Summary
このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。
Abstract
膵島移植は、1型糖尿病に対する十分に確立された治療療法である。腎臓カプセルは、げっ歯類モデルにおける小便の移植に最も一般的に使用される部位である。しかし、タイトな腎臓カプセルは、大型動物およびヒトにおける十分な小島の移植を制限する。新しい皮下空間である創尿下白脂肪組織(ISWAT)は、小便座移植にとって潜在的に貴重な部位であることが判明した。このサイトは、他の皮下空間よりも優れた血液供給を有する。また、ISWATは、腎臓カプセルよりも大きな小便の質量を収容し、それに移植することは簡単である。本稿では、同系糖尿病マウスレシピエントのISWAT部位におけるマウスの膵野の分離および移植の手順について説明する。このプロトコルを用いて、マウス膵島を、ISWAT部位の精製された小島を固定するために標準的なコラゲナーゼ消化および基質膜マトリックスヒドロゲルによって単離した。レシピエントマウスの血糖値を100日以上モニタリングした。この座子移植片は、組織学的分析のために移植後100日目に回収した。本稿に記載されているISWATサイトにおける、このサイトにおける小便の移植に関するプロトコルは、簡素で効果的である。
Introduction
国際糖尿病連盟(IDF)1の統計データによると、1型糖尿病(T1DM)の世界的な発生率と罹患率は急速に上昇しています。Islet移植は、T1DM4を治療するための最も有望なアプローチの1つである。エドモントンプロトコル2を用いた臨床島移植で行われた大きなブレークスルーが報告されていたので、5年後のT1DMレシピエントにおける機能性のスチーム移植片生存率は現在約50%3に達する。
これまで、肝臓、腎臓カプセル、脾臓、筋肉内領域、皮下空間、骨髄、およびオーメンタルポーチなどのいくつかの移植部位が実験的なポレット移植5、6、7について検討された。上記のサイトのいくつかは臨床設定8でテストされています。肝臓への小便の移植は現在9の臨床応用において最も広く用いられている方法であるが、この部位を使用する場合に対処すべきいくつかの重要な問題がある。例えば、即時血液媒介性炎症反応(IBMIR)および酸素供給不良10、11によって引き起こされる移植された小島の早期喪失を低減する方法、および必要に応じてこの島移植片を取り出す方法は、肝臓にびらんに局在化するためである。腎カプセルはげっ歯類のレシピエントにとって理想的な部位である可能性があります。しかし、タイトな腎臓カプセルは、ヒトにおける十分な同種間血島の移植を制限し、臨床的に使用される高度に精製されたブタ島の製剤に起因する異種移植に適している可能性があるが5、12。従って、より適した部位を探して、このサイトを、小便の移植が進んでいる。
皮下腔は、そのアクセス性のために、小便座移植のための臨床的に適用可能な部位として使用され得る。しかしながら、皮下空間への小島移植の効率は極めて低く、したがって高血糖13を逆にするために比較的多数の島を必要とする。最近、日本の研究チームは、ISWAT、肝臓14と比較してマウスモデルでの小便移植に優れた新しい皮下サイトを発見しました。ISWATは上胃動脈および静脈を含むので、豊富な血液供給は、小便移植片の再血管再生を保証することができる。本稿では、ISWATにおける同系マウス島の固定に基質膜マトリックスヒドロゲルを用いた容易な移植方法を提案する。このプロトコルは、小便の移植に有効であることが証明されています。
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Protocol
この議定書のすべての手続きは、深セン第二人民病院の倫理審査委員会の動物福祉の原則に従った。この座レット移植片のレシピエントとドナーは、広東省医療動物センターから購入した8~10週齢のC57BL/6雄マウスであった。収穫、単離、培養、または収穫した細胞の投与の手順を無菌条件で行った。
1. アイレットの準備
- コラゲナーゼV型働き液を調製する。コラゲナーゼタイプVの重さを測り、D-Hankのバッファーで1mg/mLの最終濃度に溶解し、0.22μmの注射器駆動フィルターユニットと60mLシリンジを使用してフィルターを適用し、氷でプレクールにします。ドナー受信者ごとに5 mLのボリュームが必要です。
- 10週齢のC57BL/6雄マウス(23±2g)を頸部脱臼によって安楽死させ、マウスの外部部分に75%エタノールを数秒間スプレーする。一方、5 mLシリンジをコラゲラーゼ溶液で満たし、曲げ鈍い尖った灌流針(32G)で注射針を交換する。
- ドナーマウスを氷袋の上の氷袋の上の球面の位置に置き、陰部の皮膚にまっすぐに尖った眼科はさみを使って横方向の開口部を切り、皮膚を頭に向かって完全に切開する。その後、陰部からxiphoidプロセスへのV切開を介して腹部を完全に開きます。
- 胆嚢と肝臓を再配置することによって、一般的な胆管の全長を露出させる。次に、一般的な胆管の十二指腸開口部を血管クランプでクランプし、胆嚢の小さな開口部を切断します。
注:肝臓や胆嚢への逆流を防ぐために最適な針の配置が重要です。 - ステップ1.2で灌流針を用いて胆嚢開口部から共通の胆管をカニューレートし、次いで膵臓にコラーゲン溶液を〜2mL注入する。その後、浸透した膵臓を腸、胃、脾臓から2組の非侵襲的マイクロテーゼを使用して分離し、氷上の50mL円錐形チューブに入れる。
注: すべてのドナー マウスに対してこのプロセスを繰り返します。3つの連続的に浸透した膵臓(40分以内の間隔)は各膵臓のためのコラゲナーゼの水溶液の3 mLが事前に満たされた50 mL円錐形の管に結合することができる。 - 膵臓あたり100 μL DNase I(10 mg/mL)を50 mL円錐形のチューブに加え、3~5分間円錐管を振って37°Cの水浴中で膵臓を消化します。
注:チューブを10回間隔で激しく振って、水浴中の消化前に組織の関連付けを解除し、消化中にチューブを適度に振ります。 - 停止溶液(2.5 mg/mL BSA-HBSS溶液)を50mLの最終体積まで添加して消化を遮断し、4°Cで750 x gの速度まで遠心分離して素早く停止します。
- 上清を注ぎ、BSA-HBSSの15〜25mLで静かに再懸濁してペレット2xを洗います。パルスは、ステップ1.7で概説した速度条件と同じ速度条件でチューブを1分間遠心します。
- 上清を注ぎ、3本の円錐形チューブのペレットを50mLの円錐形チューブにプールします。ペレットを総体積10mLのヒストリフィマ-1119で再懸濁する。均質に混合し、チューブの側面に沿ってゆっくりとピペットを入れて、ヒストリフィム-1077とHBSSの5 mLを順次加えます。
- 4 °Cで750 x gで遠心分離機内のサンプルを10分間回転させます。
- HBSS/ヒストリペティフィケーション-1077インターフェースから使い捨て5 mLパスツールピペットを使用して50mL円錐形チューブに小島を吸引し、BSA-HBSSを最終体積50mLに、4°Cで750 x gで遠心分離機を加えます。
- 上清を注ぎ、BSA-HBSSの30 mLを使用して小島を洗います。4 °Cで750 x gで1分間遠心分離。
- チューブあたり30 mLの培養培地(10%FBS-1%P/S-CMRL-1066)を使用して小島を再懸濁し、直径10cmの軽密な培養皿に注ぎます。ステレオ顕微鏡では、200 μLゲルローディングピペットチップを使用して、その形態に基づいて溶液から小島をピックします(すなわち、回転楕円体、白)。10mLの培養液を用いて未処理の細胞培養皿に入れる。
注:第一のピッキング後に最初に精製された小島の純度が最適でない場合は、第二のハンドピッキングを行うことができます。 - 光顕微鏡でジチゾン染色で選ばれた小島の純度を確認し、蛍光顕微鏡で染色するフルオレセインジアセテート(FDA)-ヨウ化プロピジウム(PI)による小島の生存率を検出します。
- 分離された小島を培養した後、培養液中の培養液(工程1.13のように)を37°Cでインキュベーターで、移植前に95%の空気−5%CO2で培養した。
2. ISWATの入り口移植
- 8週齢の雄C57BL/6マウス(22±2g)の1回のストレプトゾトシン注射(STZ)で糖尿病を誘発する。日目-4、マウスを〜4〜6時間速く、次いで0.1 Mクエン酸緩衝液(pH 4.4)を用いて2%STZ溶液を調製した。体重を量り、緩衝液中に再懸濁し、180mg/kgの用量でマウスを腹腔内に注入する。
注:STZソリューションは、使用前に新たに準備し、その光感度のためにアルミニウム箔で覆う必要があります。15~20分以内に活動を失うので、すぐに使用してください。 - STZ注射マウスの尾静脈を穿刺し、1日-1日と0日目の午前10時頃に血液を採取し、テストストリップと基本的な血糖値モニタリング器具を使用して非空腹血糖レベルを測定する。2回連続検査日の血糖値が両方とも少なくとも20ミリモル/Lである場合、マウスは、島移植レシピエントとして使用されます。
- 0日目に、すべてのレシピエントマウスの重みとマークを付けます。腹腔内60mg/kgペントバルビタールナトリウムを注射して各レシピエントを麻酔する。
注:麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを管理します。レシピエントマウスに離脱反射がない場合、麻酔のレベルは手術に十分です。ない場合, 追加の投与 10 mg/kg ペントバルビタールナトリウム.使用したペントバルビタールナトリウムを、2%の濃度で滅菌生理食塩水で希釈した(m/v)。 - -20°Cの冷凍庫からヒドロゲルを取り出し、解凍できるように氷の上に保管します。ハイドロゲルは4~10°Cの液体で、より高い温度で固化します。
- 200 μLの培養培地を用いて、各レシピエントに対して、各レシピエントに対して、1.5 mL遠心管(ステップ1.13のように)を200μLの培養培地で選び、移植の準備ができるまで氷の上に置いてください。
- 75%エタノールを用いてレシピエントの左のイングイナル領域をスワブする。それを上方に置き、外科テープを使用して4つの肢を固定する。電気バリカンで外科現場の周りの髪を剃り、ヨードファーで領域を綿棒。
- この領域に眼科用ハサミと非侵襲的な微小間を用いて垂直皮膚切開を行い、ISWATの下腕幹動脈および静脈を特定し、血管の上に小さなポケットを作る。
- 200 x gで30sの小島チューブを回転させ、できるだけ上清を取り除く。完全に解凍されたヒドロゲルの20μLを吸引し、それを小島と共に管に積み込む。気泡を避け、穏やかに小島を再中断します。
- 200 μLピペットチップを持つ受け手のポケット(ステップ2.7)にチューブ内の全体のアイレットヒドロゲル混合物を送ります。
注:このプロセスには、非侵襲的なマイクロティセザーを使用してポケットの端を拾うための技術者と、ポケットに小便座の混合物を送り込む2人の技術者が必要です。 - 20 μLのセファロスポリン(~5~10mg)を、小島ヒドロゲル混合物が完全に固化した後に移植部位に加え、5-0の外科用縫合糸を使用して連続縫合法で筋肉と皮膚を閉じます。
注:ヒドロゲルは、体温のために固めるために約3分を必要とします。 - 受信者を清潔なケージに入れ、サーマルパッドを使用して暖かく保ちます。受信者が完全に回復し、自律的に移動を開始するまで監視を続けます。その後、0.1 mg/Kg用量に従って、0.03 mg/ml ブプレノルフィンを滅菌生理食塩水で腹腔内投与する。
- 各受信者マウスに対して、ステップ 2.3 ~ 2.11 を繰り返します。
- 最初の月の週に3~4倍、その後1週間で1~1xのレシピマウスの非空腹血糖レベルを測定します(ステップ2.2のように)。
- フォローアップの終わり(移植後100日目)に、麻酔下(ステップ2.3のように行う)の下で、ステップ2.6に記載の無菌工程に続いてレシピエントから移植片を持つISWATを切除する。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)の染色およびインスリンおよびグルカゴンの免疫蛍光の組織学的プロトコルに従ってホルマリンおよびパラホルムアルデヒドで組織を固定する。
- セファロスポリンを追加し、ステップ2.10のようにレシピエントの切開を閉じ、ステップ2.11のように回復の準備をします。
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Representative Results
このプロトコルでは、マウスのマウスの準備と ISWAT サイトへの小便の移植の 2 つの手順が導入されています。第1の手順では、ヒストモメ-1119およびヒストモメ不全-1077および追加の手摘みステップで精製するV型コラゲターゼ溶液を浸透させ、消化した後、単離されたマウス島は移植のために十分に純粋である(図1に示すように)、そして生存率が高い孤立した島を移植に使用する(図2参照)。第2の手順では、STZ化学物質による糖尿病誘導が重要である。STZの最適用量は、マウスの株と年齢に依存し、糖尿病の成功した誘導は、2つの連続した日に同時に16.7 mmol /L以上の非高速血糖レベルによって定義される。糖尿病マウスは、数週間の膵の移植なしで生き残ることができます.ISWAT部位に移植される前に、この小片移植片をヒドロゲルと完全に混合し、移植片をIWSATに固定するために数分を通過する必要があります(図3)。ISWATに移植すると、この血小移植片は約1ヶ月間高血糖を逆転させ、レシピエントマウスの体重は徐々に増加した(図4)。移植後100日目に、組織学的分析のために小便移植片を取り出した(図5)。図4に示すように、試験日の午前10時~に非絶食血は移植片を除去した後急速に上昇した。H&E染色は、この小片移植片がそのまま残っていることを証明した。インスリンおよびグルカゴン免疫蛍光染色は、移植された小島が良好に機能することを示した(図5)。
図1:膵臓灌流および消化および膵島の精製。(A) 膵臓灌流の過程 (A1–A6)(B) 膵臓消化の終点で、粒子が懸濁している。(C) 光顕微鏡下で観察した精製小島。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:精製された小島の純度と生存率(A) ジチゾン染色により純度を決定するアイズレット。FDA-PI二重染色によって評価されるアイレットの生存率。(B) 小島の光顕微鏡像。(C) FDA染色は、生細胞を緑色で示す。(D) PI蛍光赤は死細胞を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アイレット移植(A) 麻酔後、手術用の刃で移植部位の毛髪を剃り、手術テープで腹部の上方に受け手の手足を固定する。(B) 腹腔内切断後、ISWAT移植部位が露出する。(C) ヒドロゲルに混合された島は、ISWAT部位にゆっくりと移植される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:血糖値と体重移植同系島で移植したレシピエントマウスの非空腹血糖レベル(赤線)および体重(青線)(n=7)。黒い矢印は移植片が移植後100日に除去されたことを示す。血糖レベルの変動は様々なレシピエントを比較して観察され、その違いは、位の質と機能の違いを反映した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヒストロジーと免疫蛍光。グラフト切片はH&E、DAPI(核)、抗マウスインスリン抗体、および抗マウスグルカゴン抗体で染色した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
膵臓膵島移植は、T1DMを治療するための有望な治療法です。この療法の効果は多くの要因によって影響を受け、小便座移植のための最適な部位を選択することは非常に重要である。この小便座移植の理想的な解剖学的部位には、単純な移植、生検、移植片の検索手順に対するアクセス性があります。合併症を減らしました。血糖コントロールの高い成功率;そして、小口移植片15、16の長期生存。
私たちのチームは以前、マウスモデル17の大分体における小分けの小分けの小口移植のためのプロトコルを説明しました。大分では、正常な血糖値は、腎臓カプセル下の小便移植と比較して後に達成された。その結果、小島を移植するための他の部位が探索された。
ISWATは、肝臓14での移植と比較してレシピエントの高血糖を逆転させるのに必要な小さい小便島として、肝臓の代替部位として報告された。また、移植は容易であり、移植片14を可視化・取り出すのと同じである。我々の研究では、レシピエントマウスは、血小移植後1ヶ月以内に高血糖を減少させ、ISWATが十分なインスリンを産生するために腎臓カプセルよりも長く必要であることを示唆している。従ってこれらの結果は、ISWAT部位が、酸素、栄養素、および移植片の再形成のための拡散のためのより良い条件を提供しないかもしれないことを示している。
孤立した小島の高純度および活性は、同島移植設定における糖尿病レシピエントの高血糖を逆転させるために極めて重要であり、また膵島分離プロトコルは異なる研究者18、19、20の間で同じではない。消化時間は、高品質の島を得るために非常に重要です。我々の経験では、それは5分を超えてはならない。分離された小島は、消化手順21の機械的ストレスからの回復を可能にするために一晩37°Cのインキュベーターで培養することができる。
ここで使用されるヒドロゲルは、ラミニン、コラーゲンIV、および成長因子17を含む基下膜マトリックスである。それは体温に達したときに固まり、ISWATサイトの小株移植片を保つのに役立ちます。それは小島に毒性はないが、ヒドロゲルの存在が島の生着および機能に影響を及ぼすかどうかはまだ決定されていない。
まとめて取り上げ、ISWATはげっ歯類モデルにおける小さな移植のための新しい皮下空間であり、臨床的に使用される可能性がある。完全な評価のためには、より大きな哺乳類前臨床モデルを用いた追加の研究が必要である。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告していない。
Acknowledgments
この研究は、中国の国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)広東省の高レベル病院建設のための特別資金(2019年)、深センの三明医学プロジェクト(SZSM201412020)、高レベル基金からの助成金によって支えられました。深センの医療規律建設(2016031638)、深セン科学技術財団(JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171714171314171333年、深セン保健家族計画委員会(SZXJ2010102010100年10月20日)中国広東省科学研究財団(A2019218)、中国ポドカルサイエンス財団(2018M633218)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
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