Summary

Modèle de transplantation inguinal Subcutaneous De tissu adipeux blanc (ISWAT) des îlots de Murine

Published: February 16, 2020
doi:

Summary

Dans ce protocole, une méthode d’isolement et de transplantation d’îlot de murine dans le tissu sous-cutané sous-cutané inguinale d’adipeux est décrite. Des îlots murines syngénéiques isolés sont transplantés dans un récipient de murine utilisant un hydrogel de membrane de sous-sol. Le taux de glucose sanguin des receveurs est surveillé, et l’analyse histologique des greffes d’îcles est effectuée.

Abstract

La transplantation d’îlot pancréatique est un traitement thérapeutique bien établi pour le diabète de type 1. La capsule rénale est le site le plus couramment utilisé pour la transplantation d’îlots dans les modèles de rongeurs. Cependant, la capsule rénal serrée limite la transplantation d’îlots suffisants chez les grands animaux et les humains. Le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal (ISWAT), un nouvel espace sous-cutané, s’est avéré être un site potentiellement valable pour la transplantation d’îlots. Ce site a un meilleur approvisionnement en sang que d’autres espaces sous-cutanés. En outre, l’ISWAT accueille une plus grande masse d’îlot que la capsule rénale, et la transplantation en elle est simple. Ce manuscrit décrit la procédure de l’isolement et de la transplantation d’îlots de souris dans le site ISWAT des destinataires diabétiques syngénétiques de souris. Utilisant ce protocole, les îlots pancréatiques murines ont été isolés par la digestion standard de collagène et un hydrogel de matrice de membrane de sous-sol a été employé pour fixer les îlots purifiés dans le site d’ISWAT. Les niveaux de glucose sanguin des souris destinataires ont été surveillés pendant plus de 100 jours. Des greffes d’îlot ont été récupérées au jour 100 après transplantation pour l’analyse histologique. Le protocole de transplantation d’îlots dans le site ISWAT décrit dans ce manuscrit est simple et efficace.

Introduction

L’incidence et la prévalence mondiales du diabète sucré de type 1 (T1DM) augmentent rapidement, selon les données statistiques de la Fédération internationale du diabète (FDI)1. La transplantation d’îlots est l’une des approches les plus prometteuses pour le traitement du T1DM4. Puisque la grande percée faite dans la transplantation clinique d’îlot utilisant le protocole2 d’Edmonton a été rapportée, la survie fonctionnelle de greffe d’îlot dans des destinataires de T1DM après 5 ans atteint maintenant environ 50%3.

Dans le passé, plusieurs sites de transplantation, tels que le foie, la capsule rénale, la rate, la région intramusculaire, l’espace sous-cutané, la moelle osseuse et la poche mentale ont été explorés pour la transplantation expérimentale d’îlots5,6,7. Certains des sites ci-dessus ont été testés dans des milieux cliniques8. Bien que la transplantation d’îlot dans le foie reste la méthode la plus largement utilisée dans l’application clinique à l’heure actuelle9, il ya plusieurs problèmes importants à traiter lors de l’utilisation de ce site. Par exemple, comment réduire la perte précoce des îlots transplantés causée par la réaction inflammatoire instantanée de médiation sanguine (IBMIR) et l’approvisionnement en oxygène pauvre10,11 et comment récupérer les greffes d’îlots si nécessaire, parce qu’elles localisent diffusement dans le foie. La capsule rénale peut être un site idéal pour les receveurs de rongeurs. Cependant, la capsule rénaux serrée limite la transplantation d’îlots allogéniques suffisants chez l’homme, bien qu’il puisse être un meilleur ajustement pour la xénotransplantation d’îlot due aux préparations fortement purifiées d’îlot porcin employée médicalement5,12. Par conséquent, la recherche d’un site plus approprié pour la transplantation d’îlots est en cours.

L’espace sous-cutané peut être utilisé comme site cliniquement applicable pour la transplantation d’îlots en raison de son accessibilité. Cependant, l’efficacité de la transplantation d’îlots dans l’espace sous-cutané est extrêmement faible, ce qui nécessite un nombre relativement important d’îlots pour inverser l’hyperglycémie13. Récemment, une équipe de recherche japonaise a trouvé l’ISWAT, un nouveau site sous-cutané supérieur pour la transplantation d’îlots dans un modèle murine par rapport au foie14. L’ISWAT contient l’artère épigastrique et la veine, de sorte que l’approvisionnement en sang riche peut assurer la revascularisation de greffe d’înet. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode d’implantation facile utilisant un hydrogel de matrice de membrane de sous-sol pour fixer des îlots murines syngénéiques dans l’ISWAT. Ce protocole s’avère efficace pour la transplantation d’îlots.

Protocol

Toutes les procédures de ce protocole ont suivi les principes du bien-être animal du Comité d’examen de l’éthique du Shenzhen Second People’s Hospital. Les receveurs et les donneurs de greffe d’ît étaient des souris mâles C57BL/6 de 8 à 10 semaines achetées au Centre des animaux médicaux de la province du Guangdong. La procédure de récolte, d’isolement, de culture ou d’administration des cellules récoltées a été effectuée dans des conditions aseptiques. 1. Préparati…

Representative Results

Deux procédures sont introduites dans ce protocole : la préparation des îlots murines et la transplantation d’îlots sur le site de l’ISWAT. Dans la première procédure, après avoir perfusé et digéré avec la solution de collagène de type V, purifiant avec Histopaque-1119 et Histopaque-1077 et une étape supplémentaire de cueillette à la main, les îlots de murine isolés seront suffisamment purs pour la transplantation (comme indiqué dans la figure 1) et les îlots isolés qu…

Discussion

La transplantation d’îlot de pancréas est une thérapie prometteuse pour traiter T1DM. L’effet de cette thérapie est affecté par de nombreux facteurs et le choix d’un site optimal pour l’implantation des îîaux est extrêmement important. Le site anatomique idéal pour la transplantation d’îlots devrait avoir les caractéristiques suivantes : accessibilité pour la transplantation simple, la biopsie, et les procédures de récupération de greffe ; complications réduites; taux de réussite élevé du con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key R-D Program of China (2017YFC1103704)Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour le haut niveau Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZ Fondation de recherche scientifique de la province du Guangdong en Chine (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Materials

0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

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Cite This Article
Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

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