Summary

Quantificando o tamanho do fígado em zebrafish larval usando microscopia de campo brilhante

Published: February 02, 2020
doi:

Summary

Aqui demonstramos um método para quantificar o tamanho do fígado em zebrafish larval, fornecendo uma maneira de avaliar os efeitos das manipulações genéticas e farmacológicas no crescimento e desenvolvimento do fígado.

Abstract

Em vários modelos transgênicos de zebrafish do carcinoma hepatocelular (CcH), hepatomegaly pode ser observado durante estágios larvais precoces. Quantificar o tamanho do fígado larval em modelos de HCC de zebrafish fornece um meio de avaliar rapidamente os efeitos das drogas e outras manipulações em um fenótipo relacionado ao oncogene. Aqui mostramos como consertar larvas de zebrafish, dissecar os tecidos ao redor do fígado, fotografar fígados usando microscopia de campo brilhante, medir a área hepática e analisar os resultados. Este protocolo permite quantificação rápida e precisa do tamanho do fígado. Como este método envolve medir a área hepática, pode subestimar diferenças no volume do fígado, e metodologias complementares são necessárias para diferenciar entre alterações no tamanho celular e alterações no número celular. A técnica de dissecção descrita aqui é uma excelente ferramenta para visualizar o fígado, intestino e pâncreas em suas posições naturais para inúmeras aplicações a jusante, incluindo a coloração de imunofluorescência e a hibridização situ. A estratégia descrita para quantificar o tamanho do fígado larval é aplicável a muitos aspectos do desenvolvimento e regeneração hepática.

Introduction

O carcinoma hepatocelular (CCH) é a malignidade primária mais comum do fígado1 e a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer2. Para entender melhor os mecanismos da hepatocarcinogênese e identificar potenciais terapêuticas de HCC, nós e outros desenvolvemos zebrafish transgênicos nos quais a expressão específica do hepatocito de oncogenes como β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, ou Yap18 leva ao HCC em animais adultos. Nestes zebrafish, o alargamento do fígado é observado já em 6 dias após a fertilização (DPF), fornecendo uma plataforma fácil para testar os efeitos das drogas e alterações genéticas no crescimento excessivo do fígado orientado por oncogenes. Medição precisa e precisa do tamanho do fígado larval é essencial para determinar os efeitos dessas manipulações.

O tamanho e a forma do fígado podem ser avaliados semi-quantitativamente em larvas fixas de zebrafish por CY3-SA rotulando9 ou em larvas de zebrafish vivos usando repórteres fluorescentes específicos de hepatocito e microscopia dissecante5,6. Este último método é relativamente rápido, e sua falta de precisão pode ser abordada fotografando e medindo a área de cada fígado usando software de processamento de imagem7,10. No entanto, pode ser tecnicamente desafiador posicionar uniformemente todas as larvas vivas em um experimento de tal forma que a área hepática bidimensional é uma representação precisa do tamanho do fígado. Uma técnica semelhante para quantificar o tamanho do fígado envolve o uso de microscopia de fluorescência de folha de luz para quantificar o volume de fígadolarval 8, o que pode ser mais preciso para detectar diferenças de tamanho quando o fígado é expandido não uniformemente em diferentes dimensões. A classificação celular ativada pela fluorescência (FACS) pode ser usada para contar o número de hepatocitos fluorescentes rotulados e outros tipos de células hepáticas em fígados larvais8,11. Neste método, os fígados larvais são agrupados e dissociados, por isso se perdem informações sobre o tamanho e a forma individuais do fígado. Em combinação com outro método de determinação do tamanho do fígado, o FACS permite diferenciação entre o aumento do número celular (hiperplasia) e o aumento do tamanho celular (hipertrofia). Todos esses métodos empregam tecnologia de fluorescência cara (microscópio ou aparelho celular) e, com exceção da rotulagem CY3-SA, exigem rotulagem de hepatocitos com um repórter fluorescente.

Aqui descrevemos em detalhes um método para quantificar a área hepática larvalde zebrafish usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagem3,12,13,14. Este protocolo permite quantificação precisa da área de fígados individuais in situ sem o uso de microscopia de fluorescência. Ao analisar o tamanho do fígado, cegamos a identidade da imagem para reduzir o viés do investigador e melhorar o rigor científico15.

Protocol

Estudos em animais são realizados seguindo procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Utah. 1. Corrigir larvas Em 3 a 7 dias após a fertilização (DPF), eutaniza larvas com metanosulfonato de tricaina (0,03%) e coletar até 15 larvas em um tubo de 2 mL usando uma pipeta de vidro e bomba de pipeta. Lave larvas duas vezes com 1 mL de salino frio (4 °C) 1x de fosfato tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para cada…

Representative Results

Zebrafish transgênico expressando β-catenina ativada com hepatocyte(Tg(fabp10a:pt-β-cat)zebrafish) 3 e irmãos de controle não transgênicos foram eutanizados a 6 dpf e a área hepática foi quantificada usando microscopia de campo brilhante e software de processamento de imagens. Zebrafish transgênico aumentaram significativamente o tamanho do fígado (0,0006 cm2) em comparação com seus irmãos não transgênicos (0,0004 cm2, p < 0,0001; <st…

Discussion

A quantificação do tamanho do fígado é crucial em estudos que visam entender o desenvolvimento do fígado, a regeneração e a oncogênese. O protocolo descrito aqui é uma técnica relativamente rápida, fácil e barata para quantificação do tamanho do fígado em zebrafish larval. Exercitar a cautela adequada ao realizar certos aspectos do protocolo pode ajudar no aumento da precisão dos resultados e diminuição da frustração.

A fixação adequada das larvas é crucial para obter am…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de reconhecer Maurine Hobbs e o Centralizado Zebrafish Animal Resource (CZAR) da Universidade de Utah por fornecer maçaria de zebrafish, espaço de laboratório e equipamentos para realizar partes desta pesquisa. A expansão do CZAR é apoiada em parte pela subvenção do NIH # 1G20OD018369-01. Também gostaríamos de agradecer a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e o Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility por cuidados com zebrafish. Gostaríamos de agradecer a Kenneth Kompass por ajuda com a programação R. Este trabalho foi financiado em parte por subsídios da Huntsman Cancer Foundation (em conjunto com a concessão P30 CA042014 concedida ao Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Materials

Camera for dissecting microscope Leica, for example
Dissecting microscope Leica, for example
Fine (Dumont #5) forceps Fine Science Tools 11254-20
Glass pipets VWR 14672-608
Image analysis software Image J/FIJI ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome
Methyl cellulose Sigma M0387
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline Various suppliers
Pipette pump VWR 53502-233
Plastic Petri dishes USA Scientific Inc 2906
Pyrex 9-well round-bottom glass dish VWR 89090-482
Software for blinding files R project R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/
Scientific graphing and statistics software GraphPad Prism
Spreadsheet program Microsoft Excel
Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) Western Chemical 200-226
Very fine (Dumont #55) forceps Fine Science Tools 11255-20

References

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Cite This Article
Kotiyal, S., Fulbright, A., O’Brien, L. K., Evason, K. J. Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy. J. Vis. Exp. (156), e60744, doi:10.3791/60744 (2020).

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