Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات الحرجة المطلوبة لإنشاء وتنمية ثقافات الخلايا البُلية القرنية من النباتات المنفّزة للأنسجة البشرية أو الأغنام. كما يتم تقديم طريقة لباطن القرنية الخلايا الفرعية على المواد الحيوية الميمبية.
Abstract
الخلايا الانجيلية القرنية الثقافات لديها ميل للخضوع للانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) بعد فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. EMT هو ضار للخلايا لأنه يقلل من قدرتها على تشكيل طبقة ناضجة ووظيفية. هنا، نقدم طريقة لإنشاء وsubculturing الإنسان والأغنام الخلايا القرنية الخلايا البُنالتي ة التي تقلل من فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. تؤخذ النباتات الإكسابيتية لبطانة القرنية/غشاء ديسميت من القرنيات المانحة وتوضع في زراعة الأنسجة في ظل ظروف تسمح للخلايا بالهجرة الجماعية على سطح الثقافة. وبمجرد تأسيس ثقافة ما، يتم نقل النباتات الجديدة إلى أطباق جديدة لبدء ثقافات جديدة. يستخدم Dispase II لرفع كتل من الخلايا بلطف من لوحات زراعة الأنسجة للاستزراع الفرعي. تعتبر ثقافات الخلايا البُلية القرنية التي تم تأسيسها باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لنقلها إلى أغشية المواد الحيوية لإنتاج طبقات خلايا مصممة على الأنسجة لزرعها في التجارب على الحيوانات. يتم وصف جهاز مصنوع خصيصًا لدعم الأغشية الحيوية أثناء زراعة الأنسجة ، ويتم تقديم مثال على الكسب غير المشروع المهندس بالأنسجة المكون من طبقة من الخلايا البطانة القرنية وطبقة من الخلايا النجمية القرنية على جانبي غشاء الكولاجين من النوع الأول.
Introduction
القرنية هي نسيج شفاف يقع في الجزء الأمامي من العين. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية: طبقة ظهارية على السطح الخارجي، طبقة ستروما الأوسط، وطبقة داخلية تسمى بطانة القرنية. بطانة القرنية هو طبقة أحادية من الخلايا التي تقع على غشاء الطابق السفلي يسمى غشاء Descemet ويحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم كمية السوائل التي تدخل ستروما من الفكاهة المائية الكامنة. الكثير من السوائل داخل ستروما يسبب تورم القرنية, التعتيم وفقدان البصر. وبالتالي فإن البطانة أمر حيوي للحفاظ على الرؤية.
يمكن أن يصبح بطانة القرنية مختلة لعدد من الأسباب بما في ذلك الشيخوخة والمرض والإصابة ، والعلاج الحالي الوحيد هو جراحة زرع الأعضاء. خلال هذه الجراحة ، تتم إزالة البطانية وغشاء Descemet من قرنية المريض واستبدالها بطعم البطانة وغشاء Descemet الذي تم الحصول عليه من القرنية المانحة. العديد من الطعوم بطانة تحتوي أيضا على طبقة رقيقة من الأنسجة سترومال للمساعدة في التعامل مع وتعلق القرنيةالمضيفة 1.
في جميع أنحاء العالم ، فإن الطلب على أنسجة القرنية المانحة لعمليات زرع الأعضاء أكبر من الكمية التي يمكن توفيرها من قبل بنوك العيون2. لذلك كان هناك دافع لتطوير زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة التي يمكن استخدامها لتخفيف هذا النقص3. ويستند الأساس المنطقي لذلك على حقيقة أنه في الوقت الحالي ، لا يمكن نقل البطانة من القرنية الفردية إلا إلى مريض واحد ، ومع ذلك ، إذا تم توسيع الخلايا البطانية القرنية أولاً ونمت على السقالات الحيوية في زراعة الأنسجة ، يمكن استخدامها لعلاج مرضى متعددين.
التحديات الرئيسية التي تحتاج إلى معالجة قبل زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة تصبح خيارا ممكنا للجراحين وتشمل: (1) إنشاء تقنيات لتوسيع خلايا بطانة القرنية ذات جودة عالية ولإنتاج ناضجة و طبقات الخلايا البطانية القرنية الوظيفية في المختبر، و (2) إنشاء تقنيات لزراعة الخلايا على السقالات الحيوية لإنتاج الطعوم المهندسة الأنسجة التي تساوي، أو أفضل من، الطعوم المشتقة من القرنية المانحة التي تستخدم حاليا.
الخلايا القبطانية القرنية لديها إمكانات التكاثر منخفضة جدا في الجسم الحي ولكن يمكن تحفيزها لتقسيم في المختبر4. ومع ذلك ، لديهم ميل قوي للخضوع في المختبر الظهارية إلى mesenchymal الانتقال (EMT) ، مما يقلل من قدرتها على تشكيل ناضجة ، طبقة البطانية وظيفية. مشغلات معروفة لEMT في الخلايا البُنفية القرنية تشمل التعرض لعوامل نمو معينة وفقدان الاتصال من خلية إلى خلية5. وبالتالي فمن المحتم تقريبا أن ثقافات الخلايا البطانة القرنية التي هي الانزيمية المنفصلة خلال الثقافة الفرعية سوف تخضع للتغييرات المرتبطة EMT. هنا ، نقدم طريقة زراعة الخلايا للخلايا البُنَية القرنية البشرية أو الخرافية التي تم تصميمها لتقليل اضطراب الاتصالات من خلية إلى خلية أثناء مراحل العزل والتوسع والثقافة الفرعية ، للحد من احتمال ية حدوث EMT. وعلاوة على ذلك، فإننا نبين كيف يمكن إنتاج الطعوم المهندسة من الأنسجة التي تشبه البطانة المشتقة من القرنية المانحة/الطعوم النسيجية/الأنسجة النجمية من خلال نمو طبقات الخلايا المستزرعة على جانبي غشاء المادة الحيوية في جهاز تركيب مصنوع خصيصًا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على القرنيات البشرية بموافقة المانحين للبحث من بنك كوينزلاند للعيون واستخدمت بموافقة أخلاقية من مستشفى مترو ساوث ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للدائرة الصحية (HREC/07/QPAH/048). تم الحصول على قرنيات الأغنام من الحيوانات المنهوبة في مرفق هيرستون للبحوث الطبية التابع لجامعة كوينزلاند بموجب اتفاق لتقاسم الأنسجة.
1. إعداد أدوات تشريح
- تعقيم اثنين من أزواج من عدد 4 ملقط صانع الساعات إما عن طريق نقع لهم في حل من الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقيقة أو عن طريق التعقيم لهم.
2. إعداد لوحات ثقافة الثقافة المتوسطة والأنسجة
- إعداد 100 مل من وسط الثقافة التي تحتوي على Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1، 5٪ مصل الأبقار الجنين و 100 U/mL القلم / العقدية. هذه الوسيلة الثقافية كافية لثقافات الخلايا القانية القرنية الأغنام، ومع ذلك، لثقافات الخلايا البُنبوبية القرنية الإنسان ينبغي أن تستكمل المتوسطة مع 50 ميكروغرام/مل مستخلص الغدة النخامية البقرية، 0.08٪ كبريتات شوندرويتين، 200 ميكروغرام/مل كلوريد الكالسيوم و 0.3 mM L-حمض الأسكوربيك 2-الفوسفات. يمكن تخزين الوسط الثقافي في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين.
- معطف الآبار من 6-بئر لوحة زراعة الأنسجة مع عامل المرفق باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ومن ثم إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة لكل مغلفة جيدا. إعداد بئر واحد لكل قرنية.
3- إجراء تشريح الخلايا وإزالة الخلايا
- ضع القرنية ، جانب البطانة ، في طبق بيتري معقم على خشبة المجهر تشريح. ضبط الإضاءة بحيث يكون سطح القرنية مضاءة بشكل جيد مع تباين كاف لتسليط الضوء على الطبقة الفيوليلية. ضبط التكبير بحيث الحافة وبعض بطانة القرنية المركزية هو في العرض.
- استخدام الملقط تعقيم الساعات لرفع بلطف والمسيل للدموع في غشاء Descemet بعيدا عن stroma الكامنة(الشكل 1). سوف ينفصل الغشاء عن الستروما كشريط تجعيد الشعر على الفور. ضع الشريط في بئر واحد من لوحة زراعة الأنسجة 6-well التي تم تغليفها بعامل التعلق وتحتوي على 1 مل من وسط الثقافة. يجب أن يبقى غطاء لوحة زراعة الأنسجة في جميع الأوقات ، إلا عندما يتم إضافة النباتات السريعة إليها ، للحد من خطر التلوث.
- إزالة شرائط من غشاء Descemet من المحيط المتطرف ة من البطانة أولا ثم من المناطق الوسطى في وقت لاحق. ضع جميع الشرائط من قرنية واحدة في بئر واحد داخل لوحة 6-well.
- احتضان explants في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة المحددة في 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية. ترك الثقافة دون عائق لمدة 2 أيام للسماح للexplants لتسوية ونعلق على سطح لوحة. عادة، ما يصل إلى ثلث explants تفشل في إرفاق لوحة.
- إزالة المتوسطة وأي explants غير مرفقة من الثقافة بعد 4 أيام وإضافة بلطف 2 مل من الثقافة الطازجة المتوسطة مع الحرص على عدم إزعاج explants المرفقة. يجب تغيير الوسط الثقافي مرتين في الأسبوع.
4. الإنتاج المستمر للخلايا الفيوليليالقرنية من قبل ثقافة explant المسلسل
ملاحظة: يمكن نقل النباتات الخارجية إلى لوحات زراعة الأنسجة الطازجة بعد 10 أيام لإنشاء ثقافات إضافية للخلايا القفيرة.
- وضع ثقافة explant على خشبة المسرح من المجهر تشريح وضبط الإضاءة والتكبير بحيث explants تكون مرئية.
- باستخدام ملقط صانع الساعات المعقم ، نتف بلطف كل explant من لوحة الثقافة ونقلها إلى بئر جديد من لوحة زراعة الأنسجة 6- well التي تم المغلفة مع عامل المرفق ويحتوي على 1 مل من وسط الثقافة.
- السماح للexplants ليستقر على سطح لوحة جديدة لمدة 4 أيام قبل استبدال الوسط الثقافة مع 2 مل من وسط الثقافة الطازجة. تغيير ثقافة المتوسطة تتغير مرتين في الأسبوع.
5. تزايد خلايا البُنزلة القرنية على القسائم الزجاجية لتحليلات الفلورسينالمناعي
ملاحظة: يجب إنشاء ثقافات الخلايا التي من المقرر تحليلها باستخدام الفلور المناعي على القسائم الزجاجية التي يمكن تركيبها على شرائح المجهر الزجاجي بعد إجراء تلطيخ.
- قم بتعقيم حزمة من القسائم الزجاجية المستديرة التي يبلغ قطرها 13 مم في الأوتوكلاف أو عن طريق نقع الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة تليها ثلاث شطفات في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS).
- ضع التغطيات الفردية في آبار لوحة زراعة الأنسجة 24 بئرًا ، ومعطفها بعامل التعلق ، ثم أضف 0.5 مل من الثقافة المتوسطة إلى كل بئر.
- باستخدام ملقط صانع الساعات المعقم إزالة النباتات من لوحات زراعة الأنسجة ونقلها إلى الآبار التي تحتوي على القسائم. السماح للexplants ليستقر على القسائم لمدة 4 أيام قبل تغيير المتوسطة.
- بعد فترة الحضانة المطلوبة، قم بإصلاح وتلطيخ ثقافات القسيمة داخل آبار الثقافة الخاصة بهم. قم بتركيب القسائم الملطخة على شرائح المجهر الزجاجي للتحليل تحت مجهر مضان.
6. الثقافة الفرعية للخلايا القانية القرنية باستخدام Dispase II
ملاحظة: يمكن إزالة الخلايا الليفية الكبيرة بشكل انتقائي من الثقافات المستفزة في 6-well plates قبل subculturing باستخدام هذا الإجراء. إذا كانت كافة الخلايا لتكون subcultured، لا تنفيذ الخطوات 6.2 إلى 6.4. والهدف من هذا الإجراء هو نقل الخلايا إلى لوحات جديدة مع الحفاظ على اتصالاتها من خلية إلى خلية قدر الإمكان. يجب التعامل مع الخلايا بلطف. وينبغي أن يتم مرور الآبار المُلَكية بالكامل بنسبة 1:2، في حين ينبغي أن تُمر الآبار الفرعية بنسبة 1:1 أو أقل.
- إزالة المتوسطة من الثقافة وشطف لفترة وجيزة مع DPBS.
- إضافة 1 مل من فيرسني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 s.
- إزالة Versene وإضافة 1 مل من التربيل. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 3 دقيقة.
- مراقبة الثقافة باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة. اضغط بلطف على الثقافة لطرد الخلايا من اللوحة. بمجرد أن الخلايا الليفية الكبيرة قد انفصلت عن لوحة إزالتها والترب باستخدام ماصة 1 مل. غسل التربي المتبقية قبالة الخلايا المتبقية عن طريق الإزالة مرتين مع 2 مل من DPBS.
- أضف 1 مل من 1 ملغ/مل ديسباسي الثاني إلى الثقافة واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 إلى 2 ساعة أو حتى تنفصل جميع الخلايا عن اللوحة. يجب أن تطفو الخلايا تدريجيا بعيدا عن لوحة في كتل.
- جمع الخلايا باستخدام ماصة 1 مل ونقل إلى 20 مل من DPBS في أنبوب طرد مركزي 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقيقة في 300 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة supernatant وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق التثلمع مع 1 مل ماصة في 1 مل من وسط الثقافة. نقل تعليق الخلية إلى بئر أو بئرين من لوحة 6-well، لمرورها بنسبة 1:1 أو 1:2 على التوالي.
- أعلى حتى المتوسطة في كل بئر لجعل 2 مل ووضع الثقافات في حاضنة زراعة الأنسجة. استبدل الوسط بمل 2 مل من المتوسط الطازج مرتين في الأسبوع.
7. نمو طبقات الخلايا البطانة القرنية على أغشية المواد الحيوية
ملاحظة: يصف الإجراء التالي الخطوات التي ينطوي عليها تركيب مادة بيولوجية دقيقة في جهاز تركيب مصنوع خصيصًا — يسمى غرفة Micro-Boyden — لثقافة الخلايا. يرجى الرجوع إلى المنشور6 الأخير للحصول على مزيد من المعلومات حول الجهاز وللحصول على تفاصيل الشراء.
- تجميع الغرفة العليا من غرفة بيدن الصغيرة عن طريق وضع أحمر O-حلقة في مركزها.
- استخدام تريفين من قطر 18 ملم لكمة من القرص من ورقة المواد الحيوية على لوحة قطع البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE). ضع هذا القرص على حلقة O الحمراء في الغرفة العليا لحجرة بويدن الصغيرة.
- المسمار الغرفة السفلى على الغرفة العليا، وتأمين القرص المواد الحيوية في ما بين.
- نقع غرفة صغيرة بويدن تجميعها في الإيثانول 70٪ لمدة ساعة واحدة لتعقيمه.
- تزج تماما في غرفة صغيرة بويدن تجميعها في HBSS العقيمة لمدة 10 دقيقة لإزالة الإيثانول. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين. تنفيذ خطوة غسل النهائي لمدة 10 دقيقة في وسط الثقافة غير المكملة.
- نقل غرفة صغيرة بوايدن المعقمة إلى وسط الثقافة في بئر لوحة 6-well ضمان أن الغرفة العليا هو العلوي. ضبط مستوى الثقافة المتوسطة بحيث يتصل السطح السفلي من غشاء المادة الحيوية ولكن لا يتدفق إلى الغرفة العليا.
- إعداد تعليق الخلايا الفيوليليالقرنية باستخدام الإجراء المبين في القسم 6. وينبغي تحقيق كثافة كافية للخلايا في التعليق للسماح بكثافة بذر لا تقل عن 100،000 خلية لكل سم2 على الغشاء في غرفة بيدن الصغيرة. تبلغ مساحة سطح الثقافة داخل غرفة بيدن الصغيرة 0.5 سم2 ويمكن أن تحمل حجمًا يبلغ 100 ميكرولتر. لذلك ، يجب إعداد تعليق يحتوي على 500،000 خلية / مل.
- ماسيت 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (50،000 الخلايا) على الغشاء في غرفة بيدن الصغيرة. احتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 4 ساعة قبل أن تتصدر المتوسط لغمر الغرفة بالكامل. احتضان الثقافة للفترة الزمنية المطلوبة، واستبدال الوسيط مرتين في الأسبوع.
ملاحظة: بمجرد أن تعلق الخلايا البطانة القرنية على السطح العلوي من غشاء المادة الحيوية يمكن انقلبت غرفة بيدن الصغيرة داخل الثقافة بشكل جيد بحيث تكون الغرفة السفلية العلوية. ويمكن بعد ذلك إضافة المزيد من الخلايا إلى الغرفة لبدء زراعة الخلايا على السطح الآخر للغشاء. على سبيل المثال، يمكن تطبيق الخلايا النجمية للقرنية بسهولة على السطح البديل وبالتالي محاكاة الموقع النسبي لأنواع خلايا القرنية كما رأينا داخل القرنية الخلفية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تلخيص طريقة عزل وتوسيع الخلايا القرنية البُنالتية من القرنيات البشرية أو الأغنام في الشكل 1 والشكل 2. معظم النباتات المشتقة من القرنيات من 1 إلى 2 سنة الأغنام أو المتبرعين الإنسان أقل من 30 سنة من العمر سوف نعلق على لوحات زرع الأنسجة المغلفة عامل المرفق في غضون أسبوع، ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف أن تجد أن ما يصل إلى ثلث explants تفشل في إرفاق داخل هذا الوقت. يمكن إزالة هذه النباتات "العائمة" من الثقافات. النباتات المجهولة من المتبرعين البشريين الذين تزيد أعمارهم عن 30 عامًا أقل عرضة للإرفاق باللوحة وأقل احتمالًا أيضًا لإنتاج ثقافات الخلايا. تظهر الصور التمثيلية لثقافات الخلايا البُنفية القرنية المتولدة من الأغنام والنباتات البشرية في الشكل 3 والشكل 4. الخلايا التي تخرج من explants عموما تبقى على اتصال مع بعضها البعض لأنها تهاجر إلى لوحة. ويعرف هذا النوع من الهجرة باسم الهجرة الجماعية للخلايا، وهي سمة من سمات الخلايا الظهارية7. من قبل 2 أسابيع من الثقافة، بقع من الخلايا الصغيرة، معبأة بإحكام قد تشكلت على الفور بجانب العديد من النباتات من الأغنام والقرنيات البشرية على حد سواء8. هذه البقع من الخلايا لا يحمل الخصائص المورفولوجية للEMT وتتوسع ببطء مع مرور الوقت. يمكن العثور على خلايا أكبر مع الأشكال غير النظامية والليفية خارج هذه البقع. وبمجرد إنشاء الثقافات، يمكن إزالة النباتات الجديدة باستخدام الملقط ووضعها في لوحات جديدة لإقامة ثقافات جديدة.
خلايا صغيرة معبأة بإحكام داخل خلايا القرنية الانبليلي مقاومة جدا للهضم مع الترب، في حين أن الخلايا الليفية أكبر هي أكثر حساسية لذلك. يمكن استغلال هذا الاختلاف في مقاومة التربي لإزالة الخلايا الكبيرة بشكل انتقائي من الثقافات قبل نقل الخلايا الصغيرة إلى لوحات جديدة. تظهر الصور التمثيلية لثقافات الخلايا القُندية القرنية البشرية في جميع أنحاء عملية التبوُّه باستخدام التربي وDispase II في الشكل 4.
يمكن إجراء تحليلات الفلورة المناعية على ثقافات الخلايا البُنفية القرنية لتحديد مواقع بروتينات محددة في الخلايا. مثال على ذلك هو ما يُعرض في الشكل 5. تم وضع النباتات من الأغنام والقرنيات البشرية على الألواح الزجاجية المغلفة بعامل التعلق في لوحات 24 بئرًا ومثقفة لمدة 4 أسابيع. تمت إزالة النباتات الخارجية ثم تم تحليل الثقافات باستخدام الفلورسينس المناعي لوجود ZO-1 ، وهو بروتين تقاطع ضيق ، وN-cadherin ، وهو بروتين تقاطع الملتصقين ، وفقًا لبروتوكولنا المنشور9. واستخدمت نفس الأجسام المضادة للزو-1 والمضادة لـ N-cadherin لكل من الأغنام والخلايا البشرية، وأظهرت النتائج أنه تم اكتشاف كلا البروتينين في أغشية البلازما للخلايا من كلا النوعين. زو-1 هو عادة موجود كنطاق متميز على حدود الخلية ولكن يصبح ضعيفا أو غائبا في الخلايا التي تخضع EMT. لذلك، يشير التعبير القوي ZO-1 في هذه الثقافات إلى أن الخلايا لم تخضع لـ EMT.
تم تصميم غرف نا Micro-Boyden المصنوعة خصيصا لتعليق غشاء المواد الحيوية داخل بئر من 6-بئر لوحة زراعة الأنسجة(الشكل 6). يظهر إجراء تركيب غشاء المواد الحيوية في غرفة بيدن الصغيرة في الشكل 7. تصميم غرفة Micro-Boyden يسمح لكلا الجانبين من الغشاء المعلق داخلها لاستخدامها كأسطح زراعة الخلايا في وقت واحد. وللتدليل على ذلك، تم بذر الخلايا النجمية الأغنام المستمدة من الأنسجة السمنية القرنية بكثافة 100،000 خلية/سم2 على جانب واحد من غشاء الكولاجين من النوع الأول ثم 24 ساعة في وقت لاحق تم قلب الغرفة والأغنام الخلايا البذاثيلية القرنية كانت مبذرة على الجانب الآخر من الغشاء بكثافة 400،000 خلية /سم2. تمت زراعة طبقات الخلايا المهندسة للأنسجة لمدة 4 أسابيع ، ثم تم إصلاحها مع 10٪ فورمالين محايد وملطخ باستخدام رودامين phalloidin وصبغة Hoechst النووية 33342. ثم تم فحصها وتصويرها باستخدام المجهر البؤري(الشكل 8). كشفت رؤية مقطعية لبناء الخلايا المهندسة بالأنسجة عن طبقة واحدة من الخلايا البطانة القرنية على سطح واحد من غشاء الكولاجين وثقافة متعددة الطبقات من خلايا القرنية السترومال على السطح الآخر.
الشكل 1: تقنية الحصول على النباتات المنفذة من غشاء الإندوتيليوم/ديسيميت من القرنيات الطازجة. (أ)يتم وضع القرنية على جانب البطانة في طبق بيتري تحت المجهر تشريح. (ب)عرض عن قرب للمنطقة المشار إليها بواسطة مستطيل أحمر في(A). تستخدم ملقط صانع الساعات لتقشير غشاء Descemet بلطف من الستروما الكامنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراءات إنشاء وتوسيع ثقافات الخلايا البطانية القرنية من البطانية / Descemet في الأغشية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تباين المرحلة التمثيلية لثقافات الخلايا البطانية أثناء التأسيس الأولي من النباتات الإكسابية لبطانة القرنية الخرافية/غشاء ديسميت. (A) A sheep corneal endothelium/Descemet's membrane explant after 3 days in culture. بدأت الخلايا الفيوليلية القرنية في الهجرة إلى اللوحة. (ب)ثقافة نبوة الأغنام بعد أسبوع واحد. ويحيط explant من قبل ورقة متشنجة من الخلايا. (ج)ثقافة نبوة الأغنام بعد أسبوعين. الخلايا الصغيرة تحيط explant بينما تقع خلايا أكبر بعيدا. (د)ثقافة نبوة الأغنام بعد 6 أسابيع. وينظر إلى منطقة من الخلايا الصغيرة معبأة بإحكام بجوار منطقة من الخلايا أكبر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عزل الخلايا القرنية القرنية الصغيرة المعبأة بإحكام للثقافات الفرعية. (أ)بطانة القرنية البشرية / Descemet غشاء الثقافة explant بعد 7 أسابيع. العديد من الخلايا الصغيرة المعبأة بإحكام موجودة بجوار النبتة. (ب)مناطق الخلايا الصغيرة المعبأة بإحكام تتطور في الثقافات البشرية في النبوة بطريقة مماثلة لتلك التي لوحظت في الثقافات الأغنام. (C)ثقافة الاستئصال البشري بعد إزالة النبتة وبعد التعرض 20 دقيقة لالترب. احتفظت الخلايا الصغيرة المعبأة بإحكام بتعلقها باللوحة بينما طفت الخلايا الأكبر بعيدًا. (د)ثقافة الخلايا القذابية القرنية الإنسان بعد 1 ساعة في Dispase الثاني. وقد انفصلت معظم الخلايا عن لوحة كما كتل العائمة الحرة. (E)والقرنية البشرية الزنانية الزنزانة الخلايا الفرعية بعد 1 يوم. وقد هاجرت الخلايا إلى الخارج من كتل الخلايا التي كانت معزولة عن ثقافة explant الأصلية. (واو)الثقافة الفرعية للخلايا القرنية البشرية بعد 12 يوما. وقد شكلت الخلايا أحادية متجانسة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: توطين بروتينات ZO-1 و N-cadherin في أغشية الأغنام والخلايا البُنائية القرنية البشرية عن طريق وضع المناعة المزدوجة. تم تأسيس الأغنام والإنسان بطانة القرنية / Descemet الثقافات المستعبدين غشاء على المرفقات عامل المغلفة الزجاج المغطاة وتحليلها بعد 4 أسابيع. تم الكشف عن كل من ZO-1 (وصمة عار خضراء) وN-cadherin (وصمة عار حمراء) في أغشية الأغنام(A و B)والإنسان(D و E)خلايا بطانة القرنية. وكشف تحليل الصور المدمجة أن البروتينين كانت موضعية للغاية داخل الثقافات(C و F). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رسم تخطيطي لغرفة بيدن الصغيرة الموضحة في المقطع العرضي. لدينا غرفة بودين الصغيرة المصنوعة خصيصا يتكون من غرفة العلوي، غرفة السفلى وحلقة O. ويمكن استخدامه لتعليق أي نوع من المواد الميمبرة داخل زراعة الأنسجة بشكل جيد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إجراء تركيب غشاء من المواد الحيوية في غرفة بويدن الصغيرة لاستزراع الأنسجة. (أ)المعدات اللازمة لهذا الإجراء تشمل لوحة قطع البولي تترافلوروإيثيلين، وزوج من ملقط، وتريفين من 18 ملم في القطر، وغرفة بودين صغيرة الصنع مخصصة وغشاء حيوي. (ب)استخدام تريفين لكمة من القرص من غشاء المواد الحيوية. (C)ضع حلقة O في الغرفة العلوية من جهاز التركيب ثم ضع قرص المادة الحيوية عليه. (D)المسمار الغرفة السفلى على الغرفة العليا من الجهاز المتصاعد. (E)غرفة صغيرة بويدن تجميعها على استعداد لتعقيمها مع الإيثانول 70٪. (و) تزج غرفة Micro-Boyden المعقمة في وسط زراعة الأنسجة في بئر لوحة زراعة الأنسجة 6-well. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الأغنام القرنية الخلايا البطانة وسترومال على الجانبين المتعارضين من نوع الكولاجين غشاء الأول. كانت الخلايا ملطخة بالرودامين phalloidin لتصور actin (أحمر) وهويشت لتصور النوى (الأزرق). لم يكن غشاء الكولاجين من النوع الأول ملطخًا وبالتالي فهو غير مرئي في هذه الصور التي تم جمعها باستخدام المجهر المعالبؤر. (أ)التكبير منخفضة، عرض المقطع العرضي للبناء الأنسجة المهندسة. طبقة رقيقة من actin تمثل زراعة الخلايا البطانة القرنية مرئية على السطح العلوي للغشاء ، وطبقة أكثر سمكا من actin تمثل ثقافة الخلايا السترومال موجودة على السطح السفلي للغشاء. لا تظهر النوى الزرقاء في هذه الصورة. (B)En عرض الوجه من طبقة الخلية البطانة القرنية التي تظهر كل من actin ونواة تلطيخ. (C)En عرض الوجه من طبقة الخلية القرنية سترومال تظهر كل من actin والنوى تلطيخ. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك تحد تقني كبير المرتبطة إنشاء وتوسيع الخلايا البُنْدِية القرنية البشرية هو منع EMT من الحدوث في الثقافات. يمكن أن يتم تشغيل EMT في الخلايا البطانة القرنية عن طريق فقدان الاتصال من خلية إلى خلية، ولكن معظم بروتوكولات ثقافة الخلية لهذه الخلايا تنطوي على التفكك الأنزيمي لخلايا واحدة أثناء العزلة والثقافة الفرعية10. هنا نقدم بروتوكول ثقافة الخلايا البديلة للخلايا البديلية القرنية التي تقلل من خطر فقدان الخلايا الاتصال مع بعضها البعض خلال مراحل العزل والثقافة الفرعية.
لدينا طريقة لإنشاء خلايا القرنية الخلايا البطانية الثقافات ينطوي على وضع explants من البطانية / Descemet غشاء من القرنيات المانحة في لوحات زراعة الأنسجة في ظل الظروف التي تسمح للخلايا للهجرة الجماعية من الأغشية وعلى لوحات. لكي يكون هذا ناجحا، يجب أن تشكل explant ارتباط ضيق لوحة زراعة الأنسجة، وهذا هو أفضل تحقيق من خلال عدم تعكير صفو لوحة لعدة أيام بعد أن تم إعداد الثقافات. عامل حاسم آخر في إنشاء ناجحة لخلايا القرنية الخلايا الخلايا من البشر هو عمر المانح. وتميل معدلات النجاح الأعلى إلى تحقيقها من الجهات المانحة التي تقل أعمارها عن 30 سنة.
عيب استخدام أسلوب الاستزراع النبّاز لإنشاء الخلايا القرنية البُنفية هو الفترة الطويلة نسبيًا الموجودة بين إعداد الثقافات والحصول على أعداد كبيرة من الخلايا. ما يسمى "قشر وهضم" أساليب تنطوي على تجريد البطانة من القرنيات المانحة وهضمها مع الإنزيمات لإطلاق الخلايا للثقافة11. ومن شأن هذه الأنواع من الأساليب أن تنتج ثقافات تحتوي على خلايا أكثر في البداية من تلك التي أنشئت من النباتات.
لدينا أسلوب الثقافة explant للخلايا القانيلية القرنية تنتج الثقافات التي تحتوي على خلايا صغيرة جدا، مدمجة، ناضجة ذات جودة عالية. ومع ذلك ، فإن الثقافات تحتوي أيضًا على خلايا أكبر وأقل مثالية نحو محيط اللوحة. يمكن إزالة الخلايا الأكبر عن طريق الهضم مع التربي والتخلص منها إذا رغبت في ذلك ، ولكن هذا يقلل من عدد الخلايا المتاحة للثقافة الفرعية. ومع ذلك ، explants التي بدأت بنجاح ثقافات الخلايا الأساسية هي دائما تقريبا قادرة على بدء المزيد من الثقافات الخلية ، ويمكن استغلال هذه القدرة للحصول على أعداد كبيرة من الخلايا ذات جودة عالية.
لدينا طريقة الثقافة الفرعية للخلايا القانضه القرنية ينطوي على استخدام Dispase II لرفع كتل الخلية بلطف بعيدا عن لوحة ثقافة الأنسجة لنقلها إلى لوحات جديدة، وعلى الرغم من أن هذه الطريقة مصممة لتقليل إمكانية EMT التي تحدث في مرور الخلايا ، تجدر الإشارة إلى أنه لا يقلل من المخاطر إلى الصفر.
وقد كان الهدف من العديد من المجموعات لتطوير الأنسجة المهندسة طبقات الخلايا الفيوليلية القرنية لأغراض زرع. وقد جربت العديد من المواد المختلفة كحاملات للخلايا وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب المختلفة لمنع المواد من التحرك في لوحة الثقافة أثناء زراعة الخلايا. معظم الأساليب تنطوي على ترسيخ المواد على سطح لوحة ثقافة الأنسجة بطريقة أو بأخرى، وتقييد نمو الخلايا إلى السطح العلوي للغشاء فقط. في حين يمكن استخدام هذه الأساليب لإنتاج طبقات واحدة من بطانة القرنية المهندسة الأنسجة التي من شأنها أن تكون مساوية لالطعوم غشاء البطانة / Descemet (الطعوم DMEK)، لا يمكن استخدامها لإنتاج مكافئات هندسية الأنسجة من البطانية / Descemet غشاء / الطعوم ستروما (DSEK أو الطعوم DSAEK) التي هي الأكثر شيوعا المستخدمة من قبل الجراحين حاليا. لذلك قمنا بتطوير جهاز تركيب غشاء يسمى غرفة Micro-Boyden التي تسمح للخلايا أن تزرع في وقت واحد على كلا السطحين من غشاء المواد الحيوية المعلقة، واستخدمناه لإنتاج الطعوم المهندسة الأنسجة التي تتكون من الخلايا البطانة القرنية والخلايا المترفية القرنية على أسطح متقابلة من أغشية الكولاجين من النوع الأول. هذه الطعوم ذات الطبقات المزدوجة المهندسة الأنسجة يمكن أن تستخدم لتحل محل الطعوم المشتقة من القرنية المانحة من البطانة والأنسجة سترومال على جانبي غشاء Descemet (DSEK أو الطعوم DSAEK).
باختصار ، تم تصميم الأساليب المعروضة في هذه المقالة لأولئك الذين يرغبون في الحصول على خلايا القرنية البُنالتي الأولية ذات جودة عالية لاستخدامها في دراسات هندسة الأنسجة. يتم وصف أساليب الثقافة اللطيفة التي تم تصميمها لتقليل خطر الخلايا التي تخضع لـ EMT ويتم تقديم طريقة لزراعة الخلايا على أغشية المواد الحيوية المعلقة. نأمل أن تساعد هذه الأساليب الآخرين على تحقيق أهدافهم المتمثلة في إنتاج زراعة بطانة القرنية المهندسة للأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
بفضل نويمي غالوريني على مساعدتها أثناء إعداد الشكل 7. وقد دعم هذا العمل منحة مشروع ممنوحة إلى وزارة الصحة من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (منحة المشروع 1099922)، وبتمويل تكميلي تلقته مؤسسة معهد كوينزلاند للعيون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
