Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتركيب يرقات Drosophila لتحقيق أطول من 10 ساعة من التصوير دون انقطاع الفاصل الزمني في الحيوانات الحية السليمة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير العديد من العمليات البيولوجية بالقرب من جدار الجسم اليرقات.
Abstract
التصوير الحي هو نهج قيم للتحقيق في أسئلة بيولوجيا الخلايا. يرقة Drosophila مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي في الجسم الحي لأن جدار الجسم اليرقات ومعظم الأعضاء الداخلية شفافة. ومع ذلك ، فإن التصوير الحي المستمر ليرقات Drosophila السليمة لمدة تزيد عن 30 دقيقة كان صعبًا لأنه من الصعب شل حركة اليرقات لفترة طويلة. هنا نقدم طريقة تصاعد اليرقات تسمى LarvaSPA التي تسمح بالتصوير المستمر ليرقات Drosophila الحية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية لمدة أطول من 10 ساعات. تتضمن هذه الطريقة إرفاق اليرقات جزئيًا بقسيمة الغطاء باستخدام الغراء التفاعلي للأشعة فوق البنفسجية بالإضافة إلى تقييد حركة اليرقات باستخدام كتلة البوليديميثيلسيلوكسان (PDMS). هذه الطريقة متوافقة مع اليرقات في مراحل النمو من instar الثاني إلى الهائم الثالث. نحن نشرح تطبيقات هذه الطريقة في دراسة العمليات الديناميكية للخلايا العصبية الحسية Drosophila ، بما في ذلك نمو النُدُر وانحطاط الديتريت الناجم عن الإصابة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لدراسة العديد من العمليات الخلوية الأخرى التي تحدث بالقرب من جدار الجسم اليرقات.
Introduction
التصوير الحي الفاصل الزمني هو طريقة قوية لدراسة العمليات الخلوية الديناميكية. المعلومات المكانية والزمنية التي توفرها الأفلام الفاصلة الزمنية يمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة للإجابة على أسئلة بيولوجيا الخلايا. وقد اليرقة Drosophila شعبية في نموذج الجسم الحي للتحقيقات باستخدام التصوير الحي لأن جدار الجسم شفافة يسمح للتصوير غير باضعة من الهياكل الداخلية1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر العديد من الأدوات الوراثية في Drosophila لتسمية الهياكل التشريحية والجزيئات الكبيرة 3. ومع ذلك ، فإن التصوير الطويل الأجل ليرقات Drosophila أمر صعب. على عكس الأجنة المبكرة الثابتة أو الخوخ ، تتحرك يرقات Drosophila باستمرار ، مما يستلزم تجميد التصوير الحي. وتشمل الطرق الفعالة لشل حركة يرقات دروسوفيلا الحية تصاعد في زيت الهالوكربون مع الكلوروفورم4، وتسليح باستخدام الإيسوروران أو محلول ديكلوروفوس5، والضغط بين قسيمة الغلاف وشريحة المجهر6. على الرغم من أن بعض هذه الأساليب قد استخدمت للفحص المجهري، لا شيء منها فعال للتصوير الحي على المدى الطويل. تم تطوير طرق أخرى لتصوير الخلايا العصبية جدار الجسم في اليرقات الزحف باستخدام المجهر التقليدية confocal أو المجهر ورقة الضوء7،8،9. ومع ذلك ، هذه الأساليب ليست مثالية لمراقبة الديناميات الخلوية بسبب حركة اليرقات.
وقد تم تطوير أساليب جديدة لتحقيق التصوير على المدى الطويل من اليرقات دروسوفيلا. باستخدام "رقاقة اليرقة" (PDMS) متعددة الكائنات الميثيل سيكلاكسان ، يمكن شل يرقات Drosophila بشكل فعال من خلال شفط يتم إنشاؤه فراغًا في غرفة صغيرة متخصصة دون تطفل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تقدم دقة زمنية عالية لدراسات بيولوجيا الخلايا ولها قيود صارمة على حجم الحيوان10. طريقة أخرى باستخدام جهاز للتطبيب حققت التصوير الحي ليرقات دروسوفيلا في نقاط زمنية متعددة وتم تطبيقها لدراسة التقاطعات العصبية العضلية11،12،13،14،15،16. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تسمح أيضًا بالتصوير المستمر لمدة أطول من 30 دقيقة وتتطلب استخدام desflurane مرارًا وتكرارًا ، مما يمكن أن يمنع النشاط العصبي ويؤثر على العملية البيولوجية المدروسة17،18. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طريقة جديدة تجمع بين جهاز microfluidic والتخدير بالتبريد لشل اليرقات من مختلف الأحجام لفترات قصيرة من الزمن (دقائق)19. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أجهزة متخصصة مثل نظام التبريد وفترات أطول من الشلل تتطلب تبريدًا متكررًا لليرقات.
نقدم هنا طريقة متعددة الاستخدامات لشل يرقات Drosophila متوافقة مع التصوير دون انقطاع الفاصل الزمني لمدة أطول من 10 ساعة. هذه الطريقة، التي نسميها "استقرار اليرقات عن طريق التعلق الجزئي" (LarvaSPA)، تنطوي على التمسك بشرة اليرقة إلى قسيمة تغطية للتصوير في غرفة التصوير المصممة خصيصا. يصف هذا البروتوكول كيفية جعل غرفة التصوير وكيفية تركيب اليرقات في مجموعة متنوعة من مراحل النمو. في طريقة LarvaSPA ، يتم لصق شرائح الجسم المطلوبة على قسيمة الغلاف باستخدام الغراء التفاعلي للأشعة فوق البنفسجية. ويضغط ضغط PDMS بالإضافة إلى ذلك على اليرقات ، مما يمنع الهروب. الهواء والرطوبة في غرفة التصوير ضمان بقاء اليرقات الجمود جزئيا أثناء التصوير. وتشمل مزايا LarvaSPA على التقنيات الأخرى ما يلي: (1) وهي الطريقة الأولى التي تسمح بالتصوير الحي المستمر ليرقات دروسوفيلا السليمة لساعات ذات دقة زمنية ومكانية عالية؛ (2) وهي الطريقة الأولى التي تسمح بالتصوير الحي المستمر ليرقات دروسوفيلا السليمة لساعات ذات دقة زمنية ومكانية عالية. (2) الأسلوب لديه قيود أقل على حجم اليرقات؛ (3) يمكن تصنيع غرفة التصوير وتكعيبية PDMS بأقل تكلفة ممكنة وقابلة لإعادة استخدامها.
بالإضافة إلى وصف طريقة تصاعد اليرقات ، نقدم العديد من الأمثلة على تطبيقه لدراسة تطوير الديندريت وانحطاط Drosophila التشجين (da) الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جعل غرفة التصوير
- يمكن بناء الإطار المعدني من كتلة من الألومنيوم في متجر آلة نموذجية. ويتضح مواصفات الإطار في الشكل 1A.
- لبناء غرفة التصوير، ختم الجزء السفلي من الإطار المعدني باستخدام قسيمة تغطية طويلة (22 ملم × 50 ملم) والغراء الأشعة فوق البنفسجية(الشكل 1A). علاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد.
2. صنع التكعيبية PDMS
- إعداد القالب لcuboids PDMS.
- إرفاق طبقات من شريط التعبئة والتغليف إلى السطح الداخلي لمستطيلة (80 ملم × 55 ملم) طبق بيتري أو لوحة ثقافة الخلية المستديرة. استخدم طبقة واحدة (0.063 مم سميكة) ليرقات instar الثانية ، طبقتين (0.126 مم) ليرقات instar الثالثة المبكرة ، أو ثلاث طبقات (0.189 مم سميكة) ليرقات instar الثالثة المتأخرة(الشكل 1B).
- قطع الشريط إلى شرائح من عرض محدد مع شفرة حلاقة: 1.5 مم للشريط من طبقة واحدة، و 2 مم للشريط من طبقتين أو 3 طبقات. سيحدد عرض الشريط وسماكته حجم اليرقات التي يمكن أن يحملها التكعيب ية PDMS النهائية. اترك مسافة 5 مم على الأقل بين الشريطين. إزالة طبقات الشريط التي تغطي الفضاء(الشكل 1B).
- إزالة الغبار من السطح الداخلي لللوحة باستخدام الشريط لزجة. القالب جاهز للاستخدام.
- إعداد مزيج PDMS.
- مزيج 7 غرام من قاعدة PDMS و 0.7 غرام من عامل المعالجة (10:1 نسبة) بدقة في حاوية صغيرة.
- ضع الحاوية في جفاف فراغ لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة الهواء من الخليط.
- صب ببطء حوالي 5.5 غرام من خليط PDMS على القالب للوصول إلى سمك 1-2 مم(الشكل 1B).
- ضع خليط PDMS في المجفف فراغ مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة فقاعات الهواء المتبقية من الخليط. كسر الفقاعات القليلة الماضية مع تلميح ماصة.
- علاج PDMS على سطح مستو في حاضنة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- استخدام شفرة حلاقة لتخفيف PDMS الشفاء على طول حافة القالب وفصله من القالب. تخزين PDMS بين قطعتين من الشريط لزجة كبيرة في درجة حرارة الغرفة.
- لأوائل وأواخر الثالث instar اليرقات ، وقطع PDMS إلى 8 ملم × 2 ملم × 1 ملم cuboids (على طول خطوط منقط في الشكل 1باء)عن طريق وضع الأخدود التي تم إنشاؤها بواسطة شريط الشريط (الخطوة 2.1.2) في وسط الجانب الطويل من cuboid(الشكل 1B ،C). بالنسبة ليرقات instar الثانية ، قطع التكعيبية إلى 8 ملم × 1 ملم × 1 ملم.
3. تصاعد اليرقات للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني
- إعداد الغطاء العلوي للتركيب.
- اختر ستة مكعبات PDMS مع الأخاأخ مطابقة لأحجام اليرقات. اتبع الأخدود الموصى به وحجم PDMS على أساس الخطوات 2.1.1 و 2.1.2 و 2.2.7.
- إزالة الغبار من سطح PDMS مع الشريط لزجة.
- إرفاق أربع قطع من الشريط على الوجهين (12 ملم × 5 ملم) على قسيمة تغطية طويلة (22 ملم × 50 ملم) لتحديد cuboids PDMS في وقت لاحق. يجب أن تكون المسافات بين قطعتين من الشريط على الوجهين هي نفس عرض أخدود PDMS.
- تطبيق قطرة صغيرة (~ 1.2 ميكرولتر) من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الأخدود من كل تكعيبية PDMS وإضافة ست قطرات صغيرة من الغراء الأشعة فوق البنفسجية في الفضاء بين الشريط على الوجهين على قسيمة الغلاف.
- إعداد اليرقات للتصاعد.
- باستخدام زوج من ملقط، وتنظيف اليرقات في الماء لإزالة الطعام من سطح الجسم.
- ضع يرقات نظيفة على قطعة صغيرة من ورق الأنسجة المبللة في طبق بيتري صغير (35 مم) بدون غطاء. ضع طبق بيتري الصغير في طبق بيتري كبير (60 مم) يحتوي على قطعة من ورق الأنسجة الجافة. في غطاء محرك السيارة الكيميائي، ضع 8-12 قطرات (160-240 ميكرولتر) من الإيزوفلوران على ورق الأنسجة الجافة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية وأغلق غطاء طبق بيتري الكبير.
- انتظر 2-3 دقيقة أثناء مراقبة اليرقات. أخرج اليرقات من طبق بيتري الكبير بمجرد أن تتوقف خطاطيف الفم عن الحركة.
- جبل الحيوانات.
- لصور الهياكل على الجانب الظهري من الحيوان، ضع اليرقات المشلولة على الغراء الأشعة فوق البنفسجية بين الشريط على الوجهين على قسيمة الغلاف مع بشرة الظهر ية التي تواجه قسيمة الغطاء.
- تغطية كل يرقة مع كتلة PDMS وتناسب جذع اليرقة في الأخدود من PDMS. اترك الرأس وذيل اليرقة خارج أخدود PDMS. تجنب حجب spiracles من اليرقة عن طريق الغراء.
- اضغط لأسفل على نهايات كتلة PDMS على الشريط على الوجهين دون تطبيق القوة على الأخدود. سحب بلطف على ذيل اليرقة لتسطيح بشرة تحت PDMS.
- علاج الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 دقيقة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية باليد في الإعداد عالية (في حوالي 0.07 mW/mm2).
تنبيه: حماية العينين بنظارات السلامة أثناء استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. - اقلب قسيمة الغطاء رأسًا على عقب وكرر الخطوة 3.3.4.
- بلل قطعة صغيرة من ورق العدسة (15 ملم × 30 ملم) مع 20 ميكرولتر-30 ميكرولتر من الماء. ضع ورق العدسة المبلل في الجزء السفلي من غرفة التصوير(الشكل 1A, D).
- ضع قسيمة الغطاء على الغرفة بحيث تواجه اليرقات داخل الغرفة. الانضمام إلى طرفي الغطاء إلى السطح المعدني باستخدام الغراء الأشعة فوق البنفسجية(الشكل 1A، D). الجانب الهرّوي من اليرقات جاهز للتصوير تحت المجهر البؤري(الشكل 1E).
4. التصوير
- يرقات الصور مع المجهر المناسب. تم الحصول على جميع النتائج المعروضة في هذا البروتوكول(الشكل 2، الشكل 3، فيديو S2، فيديو S3، والفيديو S4)باستخدام نظام محوري مع هدف زيت40x (1.30 NA).
5. استعادة غرفة التصوير وأجهزة إدارة الملفات الرقمية
- بعد التصوير، قم بإزالة الزيت على قسيمة الغطاء العلوي باستخدام ورق العدسة. افصل الانزلاق العلوي من الإطار المعدني عن طريق القطع في المسافة بين قسيمة الغطاء والإطار المعدني باستخدام شفرة حلاقة. غرفة التصوير جاهزة لإعادة الاستخدام.
- فصل cuboids PDMS من القسيمة العلوية مع ملقط. لفة التكعيبية PDMS على الشريط لزجة لإزالة بقايا الغراء والغبار. التكعيبية PDMS جاهزة لإعادة الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم إنشاء غرفة تصوير اليرقة عن طريق لصق إطار معدني مصنوع خصيصًا واثنين من التغطيات معًا. يتم تحديد تصميم الإطار المعدني في الشكل 1A. يتم الالتزام يرقات Drosophila داخل الغرفة إلى القسيمة العلوية بمساعدة الغراء الأشعة فوق البنفسجية ومكعبات PDMS. الأخدود على التكعيبية PDMS والشريط على الوجهين يتم إرفاق التكعيبية لخلق مساحة لعقد اليرقات(الشكل 1B ، C). وPDMS ينطبق أيضا ضغط لطيف لتسطيح جدار الجسم اليرقات وتقييد حركة اليرقات جسديا. وأخيرا، يتم وضع قطعة صغيرة من ورق العدسة الرطب في الجزء السفلي من الغرفة لتوفير الرطوبة. يمكن لهذا الإعداد شل يرقات Drosophila لفترة أطول من 10 ساعة للتصوير المستمر. معظم الحيوانات على قيد الحياة بعد 10 ساعة ويمكن استردادها لتنمو في مرحلة pupal. يمكن لغرفة التصوير استيعاب ما يصل إلى تسع يرقات في وقت واحد. يُظهر الشكل 1D ستة يرقات في أواخر الثالثة من النجوم مثبتة في الغرفة. يتم إصلاح جذوع اليرقات في حين أن رؤوسهم وذيولهم حرة في التحرك(الشكل 1E وVideo S1). وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لتصوير instar الثاني لتجول يرقات instar الثالثة مع التصوير المستمر عالي الدقة لمدة تصل إلى 15 ساعة. تم تصميم الغرفة للتصوير باستخدام المجاهر تستقيم، ولكن الإعداد يعمل أيضا للمجاهر المقلوب ببساطة عن طريق التقليب الغرفة.
هنا نشرح تطبيق LarvaSPA في دراسة ديناميات التشعبات العصبية والانحطاط dendrite باستخدام الفئة الرابعة دا (C4 دا) الخلايا العصبية كنموذج(الشكل 2، الشكل 3، فيديو S2 -S4). C4 الخلايا العصبية دا هي nociceptors somatosensory تقع على جدار الجسم اليرقات، الذي التشعبات إيرفات البشرة اليرقات1،20،21،22. C4 da dendrites يحمل سلوكيات النمو ديناميكية للغاية في جميع أنحاء التنمية اليرقات، مما أدى إلى تغطية كاملة لسطح الجسم أو الفضاء ملء23. كما تم استخدام الخلايا العصبية C4 دا بنجاح لدراسة انحطاط التنكس والتجدد بعد الإصابة الجسدية24،25،26،27.
لديناميات dendrite التصوير ، واليرقات التي تتراوح بين 48 ساعة بعد وضع البيض (AEL) في instar الثانية إلى 120 h AEL في تجول instar الثالثة التي شنت في غرفة التصوير للتصوير الفاصل الزمني باستخدام نقطة المسح الضوئي المجهر البؤري. تم التقاط أفلام الفاصل الزمني مع فاصل زمني 3 دقيقة لالتقاط سلوكيات النمو من C4 da dendrites المسمى ppk-CD4-tdTom أو UAS-CD4-tdTom مدفوعة ppk-Gal46. طوال فترة التصوير (تصل إلى 12 ح), الفروع dendrite عالية من الخلايا العصبية C4 دا أظهرت سلوكيات النمو المعقدة, بما في ذلك التمديد, تراجع, تشكيل فرع, والقضاء على فرع(الشكل 2A-2F),مما يدل على صحة الخلايا العصبية. أفلامنا أيضا القبض على التنافر dendro-dendrite المتماثلة التي تراجع نصائح dendrite بعد الاتصال dendrites أخرى(الشكل 2F). بشكل عام، تثبت هذه النتائج أن التصوير بالفاصل الزمني باستخدام LarvaSPA فعال لدراسة التطور العصبي.
إلى التنكس dendrite الصورة، استخدمنا ليزر MaiTai لفصل التشعبات الأولية بالقرب من C4 دا الهيئات الخلية العصبية. تم استرداد اليرقات وتركيبها في الغرفة للتصوير بدءًا من 1.5 ساعة بعد الإصابة (الذكاء الاصطناعي)(الشكل 3، فيديو S4). وسجلت الأفلام الأحداث الرئيسية خلال انحطاط dendrite، بما في ذلك تورم dendrite، وتجزئة dendrite، وإزالة الحطام dendrite. في نفس التجربة ، تم تصميم جسم الدهون اليرقات أيضًا لإفراز Annexin V-GFP (AV-GFP) ، وهو مستشعر يلصق فوسفاتيديل سيرين خارجي (PS) على سطح الخلية27. لاحظنا وضع علامات محددة من التشعبات المنقلبة بواسطة AV-GFP(الشكل 3)، مما يشير إلى أن PS تعرض على سطح التشعبات المنقلبة لتكون بمثابة إشارة أكل لي لإزالة البلعوم اللاحقة عن طريق البلعوم27.
الشكل 1: غرفة التصوير لتركيب LarvaSPA. (أ)مخططات لغرفة التصوير بمواصفات تفصيلية، تظهر كلا ً من المنظر العلوي والمنظر الجانبي. يشير الظل الأزرق الفاتح في المنظر العلوي إلى ورق العدسة المبلل. الغرفة مختومة بواسطة قسيمة تغطية علوية وقسيمة تغطية أسفل. ويتضح موقف يرقة محمولة. (ب)مخططات قالب PDMS (المنظر العلوي) والقالب بعد ملء مع خليط PDMS (عرض الجانب). تشير الشرائط باللون الرمادي إلى شريطين من طبقة واحدة وطبقتين من طبقتين وشريطين من 3 طبقات على التوالي. يشير اللمعالأصفر في العرض الجانبي إلى خليط PDMS في القالب. تشير الخطوط المنقط إلى مكان قطع PDMS الشفاء. لا يتم رسم طريقة العرض الجانبية للمخطط على المقياس. (C)صور فوتوغرافية تعرض منظرًا علويًا ومنظرًا جانبيًا لـ PDMS cuboid. مقياس شريط = 1 مم (د) صور فوتوغرافية تظهر غرفة التصوير قبل تصاعد ، وغرفة التصوير مع ستة شلت أواخر الثالث instar Drosophila اليرقات شنت الجانب الظهري. مقياس شريط = 10 ملم (E) عرض أقرب من يرقة في(D). مقياس شريط = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير الفواصل الزمنية لديناميكيات الدينهاريات. (أ-واو) إطارات مختارة من الأفلام الفاصلة الزمنية من الدرجة الرابعة da الخلايا العصبية dendrites في نقاط زمنية محددة بعد بدء التصوير. تم التقاط صور لليرقات 48 ساعة AEL(A و F)و 72 h AEL(B)و 96 h AEL(C)و 120 h AEL(D). وتسمى الخلايا العصبية من قبل ppk > CD4-tdTom (A, D, E,و F)أو ppk > CD4-tdTom (B و C). تشير الأسهم الزرقاء إلى تراجعات dendrite مقارنة بنقطة الوقت السابقة. تشير الأسهم الصفراء إلى ملحقات dendrite مقارنة بنقطة الوقت السابقة. (هـ)مورفولوجيا الديندرت في نهاية 12 ساعة من التصوير. (F)إطارات متتالية مع فترات 3 دقيقة في فيلم يوضح كيف فرع dendrite في يرقة instar الثانية الموسعة (الأسهم الصفراء) وتراجع في وقت لاحق (الأسهم الزرقاء) بعد أن أجرى اتصال مع آخر dendrite. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصوير الفاصل الزمني للانحطاط dendrite والتعرض لإشارة أكل لي. إطارات مختارة من فيلم الفاصل الزمني من التشعبات المنحطة من فئة الرابع دا العصبية بعد إصابة الليزر. وقد وصفت Dendrites من قبل ppk > CD4-tdTom. تم الكشف عن إشارة أكل لي PS على التشعبات المندّمة من قبل Annexin-GFP (AV-GFP) ، والتي يفرزها الجسم الدهني. تشير الأسهم الصفراء إلى الفروع التي تعرض وضع علامة AV-GFP. الأسهم الزرقاء تشير إلى التشعبات التي تمر التجزئة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو S1: يتم شل يرقة instar الثالثة في درجة من التكعيبية PDMS. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو S2: Dendrites تمتد وتراجع بشكل حيوي في يرقة instar الثانية. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو S3: Dendrites تمتد وتراجع بشكل حيوي في يرقة instar الثالثة تجول. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
فيديو S4: Dendrites تتدهور وفضح فوسفاتيديل سيرين بعد إصابة الليزر في يرقة instar الثالثة. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نصف LarvaSPA ، وهي طريقة متعددة الاستخدامات لتركيب يرقات Drosophila الحية للتصوير على المدى الطويل. لا تتطلب هذه الطريقة استعادة اليرقات أو إعادة تركيبها ، مما يتيح التصوير دون انقطاع. ولذلك فهو مثالي لتتبع العمليات البيولوجية التي تستغرق ساعات لإكمالها، مثل انحطاط التنكس والتجدد. ويمكن استخدام هذه الطريقة أيضا لتصوير ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا والأحداث دون الخلوية مثل نمو microtubule. وبما أن جدار الجسم اليرقات مستقر أثناء التصوير، يمكن تعديل الدقة المكانية والزمنية لتناسب تطبيق التصوير في متناول اليد (على سبيل المثال، لتتبع حركة الحويصلات دون الخلوية السريعة أو لرصد التغيرات العالمية البطيئة لأنماط فروع الخلايا العصبية). بالإضافة إلى ذلك ، تتوافق هذه الطريقة مع اليرقات في مراحل النمو المختلفة ولا تتطلب معدات خاصة. وهكذا، يمكن استخدام LarvaSPA من قبل العديد من مختبرات Drosophila لمعالجة الأسئلة المتنوعة.
العوامل التي تؤثر على نجاح الطريقة ، بما في ذلك طبيعة التكعيبية PDMS ومرحلة النمو لليرقات
حجم التكعيبية PDMS وعمق الأخدود تحتاج إلى مطابقة حجم اليرقات. يمكن أن تغطي التكعيبية PDMS واسعة جدًا لليرقات الرأس والذيل وتسبب نقص الأكسجة. ومع ذلك ، قد لا يكون التكعيبي الضيق PDMS فعالًا في منع اليرقات من الحركة. كما أن الأخدود العميق جدًا لن يولد ضغطًا كافيًا لكبح حركة اليرقات. لن يحمل الأخدود الضحل جدًا ما يكفي من الغراء للصق اليرقات في قسيمة الغلاف. وبناء على تجربتنا، يوصى بالأبعاد التالية لـ PDMS والأخدود لمختلف مراحل اليرقات: 8 مم × 1 مم × 1 مم PDMS cuboids مع 1.5 مم × 1 مم × 0.063 مم لليرقات الإنستارية الثانية (~ 48 h AEL)؛ 8 مم × 2 مم × 1 مم PDMS cuboids مع 2 مم × 2 مم × 0.126 مم أخاخ ليرقات instar الثالثة المبكرة (~ 72 ساعة AEL)؛ 8 مم × 2 مم × 1 مم PDMS cuboids مع 2 مم × 2 مم × 0.189 مم أخاخ ليرقات instar الثالثة المتأخرة (~ 96 ساعة AEL أو أكبر).
تجول اليرقات instar الثالث (في أو أكثر من 120 ساعة AEL) تتحرك أقل بالمقارنة مع الأصغر سنا وتتطلب أقل رطوبة للبقاء على قيد الحياة مرة واحدة شنت في الغرفة. لديهم أيضا بشرة أكثر سمكا ويمكن أن تحمل المزيد من الإجهاد البدني. لذلك ، فإن التجارب التي تستخدم يرقات نجمة النجوم الثالثة الهائمة لديها أعلى معدل نجاح. في أيدينا ، نجا أكثر من 80٪ من يرقات instar الثالثة الهائمة وبقيت غير متحركة بعد 12 ساعة بعد تصاعدها. لمنع اليرقات من الجراء أثناء التصوير ، نوصي بتركيب اليرقات بين 96 ساعة إلى 120 ساعة AEL. أصغر اليرقات instar الثالث لديها فرصة أكبر للهروب أو الموت أثناء التصوير. عادة ، على الأقل 2 من أصل 6 يرقات instar الثالثة الشباب التي شنت في نفس الغرفة البقاء على قيد الحياة وتبقى غير متحركة 10 ساعة بعد تصاعد. تجربتنا مع اليرقات instar الثانية محدودة ومعدل البقاء على قيد الحياة من الصعب تقدير. ومع ذلك ، فقد نجحنا في صورة يرقات نجمة ثانية لمدة 7 ساعة باستخدام هذه الطريقة.
المخاوف المحتملة من التصوير على المدى الطويل
على الرغم من أن LarvaSPA كانت مفيدة جدا لديناميات نمو dendrite التصوير والانحطاط ، وهناك عدد قليل من المحاذير المحتملة للنظر. أولاً ، في طريقتنا الحالية ، يتم حرمان اليرقات من الطعام طوال مدة التصوير ، مما قد يؤدي إلى استجابات ناجمة عن المجاعة في العديد من الأنسجة. لقد لاحظنا تشكيل الهياكل الحبيبية في الخلايا البشرة حوالي 10 ساعة بعد تصاعد، والتي قد تنتج عن autophagy. لذلك ، يجب أن تكون النتائج التي تم الحصول عليها في الساعات القليلة الأولى من التصوير أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية. وتتطلب النتائج على مدى فترات زمنية أطول تفسيرا أكثر حذرا. لتقليل هذا القلق، يمكن تكييف الإجراء لدينا للسماح بالتغذية باليرقات. ثانياً، قد تتداخل طريقتنا مع النمو السريع لليرقات الأصغر سناً بسبب القيود المادية ونقص تناول المغذيات. ومع ذلك، قد لا ينطبق هذا القلق على الحيوانات الأكبر سنا. على سبيل المثال ، يمكن أن تتحول يرقات instar الثالثة الهائمة إلى خوخ حتى بعد 12 ساعة من التصوير المستمر ، مما يجعل هذه الطريقة مثالية للتحقيقات في التحول المبكر. ثالثاً، يمثل تصوير الهياكل الأعمق مثل الجسم الدهني والأمعاء بعض التحديات. والسبب الرئيسي هو أن الأنسجة الأعمق تتحرك في كثير من الأحيان أثناء التصوير وبالتالي تتطلب تصحيح الحركة في المعالجة المابعد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب عدم تطابق المؤشرات الانكسارية في مسار الضوء انحراف كروي عند تصوير الأنسجة الأعمق. في حين أن أهداف النفط مناسبة لتصوير الخلايا العصبية دا لأن التشعبات هي في غضون 15 ميكرون من سطح الجسم، وأهداف غمر المياه يمكن أن تكون خيارات أفضل لتصحيح عدم التطابق الانكسار مؤشر للتصوير أعمق داخل اليرقات. رابعا, لأن C4 دا الخلايا العصبية يمكن تفعيلها عن طريق الأشعة فوق البنفسجية28, باستخدام الأشعة فوق البنفسجية خلال تصاعد اليرقات يمكن أن يغير من المحتمل C4 دا علم وظائف الأعضاء العصبية. على الرغم من أن شدة الضوء نوصي هو أقل بكثير من المستويات التي تنشط بقوة الخلايا العصبية C4da28,النتائج المتعلقة نشاط الخلايا العصبية C4da تحتاج إلى أن تفسر بحذر. وقد استخدم الغراء الأشعة فوق البنفسجية لتصوير مجموعة واسعة من العينات البيولوجية29،30،31 ولا يسبب سمية واضحة لليرقات في أيدينا. وأخيرا ، ينبغي للمرء أن تنظر في الإعداد المجهر المناسب للتصوير الحي في الجسم الحي. على سبيل المثال، الماسحات الضوئية بالرنين ومجاهر القرص الدوار هي خيارات أفضل للتصوير الحي على المدى الطويل لأنها تسبب سمية ضوئية أقل وتبييض ضوئي. المجهر متعدد الفوتون هو أكثر فعالية لتصوير الهياكل الداخلية الأعمق في اليرقات. يمكن أن يكون التصوير على المدى الطويل عرضة للانجراف بالعينة أو التركيز ، والذي يمكن تصحيحه عن طريق معالجة ما بعد التصوير.
الأسباب الأكثر شيوعا لفشل LarvaSPA والحلول الموصى بها لمعالجتها
- تتحرك اليرقات كثيرًا أو تهرب: هناك سببان شائعان يمكن أن يساهما في هذه المشكلة. الأول هو أن أخدود PDMS قد يكون ضحلًا جدًا أو عميقًا جدًا بالنسبة لليرقات. محاولة آخر دي في إم إس cuboid مع عمق أخدود مختلفة قد حل المشكلة. والسبب الثاني هو أن هناك الكثير من الرطوبة في الغرفة، مما يضعف الغراء الأشعة فوق البنفسجية. قد يساعد تقليل حجم الماء المضاف إلى ورق العدسة في الغرفة على شل حركة اليرقات. بالإضافة إلى ذلك ، حاول أن تعرض فقط الأجزاء التي تغطيها التكعيبية PDMS ، لأن الرأس والذيل حران في التحرك.
- تموت اليرقات أثناء التصوير: إذا ماتت يرقة بعد التصوير مباشرة ، فمن المحتمل أنها تعرضت لتخدير أكثر من اللازم. يجب أن تستيقظ اليرقات الملقحة بشكل صحيح بعد التركيب وتظهر حركات بما في ذلك تمديد خطاف الفم والتراجع وانكماش الأوعية الظهرية. لحل هذه المشكلة ، يمكن استخدام أقل من الإيسولوران لحسيال اليرقات. نقل يرقة من طبق بتري التخدير مباشرة بعد توقف خطاف الفم عن الحركة. إذا ماتت اليرقة بعد حوالي ساعة من التصوير، فعادة ً ما يكون ذلك بسبب الجفاف. تذكر وضع قطعة من ورق العدسة المبللة في غرفة التصوير قبل الختم. سبب شائع آخر للفتك هو أن الغراء الأشعة فوق البنفسجية كتل spiracles. في محاولة للحد من الغراء الأشعة فوق البنفسجية إلى الأجزاء الوسطى من اليرقة وتجنب تغطية الرأس والذيل. يمكن أيضا أن يسبب التكعيبي PDMS واسعة النطاق بسهولة الغراء الأشعة فوق البنفسجية لمنع spiracles.
- الطيات على جدار الجسم تتداخل مع التصوير: لتجنب توليد طيات أثناء التركيب ، من المهم شل اليرقات بالكامل أثناء خطوة التخدير. عندما تكون اليرقة مشلولة ، يكون من الأسهل استقامة الجسم وتمدده. بالنسبة للحيوانات التي يزيد عمرها عن 96 ساعة AEL ، فإن سحب ذيول المخلفات برفق قبل علاج الغراء فوق البنفسجي يمكن أن يقلل بشكل فعال من تشكيل الطي. لا ينصح بسحب ذيول اليرقات الصغيرة لأن جدران أجسامها هشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر لينغفنغ تانغ لإنشاء نسخة سابقة من طريقة LarvaSPA; جلين سوان في كورنيل أولين قاعة آلة متجر لصنع النماذج الأولية في وقت سابق من غرفة التصوير؛ فيليب Isermann لبناء إطارات معدنية وتقديم اقتراحات بشأن صنع التكعيبية PDMS؛ كورنيل BRC مرفق التصوير للوصول إلى المجاهر (بتمويل من منحة المعاهد القومية للصحة S10OD018516)؛ ماريا سبار للقراءة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل زمالة كورنيل التي منحت لـ H.J. صندوق كورنيل لبدء ومنح المعاهد القومية للصحة (R01NS099125 و R21OD023824) التي منحت إلى C.H. H.J. وC.H. تصور المشروع وصمم التجارب. أجرى (إتش جي) التجارب. كتب (إتش جي) و(سي إتش) المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
