Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales humanas y ovinas en membranas biomateriales

Summary

Este protocolo describe los pasos críticos necesarios para establecer y cultivar cultivos celulares endoteliales corneales a partir de explantas de tejido humano o ovino. También se presenta un método para subculturizar células endoteliales corneales en biomateriales membranosas.

Abstract

Los cultivos de células endoteliales corneales tienden a someterse a una transición epitelial a mesenquimal (EMT) después de la pérdida del contacto entre células. La EMT es perjudicial para las células, ya que reduce su capacidad para formar una capa madura y funcional. Aquí, presentamos un método para establecer y suculcar cultivos celulares endoteliales humanos y ovinos que minimiza nalve la pérdida de contacto de célula a célula. Los explantas de la membrana del endotelio/Descemet se toman de las córneas del donante y se colocan en el cultivo de tejidos en condiciones que permiten que las células migren colectivamente a la superficie de cultivo. Una vez establecida una cultura, los explantes se transfieren a placas nuevas para iniciar nuevos cultivos. Dispase II se utiliza para levantar suavemente los grupos de células de las placas de cultivo de tejido para su subcultura. Los cultivos celulares endoteliales corneales que se han establecido utilizando este protocolo son adecuados para transferir a membranas biomateriales para producir capas celulares de ingeniería tisular para trasplante en ensayos con animales. Se describe un dispositivo hecho a medida para apoyar las membranas biomateriales durante el cultivo del tejido y se presenta un ejemplo de un injerto de ingeniería tisular compuesto por una capa de células endoteliales corneales y una capa de células estromales corneales a ambos lados de una membrana de colágeno tipo I.

Introduction

La córnea es un tejido transparente que se encuentra en la parte delantera del ojo. Se compone de tres capas principales: una capa epitelial en la superficie externa, una capa de estroma medio y una capa interna llamada endotelio corneal. El endotelio corneal es una monocapa de células que se asienta sobre una membrana del sótano llamada membrana de Descemet y mantiene la transparencia de la córnea regulando la cantidad de líquido que entra en el estroma desde el humor acuoso subyacente. El exceso de líquido dentro del estroma causa hinchazón de la córnea, opacidad y pérdida de la visión. Por lo tanto, el endotelio es vital para mantener la visión.

El endotelio corneal puede llegar a ser disfuncional por una serie de razones, incluyendo el envejecimiento, enfermedad y lesión, y el único tratamiento actual es la cirugía de trasplante. Durante esta cirugía, la membrana del endotelio y Descemet se extrae de la córnea del paciente y se reemplaza con un injerto de endotelio y la membrana de Descemet obtenida de una córnea donante. Muchos injertos de endotelio también contienen una fina capa de tejido estroveral para ayudar a la manipulación y fijación a la córnea huésped¹.

En todo el mundo, la demanda de tejido de donante corneal para cirugías de trasplante es mayor que la cantidad que pueden ser suministradas por los bancos oculares². Por lo tanto, ha habido un impulso para desarrollar trasplantes de endotelio corneal de ingeniería de tejido que podrían utilizarse para aliviar este déficit³. La razón de ser de esto se basa en el hecho de que actualmente, el endotelio de una córnea individual sólo puede ser transferido a un solo paciente, sin embargo, si las células endoteliales corneales se expandieron y cultivaron por primera vez en andamios biomateriales en el cultivo de tejidos, podrían ser utilizados para tratar a múltiples pacientes.

Los principales desafíos que deben abordarse antes de que los trasplantes de endotelio corneal con ingeniería de tejido se conviertan en una opción factible para los cirujanos incluyen: (1) establecer técnicas para expandir las células endoteliales corneales de alta calidad y para producir células endoteliales maduras y funcionales capas de células endoteliales corneales in vitro, y (2) establecer técnicas para el cultivo de las células en andamios biomateriales para producir injertos de ingeniería tisular que sean iguales o mejores que los injertos derivados de la córnea del donante que se utilizan actualmente.

Las células endoteliales corneales tienen un potencial proliferativo in vivo muy bajo, pero se pueden estimular para dividir in vitro^4. Sin embargo, tienen una fuerte tendencia a someterse a una transición epitelial-mesenquimal (EMT) in vitro, lo que reduce su capacidad para formar una capa endotelial madura y funcional. Los desencadenantes conocidos de la EMT en las células endoteliales corneales incluyen la exposición a ciertos factores de crecimiento y la pérdida del contacto entre células⁵. Por lo tanto, es casi inevitable que los cultivos celulares endoteliales corneales que se disilizan enzimáticamente durante la subcultura sufren cambios asociados con la EMT. Aquí, presentamos un método de cultivo celular para células endoteliales corneales humanas u ovinas que está diseñado para minimizar la interrupción de los contactos de célula a célula durante las etapas de aislamiento, expansión y subcultivo, para reducir el potencial de EMT. Además, demostramos cómo los injertos de ingeniería tisular que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico derivados de la córnea de donantes que se asemejan a los injertos de endotelio/tejido estrogénico de descemet pueden ser producidos por el cultivo de capas celulares cultivadas en ambos lados de una membrana biomaterial en un dispositivo de montaje hecho a medida.

Protocol

Las córneas humanas con el consentimiento de los donantes para la investigación se obtuvieron del Banco de Ojos de Queensland y se utilizaron con la aprobación ética del Comité de ética de investigación humana del Hospital Metro Sur y del Servicio de Salud (HREC/07/QPAH/048). Las córneas de oveja se obtuvieron de animales eutanasiados en el Centro de Investigación Médica de Herston de la Universidad de Queensland bajo un acuerdo de intercambio de tejidos.

1. Preparación de herramientas de disección

1. Esterilice dos pares de fórceps relojero número 4 empapórlos en una solución de etanol al 70% durante 5 min o autoclando.

2. Preparación de placas de cultivo medio de cultivo y de cultivo de tejidos

1. Preparar 100 ml de medio de cultivo que contenga Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% de suero bovino fetal y 100 U/ml de pluma/estreptococo. Este medio de cultivo es adecuado para cultivos celulares endoteliales corneales de oveja, sin embargo, para cultivos celulares endoteliales corneales humanos, el medio debe complementarse con 50 g/ml de extracto de la hipófisis bovina, 0,08% sulfato de condroitina, cloruro de calcio de 200 g/ml y ácido L-ascórbico de 0,3 mM 2-fosfato. El medio de cultivo se puede almacenar en la oscuridad a 4 oC durante dos semanas.
2. Recubrir los pozos de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos con Factor de fijación utilizando las instrucciones del fabricante y luego añadir 1 ml de medio de cultivo a cada pocato recubierto. Prepare un pozo para cada córnea.

3. Procedimiento de disección y cultivo celular explantado

1. Coloque la córnea, lado del endotelio hacia arriba, en una placa estéril de Petri en el escenario de un microscopio de disección. Ajuste la iluminación para que la superficie corneal esté bien iluminada con suficiente contraste para resaltar la capa endotelial. Ajuste el zoom para que el borde y algún endotelio corneal central estén a la vista.
2. Utilice fórceps de relojero esterilizado para levantar y desgarrar suavemente la membrana de Descemet lejos del estroma subyacente (Figura 1). La membrana se separará del estroma como una tira que inmediatamente se acurruca. Coloque la tira en un pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que ha sido recubierta con Factor de Fijación y contiene 1 ml de medio de cultivo. La tapa de la placa de cultivo de tejido debe mantenerse encendida en todo momento, excepto cuando se le añaden explantas, para reducir el riesgo de contaminación.
3. Retire primero las tiras de la membrana de Descemet de la periferia extrema del endotelio y luego de las regiones centrales. Coloque todas las tiras de una córnea en un solo pozo dentro del plato de 6 pocillos.
4. Incubar los explantes en una incubadora de cultivo celular humidificado situada en un 5% de_CO2 y 37oC. Deje el cultivo intacto durante 2 días para permitir que los explantes se asienten y se adhieran a la superficie de la placa. Por lo general, hasta un tercio de los explantes no se adhieren a la placa.
5. Retire el medio y los explantes no unidos del cultivo después de 4 días y agregue suavemente 2 ml de medio de cultivo fresco teniendo cuidado de no molestar a los explantes adjuntos. El medio cultural debe cambiarse dos veces por semana.

4. Producción continua de células endoteliales corneales por cultivo explanta en serie

NOTA: Los explantes se pueden transferir a placas de cultivo de tejido fresco después de 10 días para establecer cultivos adicionales de células endoteliales corneales.

1. Coloque el cultivo explant en el escenario de un microscopio de disección y ajuste la iluminación y el zoom para que los explantes sean visibles.
2. Usando fórceps de relojero esterilizados, saque suavemente cada explant de su placa de cultivo y transfiérala a un pozo fresco de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que ha sido recubierta con Factor de Fijación y contiene 1 ml de medio de cultivo.
3. Dejar que los explantes se asienten en la superficie de su nueva placa durante 4 días antes de sustituir el medio de cultivo por 2 ml de medio de cultivo fresco. El medio de cultivo de cambio sincambios dos veces por semana.

5. Crecimiento de células endoteliales corneales en tapas de vidrio para análisis de inmunofluorescencia

NOTA: Los cultivos celulares destinados a ser analizados mediante inmunofluorescencia deben establecerse en cubiertas de vidrio que se pueden montar en diapositivas de microscopio de vidrio siguiendo el procedimiento de tinción.

1. Esterilice un paquete de tapas redondas de vidrio de 13 mm de diámetro en un autoclave o empapada en 70% de etanol durante 15 minutos seguido de tres enjuagues en solución salina con búfer de fosfato (PBS).
2. Coloque los revestimientos individuales en los pozos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos, recubrirlos con Factor de fijación, y luego agregar 0,5 ml de medio de cultivo a cada poc.
3. El uso de fórceps de relojero esterilizados elimina los explantes de sus placas de cultivo de tejidoy los transfiere a pozos que contienen cubreobjetos. Deje que los explantes se asienten en las cubiertas durante 4 días antes de cambiar el medio.
4. Después del período de incubación requerido, fijar y manchar las culturas encubiertas dentro de sus pozos de cultivo. Monte los cubreobjetos manchados en diapositivas de microscopio de vidrio para su análisis bajo un microscopio de fluorescencia.

6. Subcultivo de células endoteliales corneales utilizando Dispase II

NOTA: Las células fibroblásticas grandes se pueden eliminar selectivamente de los cultivos de explantación en placas de 6 pocillos antes de suculturar mediante este procedimiento. Si se van a subculturar todas las celdas, no realice los pasos 6.2 a 6.4. El objetivo de este procedimiento es transferir las células a placas nuevas mientras se mantienen sus contactos de célula a célula tanto como sea posible. Las células deben manipularse suavemente. Los pozos de confluente completamente deben ser repasados en una proporción de 1:2, mientras que los pozos de subconfluentes deben ser pasados en una proporción de 1:1 o menos.

1. Retire el medio del cultivo y enjuague brevemente con DPBS.
2. Añadir 1 mL de Versene. Incubar a temperatura ambiente durante 30 s.
3. Retire el Versene y agregue 1 ml de TrypLE. Incubar a 37oC en la incubadora de cultivos tisulares durante 3 min.
4. Observe el cultivo utilizando un microscopio de contraste de fase. Toque suavemente el cultivo para desalojar las células de la placa. Tan pronto como las células fibroblásticas grandes se hayan desprendido de la placa, retírelas y el TrypLE con una pipeta de 1 ml. Lave el TrypLE residual de las células restantes encerrando dos veces con 2 ml de DPBS.
5. Añadir 1 ml de 1 mg/ml Despensar II al cultivo e incubar en la incubadora de cultivos tisulares durante 1 a 2 h o hasta que todas las células se hayan separado de la placa. Las células deben flotar gradualmente lejos de la placa en grumos.
6. Recoger las células utilizando una pipeta de 1 ml y transferir a 20 ml de DPBS en un tubo centrífugo de 50 ml. Centrífuga durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
7. Retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular mediante la trituración con una pipeta de 1 ml en 1 ml de medio de cultivo. Transfiera la suspensión celular a uno o dos pozos de una placa de 6 pocillos, para pasar a una proporción de 1:1 o 1:2 respectivamente.
8. Recargar el medio en cada pozo para hacer 2 ml y colocar los cultivos en la incubadora de cultivo de tejido. Sustituya el medio por 2 ml de medio fresco dos veces por semana.

7. Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales en membranas biomateriales

NOTA: El siguiente procedimiento describe los pasos involucrados en el montaje de un biomaterial membranoso en un dispositivo de montaje hecho a medida, llamado cámara micro-Boyden, para el cultivo celular. Consulte nuestra reciente publicación⁶ para obtener más información sobre el dispositivo y para obtener más información sobre la compra.

1. Montar la cámara superior de la cámara micro-Boyden colocando una placa tórica roja en su centro.
2. Utilice un trephine de 18 mm de diámetro para perforar un disco de una hoja de biomaterial en una tabla de corte de politetrafluoroetileno (PTFE). Coloque este disco sobre la tórtela roja en la cámara superior de la cámara micro-Boyden.
3. Atornille la cámara inferior a la cámara superior, asegurando el disco biomaterial en el medio.
4. Remoje la cámara micro-Boyden montada en 70% de etanol durante 1 h para esterilizarla.
5. Sumerja completamente la cámara micro-Boyden montada en HBSS estéril durante 10 minutos para eliminar el etanol. Repita este paso de lavado dos veces. Realice un paso de lavado final durante 10 minutos en medio de cultivo sin suplementar.
6. Transfiera la cámara micro-Boyden esterilizada al medio de cultivo en el pozo de una placa de 6 pocillos asegurando que la cámara superior esté más alta. Ajuste el nivel del medio de cultivo para que entre en contacto con la superficie inferior de la membrana biomaterial, pero no fluya hacia la cámara superior.
7. Preparar una suspensión de las células endoteliales corneales utilizando el procedimiento descrito en la sección 6. Se debe lograr una densidad celular suficiente en la suspensión para permitir una densidad de sembración de al menos 100.000 células por cm² en la membrana de la cámara micro-Boyden. La superficie de cultivo dentro de la cámara micro-Boyden es de 0,5 cm² y puede contener un volumen de 100 l. Por lo tanto, se debe preparar una suspensión que contenga 500.000 células/ml.
8. Pipetear 100 l de suspensión celular (50.000 células) sobre la membrana de la cámara micro-Boyden. Incubar en la incubadora de cultivo de tejido durante 4 h antes de recargar el medio para sumergir completamente la cámara. Incubar el cultivo durante el período de tiempo requerido, reemplazando el medio dos veces por semana.
   NOTA: Una vez que las células endoteliales corneales se han unido a la superficie superior de la membrana biomaterial, la cámara micro-Boyden se puede voltear dentro del cultivo bien para que la cámara inferior esté más alta. Luego se pueden agregar más células a la cámara para iniciar cultivos celulares en la otra superficie de la membrana. Por ejemplo, las células estromales corneales se pueden aplicar fácilmente a la superficie alternativa imitando así la ubicación relativa de los tipos de células corneales como se ve dentro de la córnea posterior.

Representative Results

El método para aislar y expandir las células endoteliales corneales de las córneas humanas u ovinas se resume en la Figura 1 y la Figura 2. La mayoría de los explantes que se derivan de las córneas de 1 a 2 años de edad ovejas o donantes humanos de menos de 30 años de edad se unirán a las placas de cultivo de tejido recubierto de Factor de Apéndice dentro de una semana, sin embargo, no es inusual encontrar que hasta un tercio de los explantas no se adhieren dentro de este tiempo. Estos explantes "flotantes" se pueden eliminar de las culturas. Los explantas de donantes humanos mayores de 30 años son menos propensos a adherirse a la placa y también menos propensos a producir cultivos celulares. En la Figura 3 y en la Figura 4se muestran imágenes representativas de cultivos celulares endoteliales corneales generados a partir de explantes ovinos y humanos. Las células que emergen de los explantes generalmente permanecen en contacto entre sí a medida que migran hacia la placa. Este tipo de migración se conoce como migración de células colectivas, y es una característica de las células epiteliales⁷. A las 2 semanas de cultivo, se habrán formado parches de células pequeñas y apretadas inmediatamente junto a muchos de los explantas de las córneas humanas y ovejas^8. Estos parches de células no presentan características morfológicas de la EMT y se expanden lentamente con el tiempo. Las células más grandes con formas fibroblásticas más irregulares se pueden encontrar fuera de estos parches. Una vez establecidos los cultivos, los explantes pueden ser retirados usando fórceps y colocados en placas frescas para establecer nuevos cultivos.

Las células pequeñas y herméticas dentro de los cultivos de células endoteliales corneales son muy resistentes a la digestión con TrypLE, mientras que las células fibroblásticas más grandes son más sensibles a ella. Esta diferencia en la resistencia trypLE se puede explotar para eliminar selectivamente células grandes de los cultivos antes de transferir las células más pequeñas a nuevas placas. En la Figura 4se muestran imágenes representativas de los cultivos de células endoteliales corneales humanas a lo largo del proceso de subcultura utilizando TrypLE y Disyse II.

Los análisis de inmunofluorescencia se pueden realizar en cultivos de células endoteliales corneales para localizar proteínas específicas en las células. Un ejemplo de esto se presenta en la Figura 5. Explantes de ovejas y córneas humanas fueron colocados en cubiertas de vidrio recubiertos con Factor de Fijación en placas de 24 pocillos y cultivados durante 4 semanas. Los explantes fueron eliminados y luego los cultivos fueron analizados usando inmunofluorescencia para la presencia de ZO-1, una proteína de unión apretada, y N-cadherina, una proteína de unión adherente, según nuestro protocolo publicado^9. Los mismos anticuerpos anti-ZO-1 y anti-N-cadherin se utilizaron para las células ovinas y humanas, y los resultados mostraron que ambas proteínas se detectaron en las membranas plasmáticas de las células de ambas especies. ZO-1 está normalmente presente como una banda distinta en el borde de la célula, pero se vuelve débil o ausente en las células sometidas a EMT. Por lo tanto, la robusta expresión ZO-1 en estos cultivos indicaba que las células no habían sido sometidas a EMT.

Nuestras cámaras micro-Boyden hechas a medida están diseñadas para suspender una membrana biomaterial dentro del pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos(Figura 6). El procedimiento para montar una membrana biomaterial en una cámara micro-Boyden se muestra en la Figura 7. El diseño de la cámara micro-Boyden permite que ambos lados de la membrana suspendida dentro de ella se utilicen como superficies de cultivo celular simultáneamente. Para demostrar esto, las células estromales de oveja derivadas del tejido estromal corneal se sembraron a una densidad de 100.000 células/cm² sobre un lado de una membrana de colágeno tipo I y luego 24 h más tarde la cámara se volteó y las células endoteliales corneales de oveja se sembraron al otro lado de la membrana a una densidad de 400.000 células/cm^2. Las capas celulares con ingeniería de tejido se cultivaron durante 4 semanas, luego se fijaron con 10% de formalina tamponada neutra y se tiñó usando faloiina de rodamina y tinte nuclear Hoechst 33342. Luego fueron examinados y fotografiados con un microscopio confocal(Figura 8). Una vista transversal de la construcción celular de ingeniería tisular reveló una sola capa de células endoteliales corneales en una superficie de la membrana de colágeno y un cultivo de varias capas de células estromales corneales en la otra superficie.

Figura 1: Técnica para la obtención de explantas de la membrana del endotelio/Descemet a partir de córneas frescas. (A) La córnea se coloca endotelio hacia arriba en una placa de Petri bajo un microscopio de disección. (B) Vista de cerca del área indicada por un rectángulo rojo en (A). Los fórceps relojero se utilizan para pelar suavemente la membrana de Descemet del estroma subyacente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Procedimiento para establecer y ampliar cultivos de células endoteliales corneales a partir de explantes de membrana de endotelio/Descemet. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes de contraste de fase representativa de cultivos celulares endoteliales durante el establecimiento inicial a partir de explantes de endotelio corneal de oveja/membrana de Descemet. (A) Una membrana de endotelio corneal/Descemet de oveja explantar después de 3 días en cultivo. Las células endoteliales corneales han comenzado a migrar a la placa. (B) Un cultivo explant de ovejas después de 1 semana. El explant está rodeado por una hoja confluente de células. (C) Un cultivo explant de ovejas después de 2 semanas. Las células pequeñas rodean el explantar, mientras que las células más grandes se encuentran más lejos. (D) Un cultivo explant de ovejas después de 6 semanas. Una región de células pequeñas y apretadas se ve junto a una región de células más grandes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aislamiento de células endoteliales corneales humanas pequeñas y herméticas para subculturas. (A) Un cultivo explant de membrana de endotelio corneal humano/Descemet después de 7 semanas. Muchas células pequeñas y herméticas están presentes junto a la explanta. (B)Las regiones de células pequeñas y estrechamente envasadas se desarrollan en cultivos explantados humanos de manera similar a la observada en los cultivos de explantas ovinas. (C) Un cultivo explanta humano después de la eliminación de la explanta y después de 20 minutos de exposición a TrypLE. Las células pequeñas y apretadas han conservado su fijación a la placa, mientras que las células más grandes han flotado. (D) Un cultivo de células endoteliales corneales humanas después de 1 h en Dispase II. La mayoría de las células se han separado de la placa como grumos flotantes. (E) Un subcultivo de células endoteliales corneales humanas después de 1 día. Las celdas han migrado hacia afuera desde grupos celulares que estaban aislados del cultivo explanta original. (F) Un subcultivo de células endoteliales corneales humanas después de 12 días. Las células han formado una monocapa confluente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Localización de proteínas ZO-1 y N-cadherina en las membranas de ovejas y células endoteliales corneales humanas mediante inmunofluorescencia de doble etiquetado. Los cultivos de explantación de membrana de endotelio corneal/Descemet de ovejas y humanos se establecieron en los cubreobjetos de vidrio recubierto con Factor de Fijación y se analizaron después de 4 semanas. Tanto ZO-1 (mancha verde) como N-cadherina (mancha roja) se detectaron en las membranas de las ovejas (A y B) y células endoteliales corneales (D y E). El análisis de las imágenes combinadas reveló que las dos proteínas estaban altamente colocalizadas dentro de los cultivos (C y F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Diagrama de una cámara micro-Boyden que se muestra en sección transversal. Nuestra cámara micro-Boyden hecha a medida consta de una cámara superior, una cámara inferior y una placa tórica. Se puede utilizar para suspender cualquier tipo de material membranoso dentro de un cultivo de tejido bien. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: El procedimiento para el montaje de una membrana biomaterial en una cámara micro-Boyden para el cultivo de tejidos. (A) El equipo necesario para este procedimiento incluye una tabla de corte de politetrafluoroetileno, un par de fórceps, un trephine de 18 mm de diámetro, una cámara micro-Boyden hecha a medida y una membrana biomaterial. (B) Utilice el trephine para extraer un disco de la membrana biomaterial. (C) Coloque la placa tórica en la cámara superior del dispositivo de montaje y, a continuación, coloque el disco biomaterial sobre él. (D) Atornille la cámara inferior a la cámara superior del dispositivo de montaje. (E) La cámara micro-Boyden montada está lista para ser esterilizada con 70% de etanol. (F) Sumergir la cámara micro-Boyden esterilizada en el medio de cultivo de tejido en el pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Células endoteliales y estromales corneales de oveja en los lados opuestos de una membrana de colágeno tipo I. Las células se tiñieron con faloiina rodadamina para visualizar actina (rojo) y Hoechst para visualizar núcleos (azul). La membrana tipo colágeno I no estaba manchada y por lo tanto no es visible en estas imágenes que fueron recogidas mediante microscopía confocal. (A) Una vista de sección transversal baja de la construcción de ingeniería tisular. Una capa delgada de actina que representa un cultivo de células endoteliales corneales es visible en la superficie superior de la membrana, y una capa más gruesa de actina que representa un cultivo de células estromales está presente en la superficie inferior de la membrana. Los núcleos azules no se muestran en esta imagen. (B) En vista de la cara de la capa de células endoteliales corneales que muestra tanto la mancha de actina como de los núcleos. (C) En vista de la cara de la capa de células estromales corneales que muestra tanto la mancha de actina como de los núcleos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Un desafío técnico significativo asociado con el establecimiento y la expansión de las células endoteliales corneales humanas es evitar que la EMT ocurra en los cultivos. La EMT se puede activar en las células endoteliales corneales por pérdida de contacto de célula a célula, sin embargo, la mayoría de los protocolos de cultivo celular para estas células implican disociación enzimática a células individuales durante el aislamiento y la subcultura¹⁰. Aquí presentamos un protocolo de cultivo celular alternativo para células endoteliales corneales que minimiza el riesgo de que las células pierdan contacto entre sí durante las etapas de aislamiento y subcultivo.

Nuestro método para establecer cultivos de células endoteliales corneales consiste en colocar explantas de la membrana del endotelio/Descemet de las córneas del donante en placas de cultivo de tejido en condiciones que permiten que las células migren colectivamente de las membranas y de las placas. Para que esto tenga éxito, la explantación debe formar un apego apretado a la placa de cultivo de tejido, y esto se logra mejor al no molestar la placa durante varios días después de que los cultivos se han establecido. Otro factor crítico en el establecimiento exitoso de cultivos celulares endoteliales corneales de los seres humanos es la edad del donante. Las tasas de éxito más altas tienden a alcanzarse a partir de donantes menores de 30 años de edad.

Una desventaja de utilizar el método de cultivo explantado para establecer cultivos celulares endoteliales corneales es el período relativamente largo que existe entre la configuración de los cultivos y la obtención de un gran número de células. Los llamados métodos de "peel-and-digest" implican eliminar el endotelio de las córneas del donante y digerirlo con enzimas para liberar las células para el cultivo^11. Estos tipos de métodos producirían cultivos que contienen más células inicialmente que las establecidas a partir de explantes.

Nuestro método de cultivo explantado para células endoteliales corneales produce cultivos que contienen células muy pequeñas, compactas y maduras de alta calidad. Sin embargo, los cultivos también contienen células más grandes, menos ideales hacia la periferia de la placa. Las células más grandes se pueden eliminar por digestión con TrypLE y se descartan si se desea, pero esto reduce el número de células disponibles para la subcultura. Sin embargo, los explantes que han iniciado con éxito cultivos de células primarias casi siempre son capaces de iniciar más cultivos celulares, y esta capacidad se puede explotar para obtener un gran número de células de alta calidad.

Nuestro método de subcultivo para células endoteliales corneales consiste en el uso de Dispase II para levantar suavemente los grupos celulares lejos de la placa de cultivo de tejido para su transferencia a placas nuevas, y aunque este método está diseñado para minimizar la posibilidad de QUE la EMT ocurra en células, cabe señalar que no reduce el riesgo a cero.

Ha sido el objetivo de muchos grupos desarrollar capas de células endoteliales corneales diseñadas por tejido sin tejido para fines de trasplante. Muchos materiales diferentes se han probado como portadores de las células y se han utilizado una variedad de métodos diferentes para impedir que el material se mueva en la placa de cultivo durante el cultivo celular. La mayoría de los métodos implican el anclaje del material a la superficie de la placa de cultivo de tejido de alguna manera, restringir el crecimiento celular a la superficie superior de la membrana solamente. Si bien estos métodos podrían utilizarse para producir capas únicas de endotelio corneal diseñado por tejido que serían equivalentes a los injertos de membrana de endotelio/Descemet (injertos DMEK), no podrían utilizarse para producir equivalentes de tejido de la membrana/injertos de estrávolo del endotelio/Descemet (injertos DSEK o DSAEK) que son más utilizados por los cirujanos. Por lo tanto, hemos desarrollado un dispositivo de montaje de membrana llamado cámara micro-Boyden que permite que las células se crezcan simultáneamente en ambas superficies de una membrana biomaterial suspendida, y lo hemos utilizado para producir injertos de ingeniería tisular que consisten en células endoteliales corneales y células estromas corneales en superficies opuestas de membranas de colágeno tipo I. Estos injertos de doble capa de tejido podrían utilizarse potencialmente para reemplazar los injertos derivados de la córnea de los donantes de endotelio y tejido estrogénico a ambos lados de la membrana de Descemet (injertos DSEK o DSAEK).

En resumen, los métodos presentados en este artículo están diseñados para aquellos que desean obtener células endoteliales corneales primarias de alta calidad para su uso en estudios de ingeniería de tejidos. Se describen métodos de cultivo suaves que están diseñados para reducir el riesgo de que las células se sometan a EMT y se presente un método para el cultivo de las células en membranas biomateriales suspendidas. Esperamos que estos métodos puedan ayudar a otros hacia sus objetivos de producir trasplantes de endotelio corneal con ingeniería de tejido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.