konzentration von Doxycyclin für die vollständige Inaktivierung des Tet Operon23erforderlich.
HINWEIS: Doxycyclin könnte die mRNA-Expression der endogenen GOI beeinflussen. Um dies zu überprüfen, sollte die Wirkung einer 24-h-Behandlung mit Doxycyclin auf Alveolarzellen getestet werden, um das Fehlen von Veränderungen der GOI-Expression zu bestätigen (Abbildung 2). - Bereiten Sie eine frische 1 g/ml Doxycyclin-Lösung in vollständiger MEM 72 h-Posttransfektion vor und erwärmen Sie sie auf 37 °C.
- Ersetzen Sie das Medium durch 1 ml vollständiges MEM, das 1 g/ml Doxycyclin pro Brunnen enthält, um die Transkription der GOI zu hemmen.
- Inkubieren Sie mehrere Brunnen bei 37 °C in 5%CO2 für verschiedene Zeitmengen von 15 min-6 h, um die mRNA-Halbwertszeit der goI zu bewerten.
- Am Ende der Behandlung die Zellen mit eiskaltem PBS waschen und mit einem handelsüblichen Phenol-Chlorform-RNA-Extraktionskit lysieren, indem Sie 500 l Puffer pro Brunnen hinzufügen und die Platte schütteln, um die Zellen zu homogenisieren.
- Isolieren Sie die RNA gemäß dem Herstellerprotokoll. Bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 nm. RNA-Proben mit 260:230 bzw. 260:280 Verhältnissen von 1,8 bzw. 2,0 gelten als rein.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
4. Bestimmung der mRNA-Stabilität der GOI
- Behandeln Sie 1 g Gesamt-RNA mit RNAse-freier DNAse I (Verstärkungsgrad), um jede Spur von Plasmid-DNA zu entfernen, die die nachfolgende DNA-Verstärkung stören könnte.
- Kombinieren Sie in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen 1 g RNA, 1 l 10x DNase I-Reaktionspuffer, 1 l DNAse I (1 U/L) und RNAse-freies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 10 l zu erhalten.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei RT für 20 min.
- Deaktivieren Sie DNAse I, indem Sie dem 10-L-Reaktionsmix 1 l von 25 mM EDTA hinzufügen und die Reaktion bei 70 °C für 10 min inkubieren.
- Reverse-Transcribe die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen cDNA-Synthese-Kit mit einer Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Hexamer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern.
- Fügen Sie kurz 4 l 5x Reaktionsmischung, 1 l Reverse-Transkriptase und 4 l RNAse-freies Wasser zu 11 l des DNA-erschöpften gesamten RNA-Mixes hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 l zu erhalten. Mischen Sie die Reaktion gut, indem Sie sie nach oben und unten pipetieren.
- Inkubieren Sie die Reaktion für 5 min bei 25 °C, gefolgt von 20 min bei 46 °C, und inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie sie bei 95 °C für 1 min inkubieren. Jede Reaktion ergibt 50 ng/l cDNA-Produkt.
- Verdünnen Sie die cDNA-Reaktion auf eine Konzentration von 5 ng/l, indem Sie dem 20-L-Reaktionsmix 180 l molekularbiologisches Wasser zusetzen. Bewahren Sie die cDNA-Produkte bei -80 °C auf oder führen Sie sofort die quantitative PCR (qPCR) in Echtzeit durch.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
- Entwerfen Sie qPCR-Primer speziell für die GOI vorwärts und rückwärts.
- Aufgrund der endogenen Expression der goI in den Zellen müssen die Primer so ausgelegt sein, dass sie ein 100-150 bp Amplikon des Ang.:A5-Epitops verstärken, das an die goI gekoppelt ist (Tabelle 1).
- Interne Referenzgenprimer müssen auch als Normalisierungskontrollen verwendet werden. Üblicherweise werden Haushaltsgene wie Beta-Actin und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1-Gene als Referenzgene verwendet. Diese können jedoch aufgrund der Variation der Transfektionseffizienz nicht mit diesem Induktionssystem verwendet werden. Stattdessen wird die Expression des tTA-Ad-Transkripts zum Zwecke der Normalisierung bewertet, da seine Expression in Zellen aufgrund der Aktivität des Cytomegalievirus-Promotors konstitutiv ist. Jede Variation in seiner Expression, gemessen mit qPCR, ist repräsentativ für die Transfektionseffizienz (Primer: vorwärts 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' und reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp Amplicon) und ermöglicht die Normalisierung der Expression der transfizierten Klone (Abbildung 3).
- Bereiten Sie jede qPCR-Reaktion in Dreifacharbeit mit einem SYBR Green Farbstoff-Master-Mix vor.
- Verdünnen Sie die 5 ng/l cDNA-Mischung mit molekularbiologischem Wasser auf eine Konzentration von 1,25 ng/l.
- Kombinieren Sie 5 l SYBR Green Farbstoff-Master-Mix (2x), 0,1 l molekularbiologisches Wasser, 0,45 l von 7,5 'M Vorwärtsprimer, 0,45 'L von 7,5 'M Reverse Primer und 4 'L von 1,25 ng/l cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 'L zu erhalten. Verwenden Sie optische Klebefolie, um sicherzustellen, dass die Plattenabdeckung versiegelt ist und um Verunreinigungen und Verdunstung zu verhindern.
- Drehen Sie den Reaktionsmix kurz durch Zentrifugation nach unten und legen Sie die Platte in einen qPCR Thermocycler.
- Verstärken Sie die V5-getaggten GOI- und tTA-Ad-Amplicons mit den folgenden qPCR-Bedingungen: 95 °C für 10 min als Denaturierungsschritt, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s, 58 °C für 15 s und 72 °C für 20 s. Nach der Auswertung der Amplifikationszyklen muss eine hochauflösende Schmelzkurve erzeugt werden, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplikonen zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.
- Schließen Sie negativgesteuerte Kontrollen für die qRT-PCR ein, indem Sie qPCR mit RNA als Vorlage ohne Reverse-Transkriptase durchführen, um als Kontrolle für eine mögliche Plasmid-DNA-Kontamination zu dienen, und qPCR ohne cDNA, die dem qPCR-Mix hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass das Fehlen von Primer-Dimeren oder Kontaminanten.
- Die optimale cDNA-Konzentration, Primereffizienz und Konzentration muss entsprechend der GOI durch einen Standard-Kurventest optimiert werden. Führen Sie dazu eine serielle Verdünnung mit cDNA aus unbehandelten Zellen (kultiviert ohne Doxycyclin) durch. Die Standardkurve wird erzeugt, indem die Cq-Werte mit dem Protokoll des cDNA-Verdünnungsfaktors dargestellt werden, und die Amplifikationseffizienz (E) wird entsprechend der Steigung der Standardkurve mit der folgenden Formel berechnet:
E = 10-1/Steigung
HINWEIS: Die Verstärkungseffizienz sollte etwa 0,9 bis 1,05 betragen. Andernfalls müssen die Primer neu gestaltet werden.
- Analysieren Sie die qPCR-Daten mit der vergleichenden Cq-Methode, indem Sie die Expressionswerte der GOI auf die Expression von tTA-Ad normalisieren, um die relativen Expressionsniveaus der GOI zu erhalten und ihre Expression als Prozentsatz der mRNA-Expression der GOI in Zellen desselben Tieres am Startpunkt (t = 0) zu melden (Abbildung 4).
- Die Halbwertszeit wird aus der Ratenkonstante (K) der GOI mRNA Abbaukurve mit der folgenden Gleichung bestimmt:
t1/2 = ln 2/K.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um ein Tet-Off-Transkriptions-Expressionssystem zu generieren, um die Bedeutung verschiedener Teile des UTR von ENaC 3 für die Modulation der Transkriptstabilität in primären Alveolar-Epithelzellen zu bewerten.
Der erste Schritt bei der Implementierung dieses Systems bestand darin, eine schnelle, einfache und effiziente Transfektionstechnik für alveolare Epithelzellen in der Primärkultur zu etablieren, die schwer zu transfekten sind. Wie in Abbildung 1dargestellt, ermöglichte die Pipettenelektroporationstechnik eine Transfektionseffizienzrate von 25-30 %, wie die Durchblutungsraten von eGFP-Zellen zeigen, die durch Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.
Vor der Anwendung dieses Induktionssystems, das durch Tetracyclin und seine Derivate kontrolliert wird, wurde der Einfluss dieses Medikaments auf die Expression unserer GOI überprüft. Die Alveolar-Epithelzellen wurden mit 1,0 g/ml Doxycyclin behandelt, um ihre Auswirkungen auf die endogene ENaC-mRNA-Expression zu bewerten. Behandlungen, die über einen Zeitraum von 1-24 h durchgeführt wurden, hatten keine signifikanten Auswirkungen auf die Expression der endogenen Niederschrift, wie in Abbildung 2dargestellt.
Unser transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem verwendet eine qPCR-Normalisierungstechnik, die sich von der Standardtechnik unterscheidet, die Haushaltsgene verwendet. Im Falle der Expression von V5-ENaC wurde das Signal gemäß dem tTA-Adv-Signal normalisiert, um die Effizienz der Transfektion mit der Cq-Methode zu bestimmen. Abbildung 3 zeigt die Verwendung des tTA-Adv-Transkripts zur Normalisierung der mRNA-Expression.
Zuvor veröffentlichte Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung von Actinomycin D für die Schätzung der Transkriptstabilität von ENaC ungeeignet ist, da sie auf eine ungewöhnlich hohe mRNA-Halbwertszeit (ca. 12 h)24hindeutet. Die Halbwertszeit von ENaC mRNA in Gegenwart des Tet-Off-Systems (99 min) war bis zu 7x kürzer als die in Gegenwart von Actinomycin D gefundene, wie in Abbildung 4dargestellt. Dies bestätigt, dass Actinomycin D zu einer artefaktischen mRNA-Stabilisierung führt.
Dieses Tet-Off-System wurde auch erfolgreich eingesetzt, um zu testen, ob verschiedene Zellstressoren, von denen bekannt ist, dass sie die Genexpression von ENaC beeinflussen, die Stabilität von ENaC mRNA modulieren können. Wie in Abbildung 5dargestellt, verringerte die Cycloheximid-Behandlung die Stabilität (36 min) des Transkripts signifikant, während Lipopolysaccharide (LPS, die zur Nachahmung infektiöser Reize verwendet werden) dies nicht taten. Schließlich verursachte das pro-inflammatorische Zytokin TNF-A einen drastischen Rückgang der V5-ENaC mRNA-Stabilität (mit einer Halbwertszeit von 16 min).
In der vorliegenden Arbeit sollte die Klonstrategie den Beitrag der 3' UTR zur Modulation des ENaC-Transkripts aufklären. Mehrere sequenzielle Löschmutanten wurden generiert und getestet, um den Beitrag verschiedener Domänen der UTR "ENaC 3" zur Transkriptionsstabilität abzubilden. Abbildung 6 zeigt die signifikanten Veränderungen in der Modulation der Stabilität von V5-ENaC mRNA in Abhängigkeit von den gelöschten und eingeschlossenen Regionen der 3' UTR.
Schließlich wurde mit diesem Modell die Modulation der Stabilität von ENaC mRNA durch RNA-bindende Proteine (RBP) untersucht. Die Transkription von 'ENaC mRNA mit dem V5-Epitop aus dem pTRE-Tight-Vektor steht unter der exklusiven Kontrolle von tTA-Adv. Dhx36, Tial1 und hnRNPK sind drei RBPs, die mit dem 3' UTR von 'ENaC24'verknüpft sind. Daher wäre jede Modulation der Expression von V5-ENaC nach Kotransfektion mit Dhx36, Tial1 oder hnRNPK die Folge der Modulation der mRNA-Stabilität und nicht der Transkriptionsmodulation. Abbildung 7 zeigt, dass die Überexpression von Dhx36 oder Tial1, im Gegensatz zu hnRNPK, die Stabilität von V5-ENaC mRNA im Vergleich zur Transfektion mit dem leeren pcDNA3-Plasmid verringerte, was die spezifische Modulation einiger RBPs zeigt.
Zusammen bestätigten diese Ergebnisse, dass das von uns entwickelte Tet-Off-Transkriptionsexpressionssystem ein geeignetes Werkzeug zur Bewertung der tatsächlichen Halbwertszeit eines Transkripts und der Anregungsmechanismen darstellt. Dieses Tool wird nützlich sein, um neue Einblicke in die posttranskriptionelle Regulierung wichtiger GOIs zu gewinnen, die an der Funktion des Alveolarepithels unter physiologischen und pathologischen Bedingungen beteiligt sind.
Abbildung 1: Effizienz der Transfektion von Alveolarepithelzellen in der Primärkultur durch Pipettenelektroporation. Primäre Alveolare Epithelzellen wurden transfikonient mit 2 g eines pcDNA3-Plasmids (leer, klone #1 und #2) transfiziert, das GFP-Protein exprimierte oder nicht ausdrückte. Die Transfektionseffizienz wurde 48 h nach Transfektion durch (A) Fluoreszenzmikroskopie oder (B) Durchflusszytometrie bewertet. Einweg-ANOVA- und Bonferroni-Test; *p < 0.001 vs. leer. Für jede experimentelle Erkrankung wurden Zellen von mindestens vier verschiedenen Ratten (n 4) verwendet. Maßstabsleiste = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Modulation der endogenen ENaC mRNA durch Doxycyclin in Alveolarepithelzellen. Alveolare Epithelzellen wurden für einen Zeitraum von 1-24 h mit 1,0 g/ml Doxycyclin behandelt. Die Expression von 'ENaC mRNA wurde durch quantitative RT-PCR quantifiziert und als Expression von 'ENaC mRNA ' SEM im Vergleich zu der in unbehandelten Zellen (Strg; t = 0) nach normalisierter Nachwirkung nach '-Aktin-Expression (einweg ANOVA, n = 4) dargestellt. Doxycyclin modulierte im Laufe der Zeit keine endogenen ENaC mRNA. Zuvor veröffentlicht als Figur S4 in Migneault et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Normalisierung der GOI mRNA-Expression mit modifizierter Cq-Methode entsprechend der Expression der regulatorischen mRNA tTA-Ad. Alveolar-Epithelzellen wurden vorübergehend mit dem pTet-Off-Plasmid und dem pTRE-Tight-Plasmid kodierenden ENaC cDNA mit einem V5-Epitop vor seinem offenen Leserahmen und einer vollständigen 3' UTR-Sequenz kotransfiziert. Die Expression von V5-ENaC und tTA-Ad mRNAs wurde mit quantitativer RT-PCR in unbehandelten Zellen gemessen. (A) Die delta-normalisierten SYBR Green Fluoreszenzsignale von V5-ENaC und tTA-Ad aus zwei separaten Transfektionen (R1 und R2) sind dargestellt. (B) Linke sgraph: mRNA-Expression von V5-ENaC und tTA-Ad in jedem Experiment (R1 und R2) werden als Zyklusquantifizierungswert (Cq) ausgedrückt. Es wird der Unterschied zwischen der V5-ENaC- und der tTA-Ad-mRNA-Expression (Cq) dargestellt. Rechte Grafik: Die Verwendung von tTA-Ad mRNA anstelle des Housekeeping-Gens ermöglicht die effiziente Normalisierung der Expression der GOI, die eine relative Expression von 0,98 in R1 im Vergleich zu r2 zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Abbaukinetik von V5-ENaC mRNA bei Verwendung des transkriptionsgesteuerten Plasmidexpressionssystems in Gegenwart und Abwesenheit von Actinomycin D. Primäre Alveolar-Epithelzellen wurden vorübergehend mit dem pTet-Off-Plasmid und dem pTRE-dichten Plasmid kotransfiziert, das mit einem V5-Epitop vor seinem offenen Leserahmen und kompletten 3' UTR-Sequenzen koaliert. Zellen, die 30 min lang mit Actinomycin D (5,0 g/ml) vorbehandelt oder unbehandelt wurden, wurden danach 15 min-6 h mit Doxycyclin (1,0 g/ml) inkubiert. Die Expression der V5-ENaC mRNA wurde mit quantitativer RT-PCR gemessen und als Prozentsatz der V5-ENaC mRNA-Expression in unbehandelten Zellen (t = 0) nach normalisierter Expression gemäß der Expression von tTA-Ad dargestellt. Die Halbwertszeit der V5-ENaC mRNA wurde durch eine einphasige nichtlineare Regression des Zerfalls für jede Zellpräparation geschätzt. Die multiple Regressionsanalyse ergab einen statistisch signifikanten Unterschied in der V5-ENaC-mRNA-Stabilität in Zellen, die mit Actinomycin D behandelt wurden, im Vergleich zu dem in unbehandelten Zellen (p < 0,0001). Für jede experimentelle Erkrankung wurden Zellen von mindestens vier verschiedenen Ratten (n 4) verwendet. Zuvor veröffentlicht als Abbildung 1 in Migneault et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Modulation der V5-ENaC mRNA-Stabilität durch unterschiedliche zelluläre und entzündliche Spannungen. Primäre Alveolar-Epithelzellen wurden vorübergehend mit dem pTet-Off-Plasmid und dem pTRE-dichten Plasmid kotransfiziert, das mit einem V5-Epitop vor seinem offenen Leserahmen und kompletten 3' UTR-Sequenzen koaliert. Die Zellen wurden 30 min mit 1,0 m Cycloheximid (CHX) (A) oder 15 g/ml LPS (B) vorbehandelt oder für 5 h mit 100 ng/mL TNF-A (C), gefolgt von einer Behandlung mit 1,0 g/ml Doxycyclin für einen Zeitraum von 15-120 min. Die Expression der V5-ENaC mRNA wurde mit quantitativer RT-PCR gemessen und als Prozentsatz der V5-ENaC mRNA-Expression in unbehandelten Zellen (t = 0) nach normalisierter Expression gemäß der Expression von tTA-Ad dargestellt. Für jede experimentelle Erkrankung wurden Zellen von mindestens drei verschiedenen Ratten (n 3) verwendet. (D) Die Halbwertszeit (t1/2) von V5-ENaC mRNA in behandelten Zellen wurde mit der Halbwertszeit von mRNA in Zellen (Strg) verglichen. Die Halbwertszeit wurde anhand der Gleichung t1/2 = ln 2/K gemessen und dann als min - SEM (einweg-ANOVA-Test und Bonferroni-Post-hoc-Test; *p < 0,01 vs. Steuerung; n 3) ausgedrückt. Angepasst an Abbildung 36, die zuvor in Migneault, F.25veröffentlicht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Verwendung der sequentiellen Klonstrategie für das Klonen von Löschungen, um die Rolle verschiedener Regionen des UTR "ENaC 3" bei der Modulation der mRNA-Stabilität aufzuzeigen. (A) Schematische Karte des V5-ENaC-Transkripts mit dem vollständigen 3' UTR, der in den pTRE-dichten Expressionsvektor eingefügt wird. Der offene Leserahmen wird als graues Kästchen dargestellt, während der 3' UTR als weißes Feld dargestellt wird. Der 3' UTR-Anteil der ENaC mRNA wird für den Klon mit einer kompletten 3' UTR und für die verschiedenen Deletionsmutanten (Del 1 bis Del 4) dargestellt. (B) Primäre Alveolare epithelische Zellen wurden vorübergehend mit pTRE-dichten Plasmiden kotransfiziert, die verschiedene UTR-Deletionsmutanten mit dem pTet-Off-Plasmid kodieren, das tTA-Ad ausdrückt, um die spezifische Expression des Konstrukts und seine Hemmung durch Doxycyclin zu ermöglichen. Zweiundsiebzig h nach der Transfektion wurden die Zellen 15 min bis 6 h mit Doxycyclin (1,0 g/ml) behandelt. Die Expression von V5-ENaC mRNA wurde mit quantitativer RT-PCR gemessen und als Prozentsatz der V5-ENaC-mRNA-Expression in unbehandelten Zellen (t = 0) nach normalisierter Expression gemäß der Expression von tTA-Ad dargestellt. Die Halbwertszeit von V5-ENaC mRNA für jedes Konstrukt wurde anhand der Ratenkonstante (K) der V5-ENaC mRNA-Abbaukurve mit der folgenden Gleichung geschätzt: t1/2 = ln 2/K. Für den Klon mit dem kompletten 3' UTR (Comp) und für die Del 1 bis Del 4 3' UTR-Löschmutanten wird der V5-ENaC mRNA-Zerfall angezeigt. Die Halbwertszeit (t1/2) des mRNA-Zerfalls wird für jeden Klon angegeben. Im unteren rechten Quadranten zeigt das Diagramm einen Vergleich der für jeden Klon geschätzten t1/2-SEM-Werte. p < 0,05 zwischen den verschiedenen Gruppen nach dem Kruskal-Wallis-Test. *p < 0,05 nach Dunns Post-hoc-Test im Vergleich zum kompletten 3' UTR. 0,05 nach Dunns Post-hoc-Test im Vergleich zu Del 3. Für jede Versuchsbedingung wurden Zellen von mindestens fünf verschiedenen Tieren (n 5) verwendet. Angepasst an die Abbildungen 2 und 3, die zuvor in Migneault et al.24veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Posttranskriptionelle Modulation von V5-ENaC mRNA durch die RNA-bindenden Proteine hnRNPK, Dhx36 und Tial1. (A) Primäre Alveolare epithelische Zellen wurden mit dem pTRE-dichten Plasmid kotransfiziert, das V5-ENaC mRNA zusammen mit einem Expressionsvektor für die Dx36-, hnRNPK- oder Tial1-RBPs und das pTet-Off-Plasmid kodiert. Die V5-ENaC-mRNA-Expression wurde durch RT-qPCR 72 h Posttransfektion quantifiziert und als Prozentsatz der V5-ENaC-mRNA-Expression ausgedrückt, verglichen mit der in Zellen, die nach der Normalisierung gemäß der Expression tTA-Ad mit einem leeren Vektor (pcDNA3) transfiziert wurden. Die Überexpression von Dhx36 und Tial1 hemmte die V5-ENaC mRNA-Expression signifikant, während die Überexpression von hnRNPK keine Wirkung hatte. *p < 0,05 nach dem Kruskal-Wallis-Test und Dunns Post-hoc-Test im Vergleich zum leeren Vektor; n 3 Proben von verschiedenen Tieren wurden in doppelter Ausweise für jeden Versuchszustand getestet. (B) Der proximale Teil des UTR von ENaC 3 wurde durch Klonen des distalen Bereichs der 3' UTR neben dem Stop-Codon im pTRE-dichten Plasmid (V5-ENaC-Del5) gelöscht. (C) Primäre Alveolare epithelische Zellen wurden zusammen mit dem pTet-Off-Plasmid und dem Expressionsvektor für Dhx36 oder Tial1 RBP-Überexpression mit V5-ENaC oder V5-ENaC-Del5 im pTRE-tight-Vektor kotransfiziert. Die V5-ENaC-mRNA-Expression wurde durch RT-qPCR 72 h Posttransfektion quantifiziert und als Prozentsatz der V5-ENaC-mRNA-Expression ausgedrückt, verglichen mit der in Zellen, die nach der Normalisierung nach der Expression von tTA-Ad mit einem leeren Vektor (pcDNA3) transfiziert wurden. Die Überexpression von Dhx36 und Tial1 hatte keinen Einfluss auf die V5-ENaC-Del5 mRNA-Expression. *p < 0,05 nach dem Kruskal-Wallis-Test und Dunns Post-hoc-Tests beim Vergleich der experimentellen Vektoren mit dem leeren Vektor; #p < 0,05 nach dem Mann-Whitney U-Test beim Vergleich der experimentellen Vektoren mit dem kompletten 3' UTR Mutant; n 6 für jede Versuchsbedingung. Angepasst an die Abbildungen 5 und 7, die zuvor in Migneault et al.24veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Eine | |||
| Vorlage | 3' UTR | Sinn | Sequenz |
| ENaC cDNA | vollständig | F | 5'-ATCGCAGCTAGCACCATGGGTG GTAAGCCTATCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTGAGTAC CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Del 1 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTTGTTCT GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Del 2 | R | 5'- GCACTAATCGATTTTATTAACTAA CAAGGGGGCTTTTGGG-3' |
|
| Del 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATGtGTCC CTGAAGGCAGTGAGGC-3' |
|
| Del 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTATTTCAGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Del 5 | R | 5'-ATCGCAGAATTCTCAGAGCGCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGGAGAATTCTGATGTCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Ziel | Sinn | Sequenz | |
| V5-ENaC | F | 5'-CCTAACCCTCTCTCtCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTTGCCCTTCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAGAGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGGGTATGATGCCTCC-3' | ||
Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Grundierungen. (A) Primer, die zum Klonen und Zur Erzeugung der V5-ENaC-Mutationen im induzierbaren pTRE-tight-Vektor verwendet werden. (B) Primer zur Messung der mRNA-Expression durch quantitative RT-PCR.
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Discussion
Die niedrige Transfektionsrate von Alveolarenepithelzellen in der Primärkultur war eine ernsthafte Einschränkung für die Verwendung des Tet-Off-Systems zur Beurteilung der mRNA-Stabilität in diesen Zellen. Diese Einschränkung wurde jedoch durch die Pipettenelektroporation überwunden, die eine Transfektionseffizienz von 25-30 % ermöglichte (Abbildung 1 und Abbildung 3)26.
Die Messung der Transkriptstabilität ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Modulation einer gegebenen mRNA und ihrer Auswirkungen auf die Zellhomöostase und den Stoffwechsel. Die Variation der Bioverfügbarkeit einer goI kann die Übersetzungseffizienz verändern und einen direkten Einfluss auf die Expression der goI in der Zelle haben. Aus diesen Gründen wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Halbwertszeit von mRNAs zu bestimmen. Wie oben erläutert, hat jede dieser Techniken Einschränkungen und Einschränkungen, die die ordnungsgemäße Untersuchung einer Transkriptvon interesse verhindern. Im Vergleich zu anderen Techniken hat das hier entwickelte TET-off-Modell den Vorteil, dass die Halbwertszeitschätzung einer gegebenen mRNA unter jeder experimentellen Bedingung möglich ist. Es erlaubt uns jedoch nicht, die Stabilität eines endogene Transkripts direkt zu untersuchen. Um diese Einschränkung so weit wie möglich zu überwinden, wird vorgeschlagen, die 5' UTR- und 3' UTR-Sequenzen der Transkription in das Plasmid aufzunehmen, damit das Konstrukt den endogenen Transkripten so ähnlich wie möglich ist. Die Zugabe des V5-Epitops ermöglicht die spezifische Amplifikation der Ziel-mRNA durch RT-qPCR im Vergleich zur endogenen Transkription. Was die Klonstrategie betrifft, so ist die Wahl der sequenzielle Sequenz, die vor dem Gen von Interesse eingefügt wird, entscheidend, um die Amplifikation unspezifischer Signale zu verhindern. Die Zugabe der V5-Epitopsequenz 5' des ORF ist für die spezifische qPCR-Verstärkung des Konstrukts aufgrund seiner kurzen Länge und des Fehlens seiner Expression in Alveolar-Epithelzellen notwendig. Diese Strategie bietet auch die Möglichkeit, die Modulation der Proteintranslation mit dem gleichen induzierbaren System zu untersuchen. Trotz der geringen Größe des V5-Epitops (42 nt) ist es immer noch möglich, dass dies die Stabilität der Transkription beeinträchtigen kann. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, auch andere Epitope zu testen, wie z. B. das humane Influenza-Hemagglutinin (HA) oder eine andere Sequenz, die nicht im Transkriptom der Alveolar-Epithelzellen gefunden wird.
Eine Einschränkung des Systems ist die Verwendung von Doxycyclin, um die Transkription einer goI zu hemmen. Mehrere Berichte zeigen, dass Doxycyclin einen signifikanten Einfluss auf den Zellstoffwechsel haben könnte. Die Verwendung dieses Antibiotikums in 16HBE14 Bronchialzellen reduziert die Proliferation und erhöht die Sterblichkeit durch Apoptose27. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Doxycyclin bereits an der Modulation der LPS-Entzündungsreaktion beteiligt ist28. Daher könnte dieses Antibiotikum Außerhalb des Ziels Effekte haben, die die mRNA-Stabilität einer bestimmten goI beeinflussen können. Aus diesen Gründen bewerteten wir die Auswirkungen von 1 g/ml Doxycyclin über einen Zeitraum von 24 h auf nicht transfizierte Zellen und stellten fest, dass sie keine Veränderung der endogenen ENaC-mRNA-Expression induzierten (Abbildung 2). Diese Konzentration wurde gewählt, weil sie weit verbreitet ist, um die Transkription des Tet-Off-Systems vollständig zu hemmen und wird empfohlen, zytotoxische Wirkungen zu minimieren29. Wir empfehlen, diese Konzentration in Alveolar-Epithelzellen zu verwenden und empfehlen, die optimale Konzentration für die Untersuchung anderer Gene oder die Verwendung anderer Zelltypen mit dem Tet-Off-System zu validieren.
Unser System nutzt die konstitutive Expression der GOI, bis ihre Transkription durch Doxycyclin gehemmt wird. Es wurde vorgeschlagen, dass übermäßige mRNA-Konzentrationen für die Zelle toxisch sein und ihren Stoffwechsel beeinflussen können. Dies könnte zu einer Änderung der Stabilität des GOI-Transkripts führen, was zu einer schnellen Verschlechterung durch nichtphysiologische Überexpression30führen könnte. Im Fall unseres Tet-Off-Modells wurde eine solche Toxizität nicht beobachtet, da die transfizierten Zellen eine Morphologie zeigten, die der von gesunden nicht transfizierten Zellen ähnelte (Daten nicht dargestellt). In Übereinstimmung mit Tani et al.31, der die Gültigkeit des Tet-Off-Systems bei der Bestimmung der Halbwertszeit einer mRNA nachgewiesen hat, zeigten unsere Ergebnisse, dass das Tet-Off-System in alveolarepitheliale Zellen nicht toxisch ist und eine Halbwertszeit für die "ENaC mRNA" ergibt, die nicht die Überstabilisierung widerspiegelt, die in Gegenwart von Transkriptionsinhibitoren wie Actinomycin Dberichtetwurde .
Die Entwicklung dieses Systems zur Messung der Halbwertszeit von mRNA stellt die Ergebnisse in Frage, die beobachtet wurden, wenn die Stabilität von Transkripten in Gegenwart von Transkriptionsinhibitoren wie Actinomycin D gemessen wurde. Diese Methode zeigt, dass eine Transkript-Halbwertszeit viel kürzer sein kann als bisher gemessen.
Unser Modell eignet sich sehr gut für die Untersuchung der posttranskriptionischen Modulation eines bestimmten Transkripts unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich pro-inflammatorische Erkrankungen oder RBP-Überexpression, sowie nach der Behandlung mit Silencing RNA. Darüber hinaus ermöglicht es die Charakterisierung von unübersetzten Regionen, die für die posttranskriptrale Modulation von mRNAs unter pathophysiologischen Bedingungen, die alveolare Epithelzellen beeinflussen, wesentlich sind.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Francis Migneault wurde durch ein Stipendium des Quebec Respiratory Health Network und des Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Lungentrainingsprogramms, ein Studium der FRSQ und ein Studentenwerk der Faculté des études Supérieures et unterstützt. Postdoktoranden, Université de Montréal. Diese Arbeit wurde vom Gosselin-Lamarre-Lehrstuhl für klinische Forschung und den Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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