Summary

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Published: February 16, 2020
doi:

Summary

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Abstract

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.

Introduction

Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.

In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.

Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.

Protocol

Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. 1. Inselvorbereitung Bereiten Sie e…

Representative Results

In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfäh…

Discussion

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfrist…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Materials

0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

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Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

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