Summary
このプロトコルは、ドロショウジョウバエ幼虫を取り付け、無傷の生きている動物における10時間以上の中断のないタイムラプス画像を達成する方法を記載している。この方法は、幼虫の身体壁に近い多くの生物学的プロセスを画像化するために使用することができる。
Abstract
ライブイメージングは、細胞生物学の問題を調査するための貴重なアプローチです。ショウジョウバの幼虫は、幼虫の体壁とほとんどの内臓が透明であるため、生体内のライブイメージングに特に適しています。しかし、30分を超えて無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングは、幼虫を長時間非侵襲的に固定固定化することが困難であるため困難であった。ここでは、高時間的および空間的分解能を有する生きたショウジョウバエ幼虫を10時間以上連続的にイメージングできるLarvaSPAと呼ばれる幼虫取り付け方法を紹介する。この方法は、UV反応性接着剤を使用してカバースリップに幼虫を部分的に取り付け、さらにポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックを使用して幼虫の動きを抑制することを含む。この方法は、第二のインスターから放浪第三のインスターまでの発達段階での幼虫と互換性があります。我々は、デンドライトの成長および傷害誘発性の樹状皮質変性を含むショウジョウバエ体体性体性感覚ニューロンの動的プロセスを研究する上で、この方法の応用を実証する。この方法は、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するためにも適用することができます。
Introduction
タイムラプスライブイメージングは、動的細胞プロセスを研究するための強力な方法です。タイムラプス映画によって提供される空間的および時間的情報は、細胞生物学の質問に答えるために重要な詳細を明らかにすることができます。ショウジョウバエ幼虫は、その透明な体壁が内部構造1、2の非侵襲的なイメージングを可能にするので、ライブイメージングを使用した調査のための人気のインビボモデルとなっています。さらに、ショウジョウバエでは解剖学的構造および高分子を蛍光標識する多数の遺伝的ツールが利用可能である。しかし、ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化は困難である。静止した初期胚や子犬とは異なり、ショウジョウバエ幼虫は絶えず動き、ライブイメージングのために固定化が必要である。生きたショウジョウバエ幼虫を固定化する有効な方法は、クロロホルム4でハロカーボン油に取り付けること、イソフルランまたはジクロルボス溶液5を用いた麻酔、およびカバースリップと顕微鏡スライド6との間の圧縮を含む。これらの方法のいくつかは顕微鏡検査に使用されてきたが、いずれも長期のライブイメージングに有効ではない。他の方法は、従来の共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡7、8、9を用いて幼虫をクロールする際の身体壁ニューロンのイメージングのために開発された。しかし、これらの方法は、幼虫の動きによる細胞動態のモニタリングには理想的ではありません。
ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化を達成するための新しい方法が開発されました。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の「幼虫チップ」を使用すると、ショウジョウバエ幼虫は麻酔なしで特殊なマイクロチャンバーで真空発生吸引を通して効果的に固定化することができる。しかし、この方法は、細胞生物学の研究のための高い時間分解能を提供していないし、それは動物のサイズ10に厳しい制限を有する。麻酔装置を用いた別の方法は、ショウジョウバエ幼虫のライブイメージングを複数の時点で達成し、神経筋接合部11、12、13、14、15、16の研究に応用されている。しかしながら、この方法は、30分を超える連続イメージングを可能にせず、デスフルランを繰り返し使用する必要があり、これは神経活動を阻害し、研究された生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある17,18である。近年、微小流体装置と凍結麻酔を組み合わせた新しい方法が、短時間(分)19の間、様々なサイズの幼虫を固定化するために使用されている。しかし、この方法は、冷却システムなどの特殊なデバイスを必要とし、固定化の長い期間は、幼虫の繰り返し冷却を必要とします。
ここでは、10時間以上の時間経過画像化と互換性のあるショウジョウバエ幼虫を固定化する汎用性の高い方法を紹介します。この方法は「部分的な取り付けによる幼虫の安定化」(LarvaSPA)と呼び、幼虫のキューティクルをカスタムメイドのイメージングチャンバーでのイメージング用のカバースリップに付着することを含む。このプロトコルは、イメージングチャンバーを作る方法と、様々な発達段階で幼虫を取り付ける方法を説明します。LarvaSPA法では、UV反応性接着剤を使用して、所望のボディセグメントをカバースリップに貼り付けます。PDMS立方体はさらに幼虫に圧力をかけ、脱出を防ぐ。撮像チャンバー内の空気と水分は、イメージング中に部分的に固定化された幼虫の生存を保証します。他の技術よりもLarvaSPAの利点は次のとおりです:(1)それは高い時間的および空間的解像度で何時間も無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。(2)この方法は幼虫のサイズに対する制限が少ない。(3)イメージングチャンバーとPDMS立方体は、最小限のコストで製造することができ、再利用可能です。
幼虫の取り付け方法を説明することに加えて、ショウジョウバエ樹状樹状樹状樹状(da)ニューロンの樹状突起発生および樹状変性を研究するためのその応用例をいくつか紹介する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. イメージングチャンバーの作成
- 金属フレームは、典型的な機械工場のアルミニウムブロックから構築することができます。フレームの仕様を図 1A に示します。
- イメージングチャンバーを構築するには、長いカバースリップ(22mm×50mm)とUV接着剤(図1A)を使用して金属フレームの底部を密封します。手持ち型のUVランプを使用してUV接着剤を硬化させる。
2. PDMSの立方体を作る
- PDMS立方体の金型を準備します。
- 長方形(80mm×55mm)のペトリ皿または丸い細胞培養板の内面に包装テープの層を取り付けます。2番目のインスター幼虫には1層(厚さ0.063mm)、3番目の星内幼虫には2層(厚さ0.126mm)、後期3番目の星幼虫には3層(0.189mm厚)を使用します(図1B)。
- カミソリの刃でテープを特定の幅のストリップに切ります:1層テープの場合は1.5 mm、2層または3層テープの場合は2 mmです。ストリップの幅と厚さは、最終的なPDMS立方体が保持できる幼虫の大きさを決定します。2つのストリップの間に少なくとも5つのmmのスペースを残します。スペースを覆うテープ層を取り外します (図 1B)。
- 粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを除去します。金型は使用できる状態です。
- PDMS ミックスを準備します。
- PDMSベース7gと0.7gの硬化剤(10:1比)を小さな容器に完全に混ぜます。
- 容器を真空デシケーターに少なくとも15分間入れ、混合物から空気を取り除きます。
- PDMS混合物を約5.5gゆっくりと金型に注ぎ、厚さ1~2mmに達します(図1B)。
- PDMS混合物を少なくとも15分間真空乾燥器に再び入れ、混合物から残った気泡を除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。
- 65 °Cの熱インキュベーターで平らな表面でPDMSを2時間硬化させます。
- カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化PDMSを緩め、金型から取り外します。PDMS を室温で 2 枚の大きな粘着テープの間に保管します。
- 初期と後期の第3インスター幼虫の場合、PDMSを8mm x 2mm x 1mmの立方体に切り取り(図1Bの点線に沿って)、テープストリップ(ステップ2.1.2)によって作成された溝を立方体の長辺の中心に配置します(図1B,C)。2番目の星の幼虫の場合は、立方体を8mm x 1mm x 1mmに切ります。
3. 長期経過イメージングのための幼虫の取り付け
- 取り付け用の上部カバースリップを準備します。
- 幼虫の大きさに合った溝を持つ6つのPDMS立方体を選択してください。ステップ 2.1.1、2.1.2、および 2.2.7 に基づいて、推奨される PDMS の溝とサイズに従ってください。
- 粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。
- PDMS立方体を後で固定するために、長いカバースリップ(22 mm x 50 mm)に両面テープ(12 mm x 5mm)を4枚取り付けます。両面テープの 2 つの部分の間のスペースは、PDMS 溝の幅と同じにする必要があります。
- 各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴(〜1.2 μL)を適用し、カバースリップの両面テープ間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。
- 幼虫を取り付ける準備をします。
- 一対の鉗子を使用して、幼虫を水できれいにして、体表面から食べ物を取り除きます。
- 蓋をしない小さな(35mm)ペトリ皿に湿らせたティッシュペーパーの小片にきれいな幼虫を置きます。小さなペトリ皿を、乾燥したティッシュペーパーを入れた大きな(60mm)のペトリ皿に入れます。化学フードで、プラスチック製の移入ピペットを使用して、8~12滴のイソファフルラン(160~240 μL)をドライティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。
- 幼虫を監視しながら2~3分待ちます。口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。
- 動物をマウントします。
- 動物の後側の構造を画像化するには、カバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に固定された幼虫を置き、後方のキューティクルをカバースリップに向けます。
- 各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMSの溝の外に幼虫の頭と尾を残します。接着剤で幼虫の尖塔をふさぐのは避けてください。
- PDMSブロックの端を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。
- 高い設定(約0.07 mW/mm2)で手持ち式のUVランプを使用して、UV接着剤を4分間硬化します。
注意: UVランプを使用している間、安全メガネで目を保護してください。 - カバースリップを上下逆にして、手順 3.3.4 を繰り返します。
- レンズ紙(15mm×30mm)を20μL~30μLの水で湿らせた。湿ったレンズ用紙を撮像室の底部に置きます(図1A,D)。
- 幼虫がチャンバーの内側に面するように、カバースリップをチャンバーに置きます。UV接着剤(図1A、D)を使用して、カバースリップの両端を金属表面に接着します。幼虫の側側は共焦点顕微鏡下でイメージングの準備ができています (図 1E)。
4. イメージング
- 適切な顕微鏡による幼虫の画像。このプロトコル (図 2、図 3、 ビデオS2、ビデオ S3、ビデオ S4) に示されているすべての結果は、40 x (1.30 NA) オイルの目的を持つ共焦点システムを使用して取得されました。
5. イメージングチャンバーとPDMS立方体の回収
- 画像化後、レンズ用紙を使用して上部のカバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップとカミソリの刃で金属フレームの間のスペースに切り込んで、トップカバースリップを金属フレームから取り外します。イメージングチャンバーは再利用の準備ができています。
- PDMSの立方体を、上のカバースリップから鉗子で取り外します。粘着性のテープにPDMS立方体を転がして、接着剤の残留物やほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再使用の準備ができている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
幼虫のイメージ投射室は、カスタムメイドの金属フレームと2つのカバースリップを一緒に接着することによって構築されます。金属フレームの設計は、図1Aに指定されています。チャンバー内のショウジョウバエ幼虫は、UV接着剤とPDMS立方体の助けを借りてトップカバースリップに接着されます。PDMS立方体の溝と、立方体が取り付けられた両面テープは、幼虫を保持するスペースを作り出す(図1B、C)。PDMSはまた幼虫の体壁を平らにし、物理的に幼虫の動きを制限するために穏やかな圧力を加える。最後に、湿ったレンズ紙の小片は湿気を提供するために部屋の底に置かれる。このセットアップは連続的なイメージ投射のために10時間より長くショウジョウバエの幼虫を固定化できる。動物のほとんどは10時間後に生きており、膿期に成長するために回復することができる。撮像室は、一度に9匹までの幼虫を収容することができる。図1Dは、チャンバーに搭載された6つの後期第3の星内幼虫を示す。幼虫の幹は固定され、頭と尾は自由に動くことができます(図1EおよびビデオS1)。この方法は、最大15時間の連続高解像度イメージングで第3のインスター幼虫をさまよう第2のインスターを撮影するために成功しました。チャンバは直立顕微鏡を使用してイメージングのために設計されているが、セットアップは、単にチャンバーを反転させることによって、反転顕微鏡のためにも動作します。
ここでは、クラスIV da(C4 da)ニューロンをモデルとして使用して、神経樹状突起ダイナミクスと樹状変性を研究するLarvaSPAの応用をモデルとして示します(図2、図3、ビデオS2-S4)。C4 daニューロンは、幼虫の体壁に位置する体性感覚性ノシセプターであり、その樹状突起は幼虫表皮1、20、21、22を内膜する。C4ダデンドライトは幼虫の発達を通して非常に動的な成長行動を示し、その結果、体表面または空間充填23の完全なカバレッジをもたらす。C4daニューロンはまた、正常に24、25、26、27の物理的損傷後の樹状変性および再生の研究に使用されています。
デンドライトダイナミクスのイメージングでは、第2のインスターでの産卵後48時間(AEL)から放浪中の第3のインスターでの120時間AELまでの範囲の幼虫を、ポイントスキャン共焦点顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングのためにイメージングチャンバーに取り付けた。タイムラプス映画は、ppk-CD4-tdTomまたはPpk-Gal4によって駆動されるUAS-CD4-tdTomによってラベル付けされたC4 daデンドライトの成長行動をキャプチャするために3分間隔で撮影されました 6 .イメージング期間(最大12時間)を通じて、C4 daニューロンの高次樹状枝は、拡張、引き込み、分岐形成、および枝切除(図2A-2F)を含む複雑な成長行動を示し、ニューロンの健康状態を示す。私たちの映画はまた、他のデンドライトに接触した後にデンドライト先端が後退したホモタイピックデンドロデンドライト反発を捉えました(図2F)。全体として、これらの結果は、LarvaSPAを用いたタイムラプスイメージングが神経発達の研究に有効であることを示している。
デンドライト変性を画像化するために、MaiTaiレーザーを使用してC4 da神経細胞の近くの一次樹状突起を切断しました。幼虫を回収し、損傷後1.5時間(AI)から始まるイメージングのためにチャンバーに取り付けた(図3、ビデオS4)。映画は、樹状の腫れ、樹状の断片化、樹状の破片のクリアランスなど、樹状変性の間に重要な出来事を記録しました。同じ実験において、幼虫脂肪体はまた、アネキシンV−GFP(AV−GFP)を分泌するように設計され、細胞表面27に外的に付けられたホスファチジルセリン(PS)を標識するセンサーである。我々は、AV−GFPによる変性樹状突起の特異的標識を観察した(図3)、PSが退化デンドライトの表面に露出し、貪食細胞症27によるその後のクリアランスのためのイートミーシグナルとして機能することを示唆した。
図1:LarvaSPAマウント用のイメージングチャンバー。(A) 詳細な仕様を持つ画像室の図で、上部図と側面図の両方を示します。上部図の水色のシェーディングは、湿ったレンズ用紙を示しています。チャンバーは、上部カバースリップと底部カバースリップによって密封されています。取り付けられた幼虫の位置が例示される。(B) PDMSの金型(上図)とPDMS混合物(側面図)で充填した後の金型の図。グレーのストリップは、それぞれ 2 つの 1 層、2 つの 2 層、および 2 つの 3 層テープ ストリップを示します。側面図の黄色のシェーディングは、金型内の PDMS 混合物を示します。点線は、硬化したPDMSをカットする場所を示します。図の側面図は、拡大縮小に描画されません。(C) PDMS立方体の上図と側面図を示す写真。スケールバー=1mm(D)取り付け前の撮像チャンバーを示す写真、及び6個の第3の星型ショウジョウバエ幼虫を搭載した撮像室を上側に取り付けた。スケールバー = 10 mm(E) 幼虫の近い図 (D)スケールバー = 1 mm.この図の大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図2:樹状力学のタイムラプスイメージング(A-F)IV級ニューロンデンドライトのタイムラプス動画から選択されたフレームは、画像化開始後の特定の時点で行った。幼虫の画像は48時間AEL(AおよびF)、72時間AEL(B)、96時間AEL(C)、および120時間AEL(D)で撮影された。 ニューロンは、ppk>CD4-tdTom (A、 D、 E、 F) またはppk >CD4-tdTom (BおよびC) によってラベル付けされます。青い矢印は、前の時点と比較して樹状の引き込みが示されます。黄色の矢印は、前の時点と比較して樹状の延長を示します。(E) 12時間の画像化の終わりにデンドライト形態。(F)2番目の星内幼虫の樹状枝が伸びて(黄色い矢印)、別の樹状突起に接触した後に引き込まれた(青い矢印)方法を示す映画の中で3分間隔の連続フレーム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:デンドライト変性のタイムラプス画像化と、イートミー信号の暴露レーザー損傷後のクラスIVダニューロンのデンドライトを退化するタイムラプスムービーから選択されたフレーム。デンドライトはppk>CD4-tdTomによってラベル付けされました。退性デンドライトに関するイートミーシグナルPSは、脂肪体によって分泌されるアネキシンGFP(AV-GFP)によって検出された。黄色の矢印は、AV-GFP のラベル付けを示す分岐を指します。青い矢印は、断片化を起こしている樹状突を指します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオS1:第3のインスター幼虫はPDMS立方体のノッチに固定化される。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオS2:デンドライトは、第2のインスター幼虫に動的に伸び、引き込む。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオS3:デンドライトは、放浪する第3の星内幼虫に動的に伸び、引き込む。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオS4:デンドライトは、第3のインスター幼虫におけるレーザー損傷後に縮退し、ホスファチジルセリンを暴露する。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、長期経過イメージングのために生きたショウジョウバエ幼虫を取り付ける汎用性の高い方法であるLarvaSPAについて説明します。この方法は幼虫の回復や再装着を必要とせず、中断のないイメージングを可能にする。従って、樹状変性や再生など、完了までに数時間かかる生物学的プロセスを追跡するのに理想的です。この方法は、細胞内カルシウムの動態や微小管の成長などの細胞内事象のイメージングにも使用できます。幼虫の体壁がイメージング中に安定しているので、空間的および時間的な解像度は、手元のイメージングアプリケーションに合わせて調整することができます(例えば、細胞内小胞の動きが速いを追跡したり、神経枝パターンのゆっくりとした全体的な変化を監視する)。また、この方法は、様々な発達段階で幼虫と互換性があり、特別な装置を必要としません。したがって、LarvaSPAは、多様な質問に対処するために多くのショウジョウバエラボで潜在的に使用することができます。
PDMS立方体の性質や幼虫の発達段階など、この方法の成功に影響を与える因子
PDMSの立方体の大きさと溝の深さは、幼虫の大きさと一致する必要があります。幼虫には広すぎるPDMS立方体が頭と尾を覆い、低酸素症を引き起こす可能性があります。しかし、狭いPDMSの立方体は、幼虫の移動を防ぐのに有効ではないかもしれない。深すぎる溝も同様に、幼虫の動きを抑制するのに十分な圧力を発生しません。浅すぎる溝は、カバースリップに幼虫を付着させるのに十分な接着剤を保持しません。私たちの経験に基づいて、PDMSと溝の次の次元は幼虫の様々な段階のために推薦される:8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS立方体と第2の星幼虫のための1.5 mm x 1 mm x 0.063 mmの溝(~48 h AEL);初期の第3の星の幼虫のための2ミリメートルx 2ミリメートルx x 0.126 mm溝を持つ8ミリメートルx 2ミリメートルx 1ミリメートルPDMS立方体(約72h AEL);後期3番目の星幼虫のための2 mm x 2 mm x 2 mm x 0.189 mmの溝を持つ8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS立方体(約96h AEL以上)。
放浪する第三の星の幼虫(120h AEL以上)は、若いものに比べて移動が少なく、チャンバーに取り付けられた後に生き残るために必要な水分が少ない。彼らはまた、より厚いキューティクルを持っており、より多くの物理的なストレスに耐えることができます。したがって、放浪第3星幼虫を用いた実験は、最も成功率が高い。私たちの手では、放浪の第三の星内幼虫の80%以上が生き残り、取り付け後12時間不動のままでした。イメージング中に幼虫が子犬を予防するのを防ぐために、96時間から120時間の間に幼虫を取り付けることをお勧めします。若い3番目の星の幼虫は、画像中に脱出または死亡する可能性が高い。典型的には、同じチャンバに搭載された6つの若い3番目の星内幼虫のうち少なくとも2が生き残り、取り付け後10時間不動のままである。第二の星の幼虫との経験は限られており、生存率を推定することは困難です。それにもかかわらず、我々はこの方法を使用して7時間の第2の星内幼虫を正常に画像化した。
長期イメージングの潜在的な懸念
LarvaSPAは、樹状突起成長のダイナミクスと変性をイメージングするために非常に有用であったが、考慮すべきいくつかの潜在的な注意点があります。第一に、現在の方法では、幼虫はイメージングの全期間の間食物を奪われ、多くの組織で飢餓誘発反応を引き起こし得る。我々は、オートファジーに起因する可能性があり、約10時間の表皮細胞内の粒状構造の形成を観察した。したがって、画像化の最初の数時間で得られた結果は、より生理学的に関連するものであるべきである。より長い時間スケールの結果は、より慎重な解釈を必要とします。この懸念を最小限に抑えるために、私たちの手順は、幼虫の摂食を可能にするために適応される可能性があります。第二に、私たちの方法は、身体的制約と栄養摂取量の不足のために若い幼虫の急速な成長を妨げる可能性があります。しかし、この懸念は、古い動物には適用されない場合があります。例えば、3番目の星の幼虫を放浪することは、連続画像化の12時間後でさえ子犬に変わる可能性があるので、この方法は初期の変態の調査に理想的です。第三に、脂肪体や腸などのより深い構造のイメージングは、いくつかの課題を提示します。主な理由は、より深い組織がイメージング中に移動することが多いため、後処理でモーション修正が必要になることです。さらに、光路における屈折率の不一致は、より深い組織をイメージングする際に球面収差を引き起こす可能性があります。皮質の目的は、樹状突起が体表面から15μm以内にあるため、daニューロンのイメージングには適していますが、水浸漬目標は、幼虫の内部をより深くイメージングするための屈折率のミスマッチを修正するためのより良い選択肢となり得る。第四に、C4 daニューロンはUV光28によって活性化することができるので、幼虫の取り付け中にUV光を使用すると、C4 daニューロン生理学を変える可能性がある。推奨される光強度は、C4daニューロン28を堅牢に活性化するレベルをはるかに下回っていますが、C4daニューロン活動に関連する結果は慎重に解釈する必要があります。UV接着剤は、多種多様な生物学的サンプル29、30、31をイメージングするために使用されており、私たちの手の中の幼虫に明らかな毒性を引き起こしません。最後に、生体内のライブイメージングのための適切な顕微鏡のセットアップを検討する必要があります。例えば、共鳴スキャナとスピニングディスク共焦点顕微鏡は、光毒性や光の漂白を少なくするため、長期的なライブイメージングに適しています。多光子顕微鏡は幼虫のより深い内部構造を撮像するためにより効果的である;長期的なイメージングは、サンプルやフォーカスのドリフトが起こりやすいため、ポストイメージング処理によって修正される可能性があります。
LarvaSPAの最も一般的な障害の原因とそれらに対処するための推奨される解決策
- 幼虫の動きが多すぎたり逃れたりする:2つの一般的な理由がこの問題に寄与する可能性があります。1つ目は、PDMSの溝が幼虫にとって浅すぎるか深すぎる可能性があるということです。別の溝深度を持つ別のPDMS立方体を試みて、問題を解決してもよい。第二の理由は、室内に水分が多すぎて、UV接着剤を弱めるからです。チャンバー内のレンズ紙に加える水の量を減らすことは、幼虫を固定化するのに役立つかもしれません。また、頭部と尾部が自由に動けるため、PDMS立方体で覆われたセグメントのみを画像化してみてください。
- 幼虫は、画像中に死ぬ:幼虫が画像化後すぐに死んだ場合、それはあまりにも多くの麻酔薬にさらされた可能性が高い。適切に麻酔された幼虫は、取り付けた後に目を覚まし、口のフックの延長と引き込みおよび後血管収縮を含む動きを示す必要があります。この問題を解決するために、より少ないイソファフルランを使用して幼虫を麻酔することができる。口フックが動かなくなった直後に麻酔ペトリ皿から幼虫を移す。幼虫が画像撮影から約1時間後に死ぬ場合、それは通常脱水症状のためである。密閉する前に、湿ったレンズ用紙をイメージングチャンバーに入れますので、忘れずに入れます。致死性のもう一つの一般的な理由は、UV接着剤が尖塔をブロックすることです。紫外線の接着剤を幼虫の中央のセグメントに制限し、頭と尾を覆わないようにしてください。過度に広いPDMS立方体はまた、簡単に尖塔をブロックするUV接着剤を引き起こす可能性があります。
- 体壁の折り目がイメージングを妨げる:取り付け中に折り目を発生させないようにするには、麻酔段階で幼虫を完全に固定することが重要です。幼虫が麻痺すると、体をまっすぐに伸ばすのが簡単です。96時間AELより古い動物の場合、UV接着剤を硬化させる前に尾をそっとドラッグすると、折り目の形成を効果的に減らすことができます。若い幼虫の尻尾を引きずることは、体の壁が壊れやすいのでお勧めできません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは競合する利益を宣言していない。
Acknowledgments
以前のバージョンのLarvaSPAメソッドを確立してくれたリンフェン・タンに感謝します。イメージングチャンバーの以前のプロトタイプを作るためのコーネルオリンホールマシンショップでグレンスワン。金属フレームを構築し、PDMS立方体を作るための提案を提供するためのフィリップ・イザーマン;コーネル BRC 顕微鏡へのアクセスのための施設 (NIH 助成金 S10OD018516)原稿の批判的な読書のためのマリア・サパー。この作品は、H.J.に授与されたコーネル・フェローシップによって支えられ、H.J.に授与されました。C.H.H.J.とC.H.に授与されたコーネルのスタートアップファンドとNIH助成金(R01NS099125とR21OD023824)は、プロジェクトを考案し、実験を設計しました。H.J.が実験を行った。H.JとC.H.は原稿を書いた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
