Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת הזחלים של דרוזוהילה כדי להשיג יותר מ-10 שעות של הדמיה של הפרעות זמן בבעלי חיים חיים שלמים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמות תהליכים ביולוגיים רבים קרוב לקיר הגוף הזחל.
Abstract
הדמיה חיה היא גישה רבת ערך לחקירת שאלות בביולוגיה של התאים. הזחל של דרוזוהילה מתאים במיוחד להדמיה vivo חיה, משום שהקיר של גוף הזחל והאברים הפנימיים ביותר הם שקופים. עם זאת, הדמיה חיה רציפה של הזחלים של דרוזוהילה שלמים במשך יותר מ -30 דקות מאתגרת משום שקשה לשתק את הזחלים במשך זמן רב. כאן אנו מציגים שיטה הרכבה זחל בשם LarvaSPA המאפשרת הדמיה רציפה של הזחלים לחיות Drosophila ילה עם רזולוציה גבוהה בזמן ומרחבית במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו כרוכה חלקית הצמדת הזחלים כדי coverslip באמצעות דבק UV-תגובתי ובנוסף הרחקה התנועה זחל באמצעות polydiמתיל siloxane (PDMS) לחסום. שיטה זו תואמת לזחלים בשלבים ההתפתחותיים משלב שני ועד לנדידה השלישית. אנו מדגימים יישומים של שיטה זו במחקר תהליכים דינמיים של הנוירונים המגע הדרוזופילה, כולל הצמיחה דנדט וניוון הנגרמת מפגיעת הדנדריטים. ניתן ליישם שיטה זו גם על מנת לחקור תהליכים סלולאריים רבים אחרים המתרחשים ליד קיר הזחל.
Introduction
הדמיה בזמן ההדמיה החיה היא שיטה רבת-עוצמה ללימוד תהליכים סלולאריים דינמיים. המידע המרחבי והזמני המסופק על ידי סרטים בזמן קפיצה יכול לחשוף פרטים חשובים למענה לשאלות בביולוגיה של התא. הזחל Drosophila ילה היה פופולרי במודל vivo לחקירות באמצעות הדמיה חיה, כי קיר הגוף השקוף שלה מאפשר הדמיה לא פולשנית של מבנים פנימיים1,2. בנוסף, כלים גנטיים רבים זמינים ב Drosophila ילה כדי fluorescently תווית מבנים אנטומיים ו3. עם זאת, הדמיה לטווח ארוך של הזחלים של דרוזוהילה מאתגרת. בשונה מעוברים מוקדמים נייחים או מגלמים, הזחלים דרוזופילה מתרחקים כל הזמן, ומצריכות הדמיה חיה. דרכים יעילות לשתק את הזחלים החיים בדרוזוהילה כוללים הרכבה בשמן הלוגן עם כלורופורם4, הרדמה באמצעות התמיסה Isof, או dichlorvos5, ודחיסה בין הכיסויים לבין שקופית המיקרוסקופ6. למרות שחלק מהשיטות הללו שימשו למיקרוסקופיה, אף אחד מהם אינו יעיל להדמיה חיה לטווח ארוך. שיטות אחרות פותחו עבור הדמיה קיר גוף נוירונים בזחלים זוחלים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקרוסקופית קונבנציונאלי אוהאור גיליון מיקרוסקופ 7,8,9. עם זאת, שיטות אלה אינן אידיאליות לניטור הדינמיקה התאית בשל התנועה של הזחלים.
שיטות חדשות פותחו על מנת להשיג הדמיה ארוכת טווח של הזחלים של דרוזוהילה . באמצעות שימוש פולידימיתיל siloxane (PDMS) "זחל", הזחלים Drosophila ילה ניתן להשתמש ביעילות באמצעות שאיבה שנוצר על ידי ואקום במיקרו בחדר מיוחד בלי לרפוטיזציה. עם זאת, שיטה זו אינה מציעה רזולוציה גבוהה בזמן עבור לימודי הביולוגיה של התא והיא בעלת מגבלות קפדניות על מידה10של בעלי חיים. שיטה נוספת המשתמשת במכשיר ההרדמה השיגה הדמיה חיה של הזחלים של דרוזופילה בנקודות זמן מרובות, והחלה לחקור את הצמתים הנוירוקולסטיים11,12,13,14,15,16. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת הדמיה רציפה במשך יותר מ -30 דקות ודורשת שימוש בדפלוראנה שוב ושוב, אשר יכול לעכב את הפעילות העצבית ולהשפיע על התהליך הביולוגי שנלמד17,18. לאחרונה, שיטה חדשה המשלבת התקן microflu, וקריוהרדמה השתמשו כדי לשתק את הזחלים בגדלים שונים לפרקי זמן קצרים (דקות)19. עם זאת, שיטה זו מחייבת התקנים מיוחדים כגון מערכת קירור, ופרקי זמן ארוכים יותר דורשים צינון חוזר ונשנה של הזחלים.
כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית של הזחלים דרוזופילה שתואם לדימות זמן ממושך של הדמיה במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו, אשר אנו מכנים "ייצוב זחל על ידי קובץ מצורף חלקית" (LarvaSPA), כרוך שמירה על העור הזחל לתוך coverslip עבור הדמיה בחדר הדמיה בנוי אישית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך את חדר ההדמיה וכיצד לטעון זחלים במגוון שלבים התפתחותיים. בשיטה LarvaSPA, מקטעי הגוף הרצוי מודבקת את שמיכות באמצעות דבק UV-תגובתי. בנוסף, מתחיל הלחץ על הזחלים של PDMS, מניעת בריחה. האוויר והלחות בחדר ההדמיה מבטיחים את הישרדותם של הזחלים המוחדרים חלקית במהלך ההדמיה. היתרונות של LarvaSPA על טכניקות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (1) זוהי השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה מתמשכת של הזחלים הדרוזופילה שלמים במשך שעות עם הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית; (2) לשיטה יש פחות הגבלות על גודל הזחל; (3) חדר ההדמיה ו-pdms קובוידס יכול להיות מיוצר בעלות מינימלית הם לשימוש חוזר.
בנוסף לתיאור שיטת הרכבת הזחל, אנו מספקים מספר דוגמאות של היישום שלה לחקר התפתחות הדנדריטים ו הדנדריטים מניוון של דרוסופילה הדנדריטים הדנדריזציה (da) נוירונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפיכת חדר ההדמיה לתמונה
- ניתן לבנות את מסגרת המתכת מבלוק אלומיניום בחנות מכונות טיפוסית. המפרט של המסגרת מומחש באיור 1א.
- כדי לבנות את חדר ההדמיה, לאטום את החלק התחתון של מסגרת מתכת באמצעות coverslip ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) ו-UV דבק (איור 1א). מרפאים את הדבק UV באמצעות מנורת UV שנערך ביד.
2. ביצוע pdms קובוידס
- הכן את העובש. לגבי cuboids של PDMS
- צרף שכבות של נייר אריזה למשטח הפנימי של מלבני (80 מ"מ x 55 מ"מ) צלחת פטרי או לוח עגול התרבות התאים. השתמש בשכבה אחת (0.063 מ"מ עבה) עבור הזחלים השני, 2 שכבות (0.126 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישי מוקדם, או שלוש שכבות (0.189 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישיהראשון העשרה (איור 1B).
- חותכים את הקלטת לרצועות של רוחב ספציפי עם להב תער: 1.5 mm עבור הקלטת 1-layer, ו-2 מ"מ עבור קלטת 2-שכבה או 3-שכבה. רוחב ועובי של הרצועה יקבע את גודל הזחלים כי קוביות PDMS הסופי יכול להחזיק. השאירו לפחות מרווח של 5 מ"מ בין שתי הרצועות. הסר את שכבות הקלטת המכסות את השטח (איור 1B).
- להסיר אבק מהמשטח הפנימי של הצלחת באמצעות סרט דביק. . העובש מוכן לשימוש
- הכן את תמהיל ה-PDMS.
- מערבבים 7 גרם של בסיס PDMS ו 0.7 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) ביסודיות במיכל קטן.
- מניחים את המיכל בתוך ואקום desiccator לפחות 15 דקות כדי להסיר את האוויר מן התערובת.
- לאט למזוג כ 5.5 g של התערובת PDMS על התבנית כדי להגיע לעובי של 1 – 2 מ"מ (איור 1B).
- מניחים את התערובת PDMS ב ואקום desiccator שוב לפחות 15 דקות כדי להסיר את בועות האוויר הנותרים מן התערובת. לשבור את הבועות האחרונים עם טיפ פיפטה.
- לרפא את PDMS על משטח שטוח בחממה חום ב 65 ° c עבור 2 h.
- השתמש להב גילוח כדי לשחרר את PDMS נרפא לאורך קצה העובש ולנתק אותו מן העובש. אחסן את ה-PDMS בין שתי פיסות נייר דביק גדול בטמפרטורת החדר.
- עבור הזחלים השלישי מוקדם ומאוחר, לחתוך את pdms לתוך 8 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מילימטר קובוידס (לאורך הקווים מנוקד באיור 1B) על-ידי מיקום החריץ שנוצר על-ידי רצועת הקלטת (step 2.1.2) במרכז הצד הארוך של התיבה (איור 1ב, ג). עבור הזחלים השני, לחתוך את התיבה כדי 8 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ.
3. הרכבה הזחלים לאורך זמן להדמיה לטווח ארוך
- הכינו את הכיסויים העליונים להרכבה.
- לבחור שש pdms קובוידס עם חריצים התואמים את הגדלים של הזחלים. בצע את החריץ והגודל המומלצים של PDMS בהתבסס על שלבים 2.1.1, 2.1.2 ו2.2.7.
- להסיר אבק מהמשטח של PDMS עם קלטת דביק.
- צרף ארבע חתיכות של קלטת כפולה (12 מ"מ x 5 מ"מ) על שמיכות ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) לתיקון קובוידס pdms מאוחר יותר. הרווחים בין שתי הפרוסות של הסרט הכפול אמורים להיות זהים לרוחב החריץ של PDMS.
- החל טיפה קטנה (~ 1.2 μL) של דבק UV לתוך החריץ של כל אחד מקוביות ה-PDMS והוסף שש טיפות קטנות של דבק UV לחלל שבין הקלטת הכפולה על הכיסויים.
- . הכן את הזחלים להרכבה
- באמצעות זוג מלקחיים, לנקות את הזחלים במים כדי להסיר מזון מפני השטח של הגוף.
- הניחו את הזחלים הנקיים על פיסת נייר קטנה של רקמה מצומצמת בצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) ללא מכסה. מניחים את צלחת פטרי קטנה לתוך גדול (60 מ"מ) צלחת פטרי המכילה פיסת נייר טישו יבש. בשכונה כימית, להחיל 8 – 12 טיפות (160-240 μL) של isof, על נייר הרקמה היבשה באמצעות הצנרת פלסטיק העברת ולסגור את המכסה של צלחת פטרי גדול.
- המתן 2 – 3 דקות תוך ניטור הזחלים. להוציא את הזחלים מהצלחת פטרי גדולה פעם ווים הפה שלהם להפסיק לזוז.
- . הר החיות
- כדי מבני התמונה בצד השני של החיה, מניחים את הזחלים מקיבוע על הדבק UV בין הקלטת הדו על הכיסויים עם הקוטיקולה הצדדית מול הכיסויים.
- לכסות כל זחל עם בלוק PDMS ולהתאים את המטען של הזחל לתוך החריץ של PDMS. השאר את הראש ואת זנב הזחל מחוץ לחריץ PDMS. הימנע מחסימת הנושפות של הזחל על ידי הדבק.
- לחץ על קצות הבלוק של PDMS אל הקלטת הכפולה מבלי להחיל כוח על החריץ. משוך בעדינות את זנב הזחל כדי לשטח את הקוטיקולה מתחת ל-PDMS.
- לרפא את הדבק UV עבור 4 דקות באמצעות מנורת UV מוחזק ביד בסביבה גבוהה (על 0.07 mW/mm2).
התראה: הגן על העיניים עם משקפי הבטיחות בעת שימוש במנורת UV. - הפוך את הכיסויים הפוכים וחזור על שלב 3.3.4.
- מויסטן חתיכה קטנה של נייר עדשה (15 מ"מ x 30 מ"מ) עם 20 μL – 30 μL של מים. הציבו את נייר העדשה ההרטיב בתחתית חדר ההדמיה (איור 1א, ד).
- הניחו את הכיסויים על החדר כדי שזחלים יהיו מול החלק הפנימי של החדר. לדבוק שני הקצוות של שמיכות למשטח המתכת באמצעות דבק UV (איור 1A, D). הצד השני של הזחלים מוכן להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1E).
4. הדמיה
- הזחלים של התמונה עם המיקרוסקופ המתאים. כל התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה (איור 2, איור 3, וידאו S2, S3 וידאו, ו- video S4) נרכשו באמצעות מערכת קונפוקלית וקד עם 40x (1.30 NA) מטרת הנפט.
5. השחזור של חדר הדמיה pdms קובוידס
- לאחר הדמיה, להסיר את השמן על שמיכות העליון באמצעות נייר עדשה. לנתק את שמיכות העליון מתוך מסגרת מתכת על ידי חיתוך לחלל בין שמיכות ומסגרת מתכת עם להב תער. . חדר ההדמיה מוכן לשימוש חוזר
- לנתק את קובוידס pdms מתוך coverslip העליון עם מלקחיים. גלגל את קובוידס pdms על סרט דביק כדי להסיר שאריות דבק אבק. קובוידס pdms מוכנים לשימוש חוזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חדר ההדמיה הזחל נבנה על ידי הדבקת מסגרת מתכת בהתאמה אישית ושני כיסוי ביחד. העיצוב של מסגרת המתכת מצוין באיור 1א. הזחלים של דרוזופילה בתוך החדר מדבקים לסרבל העליון בעזרת דבק UV ו-pdms cuboids. החריץ בתיבה הצדדית PDMS ובקלטת הדו-צידית מצורפת התיבה כדי ליצור את החלל להחזיק את הזחלים (איור 1ב, ג). PDMS מחיל גם לחץ עדין כדי לשטח את קיר הזחל הגוף ולהגביל פיזית את תנועת הזחל. לבסוף, פיסת נייר קטנה של עדשה רטובה ממוקם בתחתית החדר כדי לספק לחות. הגדרה זו יכולה לשתק את הזחלים של דרוזופילה במשך יותר מ -10 שעות להדמיה רציפה. רוב החיות הם בחיים לאחר 10 h והוא יכול להיות התאושש לצמוח לשלב גולמי. חדר ההדמיה יכול להכיל. עד תשעה זחלים בו איור 1D מראה שישה הזחלים השלישי מאוחר מותקן בחדר. גזעי הזחלים קבועים בעוד ראשיהם וזנבות חופשיים לזוז (איור 1E ו- וידאו S1). שיטה זו שימש בהצלחה ליצירת תמונה השנייה לנדוד הזחלים השלישי עם הדמיה רציפה ברזולוציה גבוהה עד 15 h. החדר מיועד הדמיה באמצעות מיקרוסקופים זקוף, אבל ההתקנה פועלת גם עבור מיקרוסקופים הפוכה על ידי פשוט היפוך החדר.
כאן אנו להדגים את היישום של LarvaSPA בחקר הדינמיקה העצבית הנוירולית ואת ניוון דנדריטים באמצעות class IV da (C4 da) נוירונים כמודל (איור 2, איור 3, וידאו S2 – S4). הנוירונים מצויים בקיר הגוף הזחל, שהדנדטים שלהם innervate את הזחל האפידרמיס1,20,21,22. במהלך פיתוח הזחל מוצגים התנהגויות התפתחות דינמיות ביותר לאורך ההתפתחות, וכתוצאה מכך כיסוי מלא של משטח הגוף או מילוי השטח23. הנוירונים C4 גם השתמשו בהצלחה כדי לחקור את ניוון הדנדריטים והתחדשות לאחר פציעה פיזית24,25,26,27.
עבור הדמיה הדינמיקה ההדמיה, הזחלים החל 48 h לאחר הנחת ביצה (ח נ) במהלך השלב השני כדי 120 h ח ב הנדידה השלישית לשוטט היו רכוב בחדר ההדמיה עבור הדמיה בזמן ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ הנקודה-סריקה קונפוקלית. סרטים בזמן קפיצה צולמו עם מרווח של 3 דקות כדי ללכוד התנהגויות הצמיחה של הדנדריטים C4-da מתויג על ידי ppk-CD4-tdtom או UAS-CD4-tdtom מונע על ידי ppk-Gal46. במהלך תקופת ההדמיה (עד 12 שעות), הסניפים הגבוהים של הדנדריטים של נוירונים C4 הציגו התנהגויות צמיחה מורכבות, כולל הארכה, הנסיגה, הקמת הסניף, ואת הענף חיסול (איור 2A – 2f), המציין את בריאות הנוירונים. הסרטים שלנו גם נתפסו הומוטיפקס dendro-דנדט בעוד שבהם מטיפים דנדריטים לאחר יצירת קשר עם דנדטים אחרים (איור 2F). בסך הכל, תוצאות אלה מדגימים כי הדמיה בזמן ההדמיה באמצעות LarvaSPA יעיל ללימוד התפתחות עצבית.
כדי התמונה ניוון הדמות, השתמשנו לייזר מוצרים כדי לנתק את הדנדריטים הראשי ליד הגופות הגוף העצבי C4. הזחלים התגלו ורכוב בתא עבור הדמיה החל 1.5 h לאחר הפגיעה (AI) (איור 3, וידאו S4). הסרטים הקליטו אירועי מפתח במהלך ניוון דנדריטים, כולל התנפחות הדנדריטים, פיצול דנדט, והרשאה של שרידים דנדריטים. באותו ניסוי, שומן זחל הגוף תוכנן גם כדי להפריש את ה-V-GFP (AV-GFP), חיישן כי תוויות זרחן המלא השפעה (PS) על פני השטח של התא27. הבחנו תיוג ספציפי של הדנדריטים המיוצרות על ידי AV-GFP (איור 3), המעיד כי PS נחשף על פני השטח של הדנדריטים הדנדטים כדי לשמש כאות לאכול אותי עבור הסיווג הבאים על ידי phagocyציטוזה27.
איור 1: חדר ההדמיה עבור הרכבה LarvaSPA. (א) דיאגרמות של חדר ההדמיה עם מפרטים מפורטים, המציגה הן את התצוגה העליונה והן את התצוגה הצדדית. ההצללה הכחולה הקלה בתצוגה העליונה מצביעה על נייר העדשה הלחלח. החדר חתום ע י שמיכות. ושמיכות למטה המיקום של זחל טעון מומחש. (ב) דיאגרמות של תבנית pdms (התצוגה העליונה) ואת העובש לאחר מילוי עם התערובת pdms (מבט צדדי). רצועות באפור מציינות שתי שכבות 1, שתי שכבות ושתי רצועות סרטים של 3 שכבות, בהתאמה. ההצללה הצהובה בתצוגה הצדדית מציינת את התערובת של PDMS בתבנית. הקווים המנוקדים מציינים היכן לגזור את ה-PDMS הנרפא. תצוגת הצד של הדיאגרמה אינה נמשכת לקנה המידה. (ג) תצלומים המציגים מבט מלמעלה ותצוגה צדדית של קוביות מסוימות של pdms. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. (ד) תצלומים המציגים חדר הדמיה לפני ההרכבה, וחדר הדמיה עם שישה הזחלים השלישי מתחת למטה Drosophila ילה מעלה למעלה. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. (ה) תצוגה מקרוב של זחל ב (ד). סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זמן הדמיה של הדינמיקה הדנדט. (A-F) מסגרות נבחרות מסרטי מעידה בזמן של המחלקה הרביעית של תא העצב הרביעי של מחלקה, בנקודות זמן מסוימות לאחר תחילת ההדמיה. התמונות של הזחלים נלקחו 48 h ח ' (א ו- ו), 72 h ח (ב), 96 h ח ' (ג), 120 ו-h ח (ד). הנוירונים מתויגים על ידי פ > CD4-tdtom (A, D, E, F) או פ > CD4-tdtom (B ו- C). חיצים כחולים מציינים את הדנדריטים retractions בהשוואה לנקודת הזמן הקודמת. חיצים צהובים מציינים הרחבות דנדריטים בהשוואה לנקודת הזמן הקודמת. (ה) דנדריטים מורפולוגיה בסוף 12 ה ' הדמיה. (ו) מסגרות עוקבות עם 3 מרווחי זמן בסרט הממחישות כיצד ענף דנדט בזחל השני הוארך (חיצים צהובים) ולאחר מכן שורק לאחר מכן (חיצים כחולים) לאחר שיצר קשר עם דנדטה אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זמן ההדמיה הדמיה של הדנדריטים ניוון וחשיפה של אות לי לאכול. מסגרות נבחרות מסרט הפקיעה בזמן של הפקת דנדטים של מחלקה הרביעי של תא העצב לאחר פגיעת לייזר. הדנדריטים סומנו על ידי ppk > CD4-tdTom. האות "לאכול אותי" PS על ביטול הדנדריטים הדנדטים זוהה על ידי אנשין-GFP (AV-GFP), אשר מופרש על ידי גוף השומן. חיצים צהובים מצביעים על הענפים המציגים תיוג AV-GFP. חיצים כחולים מצביעים. על הדנדריטים שעוברת בפיצול אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו S1: זחל החריץ השלישי הוא ללא קיבוע בחריץ של מחשב התיבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו S2: דנדריטים להאריך ולסגת באופן דינאמי בתוך הזחל השני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו S3: דנדטים להאריך ולסגת באופן דינאמי בתוך הזחל השלישי נודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו S4: דנדטים מנוונת לחשוף זרחן לאחר פגיעה בלייזר בתוך הזחל השלישי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים LarvaSPA, שיטה רב-תכליתית של הרכבה חיה דרוזופילה לחיות לטווח ארוך הדמיה הזמן. שיטה זו אינה דורשת החלמה או הרכבה מחדש של זחלים, המאפשרים הדמיה ללא הפרעה. לכן הוא אידיאלי למעקב אחר תהליכים ביולוגיים שייקח שעות להשלים, כגון ניוון דנדט והתחדשות. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור הדמיה הדינמיקה הסידן תאיים ואירועים subcellular כגון צמיחה מיקרוטודורית. כאשר קיר גוף הזחל יציב במהלך ההדמיה, את הרזולוציה המרחבית והטמפורלית ניתן לכוונן כדי להתאים את יישום ההדמיה בהישג יד (למשל, כדי לעקוב אחר תנועת subcellular מהירה או כדי לפקח על שינויים כלליים איטי של דפוסי הסתעפות עצביים). בנוסף, שיטה זו תואמת לזחלים בשלבים התפתחותיים שונים ואינה דורשת ציוד מיוחד. לפיכך, לאראפה יכול לשמש הרבה מעבדות דרוזוהילה לטיפול בשאלות מגוונות.
גורמים המשפיעים על הצלחת השיטה, כולל האופי של התיבה הבין-PDMS לבין השלב ההתפתחותי של הזחלים
הגודל של קוביות PDMS ועומק החריץ צריך להתאים את גודל הזחלים. תיבה של PDMS רחב מדי עבור הזחלים יכולים לכסות את הראש ואת הזנב ולגרום היפוקסיה. עם זאת, תיבה מצומצמת של PDMS לא יכולה להיות יעילה במניעת הזחלים מלנוע. חריץ עמוק מדי באופן דומה לא יפיק מספיק לחץ כדי לרסן את התנועה של הזחלים. קצב רדוד מדי לא יחזיק מספיק דבק כדי להדביק את הזחלים על הכיסויים. בהתבסס על הניסיון שלנו, את הממדים הבאים של pdms ואת החריץ מומלצים עבור שלבים שונים של הזחלים: 8 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מילימטר pdms קובוידס עם 1.5 mm x 1 מ"מ x 0.063 מ"מ חריצים עבור הזחלים השני (~ 48 h); 8 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מילימטר pdms קובוידס עם 2 מ"מ x 2 מ"מ x 0.126 מ"מ חריצים עבור הזחלים השלישי מוקדם (~ 72 h); 8 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מילימטר pdms קובוידס עם 2 מ"מ x 2 מ"מ x 0.189 מ"מ חריצים עבור הזחלים השלישי מאוחר (~ 96 h או יותר).
נדודים הזחלים השלישי (ב או מעל 120 h ח) לנוע פחות לעומת אלה צעירים דורשים פחות רטיבות לשרוד פעם רכוב בחדר. יש להם גם קוטיקולה עבה יותר והוא יכול לסבול יותר לחץ פיסי. לכן, ניסויים המשתמשים נודדים הזחלים השלישי יש את שיעור ההצלחה הגבוהה ביותר. בידינו, יותר מ-80% מהרימות השליפות השלישית שרדו ונשארו במקום 12 שעות לאחר ההרכבה. כדי למנוע הזחלים מהרימות במהלך ההדמיה, אנו ממליצים לשלב את הזחלים בין 96 h ל 120 h. הזחלים הצעירים ביותר השלישי יש סיכוי גדול יותר של בריחה או מוות במהלך ההדמיה. בדרך כלל, לפחות 2 מתוך 6 הזחלים הצעירים שלישית הצעיר רכוב באותו חדר היה לשרוד ולהישאר משותק 10 h לאחר הטעינה. הניסיון שלנו עם הזחלים השני הוא מוגבל ואת שיעור ההישרדות קשה להעריך. עם זאת, יש לנו בהצלחה בתמונה הזחלים השני במשך 7 שעות שימוש בשיטה זו.
חששות פוטנציאליים של הדמיה ארוכת טווח
למרות LarvaSPA כבר שימושי מאוד עבור הדמיה דנדט התפתחות דינמיקה וניוון, יש כמה אזהרות פוטנציאליות לשקול. ראשית, בשיטה הנוכחית שלנו, הזחלים מונעים מזון למשך כל ההדמיה, אשר עלול להוביל לתגובות רעב המושרה ברקמות רבות. יש לנו נצפתה היווצרות של מבנים גרגירים בתאים עוריות סביב 10 h לאחר ההרכבה, אשר עשוי לנבוע האוטומטי. לכן, התוצאות שהושגו בשעות הראשונות של ההדמיה צריכות להיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית. התוצאות של סולמות זמן ארוכות יותר דורשות פרשנות זהירה יותר. כדי למזער את הדאגה הזאת, ההליך שלנו עלול להיות מותאם כדי לאפשר הזנה של זחל. שנית, השיטה שלנו עלולה להפריע לצמיחה המהירה של הזחלים הצעירים בשל האילוץ הפיזי וחוסר צריכת המזון התזונתי. עם זאת, ייתכן שדאגה זו לא תחול על בעלי חיים מבוגרים. לדוגמה, הזחלים המשוטטים השלישי יכולים להפוך לגלמים גם לאחר 12 שנים של הדמיה רציפה, מה שהופך את השיטה האידיאלית לחקירות של מטמורפוזה מוקדמת. שלישית, הדמיה של מבנים עמוקים כגון גוף השומן והבטן מציג אתגרים מסוימים. הסיבה העיקרית היא כי רקמות עמוקות לעתים קרובות לנוע במהלך הדמיה ולכן דורשים תיקון התנועה ב-postprocessing. בנוסף, אי התאמות של מדדי השבירה בנתיב האור יכול לגרום לסטייה כדורית כאשר הדמיה רקמות עמוקות יותר. בעוד מטרות הנפט מתאימים להדמיה דה נוירונים כי הדנדריטים שלהם הם בתוך 15 יקרומטר מפני השטח של הגוף, מטרות טבילה מים יכול להיות בחירה טובה יותר כדי לתקן השבירה-אינדקס האי-התאמות להדמיה עמוק יותר בתוך הזחלים. הרביעי, כי הנוירונים C4-da יכול להיות מופעל על ידי אור UV28, שימוש באור uv במהלך הרכבה זחל יכול לשנות את הפיזיולוגיה של לעצב C4. למרות עוצמת האור שאנו ממליצים הוא הרבה מתחת לרמות כי מכבש להפעיל C4da נוירונים28, תוצאות הקשורות C4da הפעילות העצבית צריך להיות מפורש בזהירות. הדבק האולטרא סגול שימש לדימות מגוון רחב של דגימות ביולוגיות29,30,31 ואינו גורם לרעילות ברורה לזחלים בידינו. לבסוף, יש לשקול את ההתקנה הנכונה של המיקרוסקופ עבור vivo live הדמיה. לדוגמה, סורקי תהודה ומיקרוסקופים של דיסק מסתובב בעלי אפשרויות טובות יותר להדמיה ארוכת טווח לאורך זמן, משום שהן גורמות לפוטורעילות פחות ופוטולבנה; מיקרוסקופ רב-פוטון יעיל יותר לדימות מבנים פנימיים עמוקים יותר בזחלים; הדמיה ארוכת טווח יכול להיות נוטה לדגום או להתמקד נסחף, אשר עלול להיות מתוקן על ידי עיבוד לאחר הדמיה.
הסיבות השכיחות ביותר לכישלון עבור LarvaSPA והפתרונות המומלצים כדי לטפל בהם
- הזחלים זזים יותר מדי או לברוח: שתי סיבות נפוצות יכול לתרום לבעיה זו. הראשון הוא שקצב ה-PDMS עשוי להיות רדוד מדי או עמוק מדי עבור הזחלים. מנסה אחר קוביות PDMS עם עומק חריץ שונה עשוי לפתור את הבעיה. הסיבה השנייה היא כי יש יותר מדי לחות בחדר, היחלשות דבק UV. הפחתת עוצמת המים הנוספת לנייר העדשה בחדר עשויה לסייע לשתק את הזחלים. בנוסף, מנסים לצלם רק את הקטעים המכוסים על-ידי התיבה בקוביות PDMS, משום שהראש והזנב חופשיים לזוז.
- הזחלים מתים במהלך הדמיה: אם הזחל מת בקרוב לאחר הדמיה, סביר להניח שהוא נחשף הרדמה יותר מדי. הזחלים מורדם כראוי צריך להתעורר לאחר הרכבה ולהראות תנועות כולל הארכת וו הפה והנסיגה ואת התכווצות הספינה הגבי. כדי לפתור את הבעיה, פחות. משתמשים יכולים להשתמש בזחלים העבר זחל מתוך צלחת פטרי ההרדמה מיד לאחר וו הפה מפסיק לנוע. אם הזחל מת כשעה לאחר הדמיה, זה בדרך כלל בגלל התייבשות. זכור לשים פיסת נייר לחלח בחדר ההדמיה לפני האיטום. עוד סיבה נפוצה של הצטננות היא כי דבק UV חוסם את נושפות. נסה להגביל את הדבק UV למקטעים האמצעיים של הזחל ולהימנע כיסוי הראש והזנב. התיבה הרחבה יותר מדי של PDMS באפשרותך גם לגרום בקלות את הדבק UV כדי לחסום את נושפות.
- קפלי על קיר הגוף להפריע הדמיה: כדי להימנע מיצירת קפלי במהלך ההרכבה, חשוב לשתק את הזחלים במהלך שלב ההרדמה. כאשר זחל משותק, קל יותר ליישר ולמתוח את הגוף. עבור בעלי חיים מבוגרים יותר 96 h, בעדינות גרירת זנבות לפני ריפוי הדבק UV יכול ביעילות להפחית את היווצרות הקפל. גרירת זנבות הזחלים הצעירים אינה מומלצת משום שקירות גופם שבירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לינופנג טאנג להקמת גרסה מוקדמת יותר של שיטת LarvaSPA; גלן סוואן באוניברסיטת קורנל אולין הול מכונת להכנת אבות טיפוס מוקדם של חדר ההדמיה; פיליפ איסרמן לבניית מסגרות מתכת ולמתן הצעות על הכנת cuboids PDMS; קורנל BRC הדמיה מתקן לגישה מיקרוסקופים (ממומן על ידי NIH גרנט S10OD018516); מריה סעיד על הקריאה. הקריטית של כתב היד עבודה זו נתמכת על ידי מלגת קורנל הוענק ל-H.J.; קרן הסטארט-up של קורנל ומענקי NIH (R01NS099125 ו-R21OD023824) הוענקו ל C.H. H.J. ו C.H. הגה את הפרויקט ועיצב את הניסויים. H.J. ערכו ניסויים. ה. ג. ו. C.H. כתב את כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
