LarvaSPA، طريقة لتركيب Drosophila Larva للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتركيب يرقات Drosophila لتحقيق أطول من 10 ساعة من التصوير دون انقطاع الفاصل الزمني في الحيوانات الحية السليمة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير العديد من العمليات البيولوجية بالقرب من جدار الجسم اليرقات.
Abstract
التصوير الحي هو نهج قيم للتحقيق في أسئلة بيولوجيا الخلايا. يرقة Drosophila مناسبة بشكل خاص للتصوير الحي في الجسم الحي لأن جدار الجسم اليرقات ومعظم الأعضاء الداخلية شفافة. ومع ذلك ، فإن التصوير الحي المستمر ليرقات Drosophila السليمة لمدة تزيد عن 30 دقيقة كان صعبًا لأنه من الصعب شل حركة اليرقات لفترة طويلة. هنا نقدم طريقة تصاعد اليرقات تسمى LarvaSPA التي تسمح بالتصوير المستمر ليرقات Drosophila الحية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية لمدة أطول من 10 ساعات. تتضمن هذه الطريقة إرفاق اليرقات جزئيًا بقسيمة الغطاء باستخدام الغراء التفاعلي للأشعة فوق البنفسجية بالإضافة إلى تقييد حركة اليرقات باستخدام كتلة البوليديميثيلسيلوكسان (PDMS). هذه الطريقة متوافقة مع اليرقات في مراحل النمو من instar الثاني إلى الهائم الثالث. نحن نشرح تطبيقات هذه الطريقة في دراسة العمليات الديناميكية للخلايا العصبية الحسية Drosophila ، بما في ذلك نمو النُدُر وانحطاط الديتريت الناجم عن الإصابة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لدراسة العديد من العمليات الخلوية الأخرى التي تحدث بالقرب من جدار الجسم اليرقات.
Introduction
التصوير الحي الفاصل الزمني هو طريقة قوية لدراسة العمليات الخلوية الديناميكية. المعلومات المكانية والزمنية التي توفرها الأفلام الفاصلة الزمنية يمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة للإجابة على أسئلة بيولوجيا الخلايا. وقد اليرقة Drosophila شعبية في نموذج الجسم الحي للتحقيقات باستخدام التصوير الحي لأن جدار الجسم شفافة يسمح للتصوير غير باضعة من الهياكل الداخلية1،2. وبالإضافة إلى ذلك، تتوفر العديد من الأدوات الوراثية في Drosophila لتسمية الهياكل التشريحية والجزيئات الكبيرة 3. ومع ذلك ، فإن التصوير الطويل الأجل ليرقات Drosophila أمر صعب. على عكس الأجنة المبكرة الثابتة أو الخوخ ، تتحرك يرقات Drosophila باستمرار ، مما يستلزم تجميد التصوير الحي. وتشمل الطرق الفعالة لشل حركة يرقات دروسوفيلا الحية تصاعد في زيت الهالوكربون مع الكلوروفورم4، وتسليح باستخدام الإيسوروران أو محلول ديكلوروفوس5، والضغط بين قسيمة الغلاف وشريحة المجهر6. على الرغم من أن بعض هذه الأساليب قد استخدمت للفحص المجهري، لا شيء منها فعال للتصوير الحي على المدى الطويل. تم تطوير طرق أخرى لتصوير الخلايا العصبية جدار الجسم في اليرقات الزحف باستخدام المجهر التقليدية confocal أو المجهر ورقة الضوء7،8،9. ومع ذلك ، هذه الأساليب ليست مثالية لمراقبة الديناميات الخلوية بسبب حركة اليرقات.
وقد تم تطوير أساليب جديدة لتحقيق التصوير على المدى الطويل من اليرقات دروسوفيلا. باستخدام “رقاقة اليرقة” (PDMS) متعددة الكائنات الميثيل سيكلاكسان ، يمكن شل يرقات Drosophila بشكل فعال من خلال شفط يتم إنشاؤه فراغًا في غرفة صغيرة متخصصة دون تطفل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تقدم دقة زمنية عالية لدراسات بيولوجيا الخلايا ولها قيود صارمة على حجم الحيوان10. طريقة أخرى باستخدام جهاز للتطبيب حققت التصوير الحي ليرقات دروسوفيلا في نقاط زمنية متعددة وتم تطبيقها لدراسة التقاطعات العصبية العضلية11،12،13،14،15،16. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تسمح أيضًا بالتصوير المستمر لمدة أطول من 30 دقيقة وتتطلب استخدام desflurane مرارًا وتكرارًا ، مما يمكن أن يمنع النشاط العصبي ويؤثر على العملية البيولوجية المدروسة17،18. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طريقة جديدة تجمع بين جهاز microfluidic والتخدير بالتبريد لشل اليرقات من مختلف الأحجام لفترات قصيرة من الزمن (دقائق)19. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أجهزة متخصصة مثل نظام التبريد وفترات أطول من الشلل تتطلب تبريدًا متكررًا لليرقات.
نقدم هنا طريقة متعددة الاستخدامات لشل يرقات Drosophila متوافقة مع التصوير دون انقطاع الفاصل الزمني لمدة أطول من 10 ساعة. هذه الطريقة، التي نسميها “استقرار اليرقات عن طريق التعلق الجزئي” (LarvaSPA)، تنطوي على التمسك بشرة اليرقة إلى قسيمة تغطية للتصوير في غرفة التصوير المصممة خصيصا. يصف هذا البروتوكول كيفية جعل غرفة التصوير وكيفية تركيب اليرقات في مجموعة متنوعة من مراحل النمو. في طريقة LarvaSPA ، يتم لصق شرائح الجسم المطلوبة على قسيمة الغلاف باستخدام الغراء التفاعلي للأشعة فوق البنفسجية. ويضغط ضغط PDMS بالإضافة إلى ذلك على اليرقات ، مما يمنع الهروب. الهواء والرطوبة في غرفة التصوير ضمان بقاء اليرقات الجمود جزئيا أثناء التصوير. وتشمل مزايا LarvaSPA على التقنيات الأخرى ما يلي: (1) وهي الطريقة الأولى التي تسمح بالتصوير الحي المستمر ليرقات دروسوفيلا السليمة لساعات ذات دقة زمنية ومكانية عالية؛ (2) وهي الطريقة الأولى التي تسمح بالتصوير الحي المستمر ليرقات دروسوفيلا السليمة لساعات ذات دقة زمنية ومكانية عالية. (2) الأسلوب لديه قيود أقل على حجم اليرقات؛ (3) يمكن تصنيع غرفة التصوير وتكعيبية PDMS بأقل تكلفة ممكنة وقابلة لإعادة استخدامها.
بالإضافة إلى وصف طريقة تصاعد اليرقات ، نقدم العديد من الأمثلة على تطبيقه لدراسة تطوير الديندريت وانحطاط Drosophila التشجين (da) الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نصف LarvaSPA ، وهي طريقة متعددة الاستخدامات لتركيب يرقات Drosophila الحية للتصوير على المدى الطويل. لا تتطلب هذه الطريقة استعادة اليرقات أو إعادة تركيبها ، مما يتيح التصوير دون انقطاع. ولذلك فهو مثالي لتتبع العمليات البيولوجية التي تستغرق ساعات لإكمالها، مثل انحطاط التنكس والتجدد. ويمكن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لينغفنغ تانغ لإنشاء نسخة سابقة من طريقة LarvaSPA; جلين سوان في كورنيل أولين قاعة آلة متجر لصنع النماذج الأولية في وقت سابق من غرفة التصوير؛ فيليب Isermann لبناء إطارات معدنية وتقديم اقتراحات بشأن صنع التكعيبية PDMS؛ كورنيل BRC مرفق التصوير للوصول إلى المجاهر (بتمويل من منحة المعاهد القومية للصحة S10OD018516)؛ ماريا سبار للقراءة النقدية للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل زمالة كورنيل التي منحت لـ H.J. صندوق كورنيل لبدء ومنح المعاهد القومية للصحة (R01NS099125 و R21OD023824) التي منحت إلى C.H. H.J. وC.H. تصور المشروع وصمم التجارب. أجرى (إتش جي) التجارب. كتب (إتش جي) و(سي إتش) المخطوطة.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
