Summary
이 프로토콜은 그대로 살아있는 동물에서 중단없는 시간 경과 이미징의 10 시간 이상을 달성하기 위해 Drosophila 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 애벌레 몸벽에 가까운 많은 생물학적 과정을 이미지화하는데 사용될 수 있다.
Abstract
살아있는 화상 진찰은 세포 생물학 질문을 조사하기 를 위한 귀중한 접근입니다. Drosophila 애벌레는 애벌레 바디 벽 및 대부분의 내부 기관이 투명하기 때문에 생체 내 살아있는 화상 진찰을 위해 특히 적당합니다. 그러나, 30분 이상 온전한 초파리 유충의 지속적인 실시간 영상촬영은 오랜 시간 동안 비침습적으로 고정화하기 어렵기 때문에 도전적이다. 여기에서 우리는 10 시간 이상 높은 시간 및 공간 해결책을 가진 살아있는 Drosophila 애벌레의 연속적인 화상 진찰을 허용하는 LarvaSPA에게 불린 애벌레 장착 방법을 제시합니다. 이 방법은 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버 슬립에 유충을 부분적으로 부착하고 폴리디메틸실록산 (PDMS) 블록을 사용하여 애벌레 의 움직임을 추가로 억제하는 것을 포함합니다. 이 방법은 두 번째 instar에서 방황 세 번째 instar에 개발 단계에서 애벌레와 호환됩니다. 우리는 수상 돌기 성장 및 부상 유발 모수석 변성을 포함하여 Drosophila 체감각 뉴런의 동적 과정을 연구하는이 방법의 응용 프로그램을 보여줍니다. 이 방법은 또한 애벌레 바디 벽 의 가까이에 일어나는 많은 그밖 세포 프로세스를 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다.
Introduction
타임랩스 라이브 이미징은 동적 세포 과정을 연구하는 강력한 방법입니다. 타임랩스 영화에서 제공하는 공간적 및 시간적 정보는 세포 생물학 질문에 답하기 위한 중요한 세부 사항을 나타낼 수 있습니다. Drosophila 애벌레는 그것의 투명한 바디 벽이 내부 구조물의 비침범성 화상 진찰을 허용하기 때문에 살아있는 화상 진찰을 사용하여 조사를 위한 대중적인 생체 내모형이었습니다 1,2. 또한, 수많은 유전 도구는 형광 적으로 해부학 구조 및 거대 분자 를 라벨 에 Drosophila에서 사용할 수 있습니다3. 그러나, 초파리 유충의 장기 시간 경과 화상 진찰은 도전적입니다. 고정된 초기 태아 또는 pupae와는 달리, Drosophila 애벌레는 살아있는 화상 진찰을 위한 고정화를 필요로 하는 끊임없이 움직입니다. 살아있는 Drosophila 유충을 고정시키는 효과적인 방법은 클로로포름4를가진 할로카본 오일에 장착, 이소플루란 또는 디클로르보스 용액5를사용하여 마취하고, 커버슬립과 현미경슬라이드(6)사이를 압축하는 것을 포함한다. 이 방법 중 일부는 현미경 검사법을 위해 이용되었더라도, 그(것)들의 아무도는 장기 살아있는 화상 진찰을 위해 효과적이지 않습니다. 다른 방법은 기존의 공초점 현미경 또는 광시트 현미경7,8,9를사용하여 유충을 크롤링하는 체내 벽 뉴런을 이미징하기 위해 개발되었다. 그러나, 이러한 방법은 애벌레의 움직임으로 인해 세포 역학을 모니터링하는 데 이상적이지 않습니다.
새로운 방법은 초파리 애벌레의 장기 시간 경과 영상을 달성하기 위해 개발되었다. 다디디메틸실록산(PDMS) "유충 칩"을 사용하여, 드로소필라 유충은 마취 없이 특수 마이크로챔버에서 진공 생성 흡입을 통해 효과적으로 고정화될 수 있다. 그러나,이 방법은 세포 생물학 연구에 대한 높은 시간적 해상도를 제공하지 않으며 동물 크기10에엄격한 제한이 있습니다. 마취 장치를 이용한 또 다른 방법은 여러 시점에서 초파리 유충의 실시간 이미징을 달성하고 신경근접합부 11,12,13,14,15,16을연구하기 위해 적용되었다. 그러나, 이 방법은 또한 30분 이상 연속적인 이미징을 허용하지 않으며,17,18을연구한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는 데스플루란을 반복적으로 사용해야 한다. 최근에는 미세유체 장치와 극저온 마취를 결합하는 새로운 방법이 단기간(분)19시간동안 다양한 크기의 유충을 고정시키는 데 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 냉각 시스템과 같은 특수 장치를 필요로하고 고정화의 긴 기간은 유충의 반복 냉각을 필요로한다.
여기에서 우리는 10 시간 이상 동안 중단 없는 시간 경과 화상 진찰과 호환되는 Drosophila 애벌레를 고정시키는 다재다능한 방법을 제시합니다. 우리가 "부분 부착에 의한 애벌레 안정화"(LarvaSPA)라고 부르는이 방법은 맞춤형 이미징 챔버에서 이미징을위한 커버 슬립에 애벌레 표피를 부착하는 것을 포함합니다. 이 프로토콜은 이미징 챔버를 만드는 방법과 다양한 발달 단계에서 애벌레를 장착하는 방법을 설명합니다. LarvaSPA 방법에서, 원하는 바디 세그먼트는 UV 반응성 접착제를 사용하여 커버슬립에 부착된다. PDMS 입방체는 또한 유충에 압력을 가하여 탈출을 방지합니다. 이미징 챔버의 공기와 습기는 이미징 중에 부분적으로 고정된 유충의 생존을 보장합니다. 다른 기술에 비해 LarvaSPA의 장점은 다음과 같습니다 : (1) 높은 시간 및 공간 해상도와 시간 동안 그대로 Drosophila 유충의 지속적인 라이브 이미징을 허용하는 첫 번째 방법입니다; (2) 방법은 애벌레 크기에 적은 제한이; (3) 이미징 챔버 와 PDMS 입방체는 최소한의 비용으로 제조 할 수 있으며 재사용할 수 있습니다.
애벌레 장착 방법을 설명하는 것 외에도, 우리는 초파리 수지상 arborization (da) 뉴런의 모수석 개발 및 모수석 변성을 연구하기위한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 제공합니다.
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Protocol
1. 이미징 챔버 만들기
- 금속 프레임은 일반적인 기계 공장의 알루미늄 블록으로 구성할 수 있습니다. 프레임의 사양은 그림 1A에나와 있습니다.
- 이미징 챔버를 구성하려면 긴 커버슬립(22mm x 50mm)과 UV접착제(그림 1A)를사용하여 금속 프레임의 바닥을 밀봉합니다. 핸드 헬드 UV 램프를 사용하여 UV 접착제를 경화.
2. PDMS 입방체 만들기
- PDMS 입방체에 대한 금형을 준비합니다.
- 직사각형(80mm x 55mm) 페트리 접시 또는 원형 셀 배양 판의 내부 표면에 포장 테이프 층을 부착합니다. 1층(두께 0.063 mm)을 제2 스타 애벌레에, 2층(두께 0.126mm)을 초기 3인성 애벌레에 사용하거나, 3층(두께 0.189mm)을 후반 3층 애벌레(그림1B)에사용한다.
- 면도날로 테이프를 특정 너비의 스트립으로 자르세요: 1층 테이프의 경우 1.5mm, 2층 또는 3층 테이프의 경우 2mm입니다. 스트립의 폭 과 두께는 최종 PDMS 입방체가 보유 할 수있는 애벌레의 크기를 결정합니다. 두 스트립 사이에 최소 5mm 의 공간을 둡니다. 공간을 덮는 테이프 레이어를 제거합니다(그림1B).
- 끈적끈적한 테이프를 사용하여 플레이트 의 내부 표면에서 먼지를 제거합니다. 금형을 사용할 준비가 되었습니다.
- PDMS 믹스를 준비합니다.
- PDMS 염기 7 g과 경화제 0.7 g(10:1 비율)을 작은 용기에 완전히 섞습니다.
- 용기를 진공 건조기에서 적어도 15분 동안 놓고 혼합물에서 공기를 제거합니다.
- 1-2 mm 두께에 도달하기 위해 금형에 PDMS 혼합물 약 5.5 g을 천천히 붓습니다(그림 1B).
- PDMS 혼합물을 진공 건조기에서 적어도 15분 동안 다시 놓고 혼합물에서 남은 기포를 제거합니다. 파이펫 팁으로 마지막 몇 개의 거품을 부수게 합니다.
- 65°C에서 2시간 동안 열 인큐베이터에서 평평한 표면에서 PDMS를 경화한다.
- 면도날을 사용하여 금형 가장자리를 따라 경화 된 PDMS를 느슨하게하고 금형에서 분리하십시오. PDMS를 두 개의 큰 스티커 테이프 사이에 실온에서 보관하십시오.
- 초기 및 후반 세 번째 instar 애벌레의 경우, 테이프 스트립에 의해 생성 된 홈을 배치하여 8 mm x 2mm x 1 mm 입방체 (그림 1B의점선을 따라)로 PDMS를 잘라 (단계 2.1.2) 입방체의 긴 측면의 중심에(그림 1B,C). 두 번째 인스타 애벌레의 경우, 입방체를 8mm x 1mm x 1mm로 자른다.
3. 장기 시간 경과 이미징을 위한 애벌레 장착
- 상단 커버슬립을 준비하여 장착합니다.
- 유충의 크기와 일치하는 홈여섯 PDMS 입방체를 선택합니다. 2.1.1단계, 2.1.2 및 2.2.7단계를 기준으로 PDMS의 권장 홈 및 크기를 따릅니다.
- 끈적끈적한 테이프로 PDMS 표면에서 먼지를 제거합니다.
- 나중에 PDMS 입방체를 고정하기 위해 긴 커버 슬립 (22mm x 50mm)에 양면 테이프 4 개 (12mm x 5mm)를 부착하십시오. 양면 테이프의 두 조각 사이의 공간은 PDMS 홈의 폭과 동일해야 합니다.
- 각 PDMS 입방체의 홈에 UV 접착제의 작은 방울 (~ 1.2 μL)을 적용하고 커버 슬립에 양면 테이프 사이의 공간에 UV 접착제 의 여섯 방울을 추가합니다.
- 장착을 위해 애벌레를 준비합니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 애벌레를 물에서 청소하여 신체 표면에서 음식을 제거하십시오.
- 깨끗한 애벌레를 작은 티슈 페이퍼에 뚜껑없이 작은 (35mm) 페트리 접시에 놓습니다. 작은 페트리 접시를 마른 티슈 페이퍼가 들어 있는 대형 페트리 접시에 넣습니다. 화학 후드에 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 이소플루란 8-12 방울 (160-240 μL)을 건조 티슈 페이퍼에 바르고 큰 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
- 애벌레를 모니터링하는 동안 2-3 분 기다립니다. 입걸이 움직이지 않는 큰 페트리 접시에서 애벌레를 꺼내십시오.
- 동물을 마운트합니다.
- 동물의 등쪽 의 등쪽 구조에 구조물을 이미지하려면 고정 된 유충을 커버 슬립의 양면 테이프 사이에 UV 접착제에 놓고 등쪽 표피절을 덮음 슬립을 향하게합니다.
- PDMS 블록으로 각 애벌레를 덮고 유충의 트렁크를 PDMS의 홈에 맞춥습니다. 머리와 유충의 꼬리를 PDMS 홈 바깥쪽에 둡니다. 접착제에 의해 애벌레의 첨탑을 차단하지 마십시오.
- 홈에 힘을 가하지 않고 PDMS 블록의 끝을 양면 테이프에 누릅니다. 부드럽게 PDMS 아래 표피를 평평하게 하기 위해 애벌레의 꼬리를 당깁니다.
- 높은 설정에서 휴대용 UV 램프를 사용하여 4 분 동안 UV 접착제를 경화하십시오 (약 0.07 mW / mm2).
주의: UV 램프를 사용하는 동안 안전 안경으로 눈을 보호하십시오. - 커버슬립을 거꾸로 뒤집고 3.3.4단계를 반복합니다.
- 20 μL-30 μL의 물로 렌즈 용지(15mm x 30mm)를 적시세요. 이미징 챔버 의 하단에 촉촉한 렌즈 용지를 놓습니다(그림 1A, D).
- 애벌레가 챔버의 내부를 향할 수 있도록 챔버에 덮개 슬립을 놓습니다. UV 접착제를 사용하여 커버 슬립의 양쪽 끝을 금속 표면에 부착하십시오(그림 1A, D). 유충의 등쪽은 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰을 위해 준비됩니다(그림 1E).
4. 이미징
- 적절한 현미경을 가진 이미지 애벌레. 이 프로토콜에 도시된 모든결과(그림 2, 도 3, 비디오 S2, 비디오 S3,및 비디오 S4)는40x(1.30 NA) 오일 스레커즈를 가진 공초점 시스템을 사용하여 획득하였다.
5. 이미징 챔버 및 PDMS 입방체의 회복
- 이미징 후 렌즈 용지를 사용하여 상단 커버슬립의 오일을 제거합니다. 상단 커버슬립을 면도날로 커버슬립과 금속 프레임 사이의 공간으로 절단하여 상단 커버슬립을 금속 프레임에서 분리합니다. 이미징 챔버는 재사용할 준비가 되었습니다.
- PDMS 입방체를 상단 커버슬립에서 집게로 분리합니다. 끈적끈적한 테이프에 PDMS 입방체를 굴려 접착제 잔여물과 먼지를 제거합니다. PDMS 입방체는 재사용할 준비가 되어 있습니다.
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Representative Results
유충 이미징 챔버는 맞춤형 금속 프레임과 두 개의 커버슬립을 함께 접착하여 구성됩니다. 금속 프레임의 설계는 그림 1A에지정되어 있습니다. 챔버 내부의 초파리 유충은 UV 접착제 및 PDMS 입방체의 도움으로 상부 커버 슬립에 부착된다. PDMS 입방체 및 양면 테이프에 홈은 유충을 보유하는 공간을 만들기 위해 부착된다(도 1B,C). PDMS는 또한 애벌레 바디 벽을 평평하게 하고 애벌레 운동을 물리적으로 제한하기 위하여 온화한 압력을 가합니다. 마지막으로, 습식 렌즈 용지의 작은 조각은 수분을 제공하기 위해 챔버의 바닥에 배치됩니다. 이 설치는 연속적인 화상 진찰을 위해 10 시간 이상 동안 Drosophila 애벌레를 고정시킬 수 있습니다. 동물의 대부분은 10 시간 후에 살아 있고 pupal 단계로 성장하기 위하여 복구될 수 있습니다. 이미징 챔버는 한 번에 최대 9개의 애벌레를 수용할 수 있습니다. 도 1D는 챔버에 장착된 6개의 후기 3차 애벌레를 나타낸다. 유충의 트렁크는 머리와 꼬리가 자유롭게 움직일 수 있는 동안 고정됩니다(그림1E 및 비디오 S1). 이 방법은 최대 15 시간 동안 연속 고해상도 이미징으로 세 번째 instar 애벌레를 방황하는 두 번째 instar를 이미지화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 챔버는 직립 현미경을 사용하여 이미징을 위해 설계되었지만, 설정은 단순히 챔버를 뒤집어 서 반전 된 현미경에도 작동합니다.
여기서 우리는 모델로서 클래스 IV da(C4 da) 뉴런을 사용하여 뉴런 모수석 역학 및 모수석 변성을 연구하는 데 애벌레SPA의 적용을 입증한다(도2, 도 3, 비디오 S2-S4). C4 다 뉴런은 애벌레 몸 벽에 위치한 체감각 적 노시셉터이며, 그 모수석은 애벌레 표피1,20,21,22를내면에 있다. C4 da 수상돌기는 애벌레 발달 전반에 걸쳐 매우 역동적인 성장 거동을 나타내며, 그 결과 신체 표면 또는 공간충진(23)의완전한 커버리지를 초래한다. C4 다 뉴런은 또한 성공적으로 신체 상해 후 수상 돌기 변성 및 재생을 연구하는 데 사용되었습니다24,25,26,27.
화상 진찰 석반역 역학을 위해, 유충은 2차 instar에서 계란 누워 후 48시간(AEL)에서 120h AEL에 이르는 유충을 점스캔 공초점 현미경을 사용하여 타임랩스 이미징을 위해 이미징 챔버에 장착하였다. 타임랩스 동영상은 ppk-CD4-tdTom 또는 UAS-CD4-tdTom이 ppk-Gal46에의해 구동되는 C4 da 수상돌기의 성장 거동을 포착하기 위해 3분 간격으로 촬영되었습니다. 이미징 기간(최대 12시간)에 걸쳐, C4 다 뉴런의 고차 모수석 가지는 뉴런의 건강을 나타내는 확장, 철회, 가지 형성 및 분기제거(그림 2A-2F)를포함한 복잡한 성장 거동을 나타내었다. 우리의 영화는 또한 다른 모수석에 접촉 한 후 모수석 팁이 철회되는 상형 덴드로 - 수상 돌기 반발을 캡처(그림 2F). 전반적으로, 이 결과는 LarvaSPA를 사용하여 시간 경과 화상 진찰이 신경 발달을 공부를 위해 효과적이다는 것을 보여줍니다.
이미지 모수석 변성을 위해, 우리는 C4 다 뉴런 세포 체 근처 기본 모수석을 분리하기 위해 MaiTai 레이저를 사용했다. 유충을 회수하고 부상 후 1.5시간부터 이미징을 위해 챔버에 장착하였다(AI)(그림 3, 비디오 S4). 영화는 수상돌기 부종, 모수석 조각화 및 모수석 파편 의 정리를 포함하여 모수석 변성 중에 주요 사건을 기록했다. 동일한 실험에서, 애벌레 지방 체는 또한 세포표면(27)에외부화된 포스파티딜세린(PS)을 라벨로 표시하는 센서인 아넥신 V-GFP(AV-GFP)를 분비하도록 설계되었다. 우리는 AV-GFP에 의해 퇴화 모수석의 특정 라벨링을 관찰(그림 3),PS는 식세포증에 의해 후속 허가를위한 먹는 나 신호 역할을 퇴화 모수석의 표면에 노출된 것을 시사27.
그림 1: 애벌레스파 장착을 위한 이미징 챔버. (A)상세 사양을 갖춘 이미징 챔버의 다이어그램으로 상단 뷰와 측면 뷰를 모두 표시합니다. 상단 뷰의 연한 파란색 은색은 축축한 렌즈 용지를 나타냅니다. 챔버는 상단 커버 슬립과 하단 커버 슬립에 의해 밀봉된다. 장착 된 유충의 위치가 설명되어 있습니다. (B) PDMS 혼합물(측면 도면)을 채운 후 PDMS 몰드(상단 뷰)와 금형의 다이어그램을작성한다. 회색 스트립은 각각 두 개의 1층, 2층 및 2개의 3층 테이프 스트립을 나타냅니다. 측면 뷰의 노란색 샤이딩은 금형의 PDMS 혼합물을 나타냅니다. 점선은 경화된 PDMS를 절단할 위치를 나타냅니다. 다이어그램의 측면 뷰는 배율조정에 그려지지 않습니다. (C)PDMS 입방체의 상단 뷰와 측면 뷰를 보여주는 사진. 스케일 바 = 1 mm.(D)장착 하기 전에 이미징 챔버를 보여주는 사진, 그리고 6 개의 고정 후반 instar Drosophila 애벌레 장착 등쪽 측면. 배율 막대 = 10 mm.(E)(D)에서애벌레의 가까운 보기. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수상 돌기 역학의 시간 경과 이미징. (A-F) 이미징 시작 후 특정 시점에서 클래스 IV 다 뉴런 수상돌기의 타임랩스 영화에서 선택한 프레임. 유충의 이미지는 48h AEL(A 및 F),72 h AEL(B), 96 h AEL(C), 및 120 h AEL(D)을 촬영하였다. 뉴런은 ppk>CD4-tdTom(A, D, E및 F)또는 ppk>CD4-tdTom(B 및 C)으로레이블이 지정됩니다. 파란색 화살표는 이전 타임포인트와 비교하여 수상돌기 후퇴를 나타냅니다. 노란색 화살표는 이전 타임포인트와 비교하여 수상돌기 확장을 나타냅니다. (E)이미징 의 12 시간의 끝에 수상 돌기 형태. (F)영화에서 3분 간격으로 연속된 프레임은 두 번째 인스타 애벌레의 모수석 분기가 확장된 방법(노란색 화살표) 및 이어서 다른 수상돌기와 접촉한 후(파란색 화살표) 후퇴하는 방법을 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 모수석 변성의 시간 경과 영상 및 먹는-나 신호의 노출. 레이저 부상 후 클래스 IV 다 뉴런의 퇴화 모수석의 시간 경과 영화에서 선택된 프레임. 수상돌기는 ppk>CD4-tdTom에의해 표시되었다. 퇴화 모수석에 먹는 나 신호 PS는 아넥신-GFP에 의해 검출되었다 (AV-GFP), 이는 지방 체에 의해 분비된다. 노란색 화살표는 AV-GFP 레이블을 나타내는 분기를 가리킵니다. 파란색 화살표는 조각화를 받는 모수석을 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 S1: 제 3 의 instar 애벌레는 PDMS 입방체의 노치에서 고정된다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 S2: 수상돌기는 두 번째 인스타 애벌레에서 동적으로 확장및 후퇴합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 S3: 수상돌기는 방황하는 세 번째 인스타 애벌레에서 동적으로 확장및 후퇴합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
비디오 S4: 수산성 수 식 퇴화 하 고 세 번째 instar 유충에 레이저 부상 후 포스 파티 딜 세린을 노출. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)
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Discussion
여기에서 우리는 LarvaSPA, 장기 시간 경과 화상 진찰을 위한 살아있는 초파리 애벌레를 설치의 다재다능한 방법을 기술합니다. 이 방법은 유충을 복구하거나 재장착할 필요가 없기 때문에 중단 없는 이미징이 가능합니다. 따라서 모수석 변성 및 재생과 같이 완료하는 데 몇 시간이 걸리는 생물학적 과정을 추적하는 데 이상적입니다. 이 방법은 또한 화상 진찰 세포 내 칼슘 역학 및 microtubule 성장과 같은 세포내 사건을 위해 이용될 수 있습니다. 애벌레 몸벽이 이미징 중에 안정되기 때문에, 공간 및 시간적 해상도는 이미징 응용 프로그램에 맞게 조정할 수 있습니다(예: 빠른 세포내 소포 움직임을 추적하거나 뉴런 분기 패턴의 느린 글로벌 변화를 모니터링하기 위해). 또한,이 방법은 다양한 발달 단계에서 애벌레와 호환되며 특수 장비가 필요하지 않습니다. 따라서, 애벌레는 잠재적으로 다양 한 질문을 해결 하기 위해 많은 Drosophila 실험실에 의해 사용할 수 있습니다.
PDMS 입방체의 성질 및 유충의 발달 단계를 포함하여 방법의 성공에 영향을 미치는 요인
PDMS 입방체의 크기와 홈의 깊이는 유충의 크기와 일치할 필요가 있다. 유충에 대한 너무 넓은 PDMS 입방체는 머리와 꼬리를 덮고 저산소증을 일으킬 수 있습니다. 그러나, 좁은 PDMS 입방체는 유충이 움직이는 것을 방지하는 데 효과적이지 않을 수 있다. 너무 깊은 홈은 마찬가지로 애벌레의 움직임을 억제하기에 충분한 압력을 생성하지 않을 것이다. 너무 얕은 홈은 커버 슬립에 애벌레를 부착하기에 충분한 접착제를 보유하지 않을 것이다. 우리의 경험에 따라, PDMS와 홈의 다음과 같은 크기는 유충의 다양한 단계에 권장됩니다 : 8mm x 1mm x 1mm PDMS 입방체 와 1.5 mm x 1mm x 0.063 mm 홈 두 번째 instar 애벌레 (~48 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS 입방체 2mm x 2 mm x 0.126 mm 홈 초기 세 번째 instar 유충 (~72 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS 입방체2mm x 2mm x 0.189 mm 홈으로 3번째 애벌레(~96h AEL 이상).
세 번째 instar 애벌레 (또는 120 h AEL 이상)를 방황하는 것은 어린 유충에 비해 덜 이동하고 챔버에 장착되면 생존하기 위해 더 적은 수분을 필요로합니다. 그(것)들은 또한 두꺼운 표피를 가지고 있고 더 많은 물리적 인 스트레스를 견딜 수 있습니다. 따라서 방황하는 세 번째 인스타 애벌레를 이용한 실험은 성공률이 가장 높습니다. 우리의 손에, 방황 세 번째 instar 애벌레의 80 % 이상이 살아 남았고 장착 후 12 시간 움직이지 않는 상태로 남아 있었습니다. 화상 진찰 도중 사춘기에서 애벌레를 방지하기 위하여는, 우리는 96 시간에서 120 시간 AEL 사이에서 애벌레를 설치하는 것이 좋습니다. 젊은 세 번째 instar 애벌레는 화상 진찰 도중 탈출 또는 죽음의 더 중대한 기회가 있습니다. 전형적으로, 같은 챔버에 장착된 6개의 젊은 세 번째 instar 애벌레 중 적어도 2개는 생존하고 장착 후 10시간 동안 움직이지 않는 채로 남아 있을 것이다. 두 번째 instar 애벌레에 대한 우리의 경험은 제한되어 있으며 생존율은 추정하기 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 성공적으로이 방법을 사용하여 7 시간 동안 두 번째 instar 애벌레를 이미지화했습니다.
장기 화상 진찰의 잠재적인 관심사
애벌레SPA는 수상 돌기 성장 역학 및 변성을 이미징에 매우 유용했지만, 고려해야 할 몇 가지 잠재적 인 주의 사항이 있습니다. 첫째, 우리의 현재 방법에서, 애벌레는 많은 조직에 있는 굶주림 유도한 반응으로 이끌어 낼 수 있는 화상 진찰의 전체 기간 동안 음식의 박탈됩니다. 우리는 장착 후에 10 시간 의 주위에 표피 세포에 있는 과립 구조물의 대형을 관찰했습니다, autophagy에서 유래할 수 있는. 그러므로, 화상 진찰의 처음 몇 시간에서 얻은 결과는 더 생리적으로 관련이 있어야 합니다. 더 긴 시간 척도에 대한 결과는 더 신중한 해석이 필요합니다. 이러한 우려를 최소화하기 위해, 우리의 절차는 잠재적으로 애벌레 먹이를 허용하도록 적응 될 수있다. 둘째, 우리의 방법은 물리적 인 제약과 영양소 섭취의 부족으로 인해 젊은 애벌레의 급속한 성장을 방해 할 수 있습니다. 그러나, 이 관심사는 더 오래된 동물에 적용되지 않을 수 있습니다. 예를 들면, 세 번째 instar 애벌레를 방황하는 것은 연속적인 화상 진찰의 12 시간 후에도 pupae로 돌 수 있습니다, 초기 변태의 조사에 이상적이 게 이 방법을 만들기. 셋째, 지방 체와 창 자 등 깊은 구조의 이미징 몇 가지 도전을 제시. 주된 이유는 더 깊은 조직이 종종 이미징 중에 움직이기 때문에 후처리시 모션 보정이 필요하기 때문입니다. 또한, 광 경로에서 굴절 률 지수의 불일치는 더 깊은 조직을 이미징할 때 구면 수차를 일으킬 수 있습니다. 석유 목표는 그들의 모수석이 신체 표면에서 15 μm 이내이기 때문에 화상 진찰 다 뉴런을 위해 적당하지만, 물 침지 목표는 유충 안쪽에 더 깊은 화상 진찰을 위한 굴절 색인 불일치를 정정하기 위하여 더 나은 선택이 될 수 있었습니다. 넷째, C4다 뉴런은 UV광(28)에의해 활성화될 수 있기 때문에, 애벌레 장착 시 UV 광을 이용하여 잠재적으로 C4다 뉴런 생리학을 변화시킬 수 있다. 우리가 권장 하는 빛 강도 는 C4da 뉴런을 강력 하 게 활성화 하는 수준 보다 훨씬 낮은28,C4da 신경 활동에 관련 된 결과 신중 하 게 해석 될 필요가. UV 접착제는 다양한 생물학적샘플(29,30,31)을 이미징하는 데 사용되어 왔으며 우리 손의 유충에 명백한 독성을 일으키지 않는다. 마지막으로, 생체 내 라이브 이미징에 대한 적절한 현미경 설정을 고려해야합니다. 예를 들어, 공진 스캐너와 회전 디스크 공초점 현미경은 광독성과 광표백을 덜 유발하기 때문에 장기간 라이브 이미징에 더 나은 옵션입니다. 다중 광자 현미경 검사법은 애벌레에 있는 더 깊은 내부 구조물을 화상 진찰을 위해 더 효과적입니다; 장기 화상 진찰은 잠재적으로 포스트 화상 진찰 처리에 의해 정정될 수 있던 견본 또는 초점 표류하는 수개할 수 있었습니다.
LarvaSPA에 대한 가장 일반적인 실패 원인과 이를 해결하기 위한 권장 솔루션
- 애벌레가 너무 많이 움직이거나 탈출: 두 가지 일반적인 이유가 이 문제에 기여할 수 있습니다. 첫 번째는 PDMS 홈이 애벌레에 대해 너무 얕거나 너무 깊을 수 있다는 것입니다. 다른 홈 깊이를 가진 다른 PDMS 입방체를 시도하면 문제가 해결될 수 있습니다. 두 번째 이유는 챔버에 너무 많은 수분이있어 UV 접착제가 약해지기 때문입니다. 챔버내의 렌즈 종이에 첨가된 물의 양을 줄이면 유충을 고정화하는 데 도움이 될 수 있다. 또한 머리와 꼬리가 자유롭게 움직일 수 있기 때문에 PDMS 입방체로 덮인 세그먼트만 이미지화하십시오.
- 유충은 화상 진찰 도중 정지합니다: 유충이 화상 진찰 후에 곧 정지하는 경우에, 그것은 너무 많은 마취에 드러낸 확률이 높습니다. 제대로 마취 된 애벌레는 장착 후 일어나야하며 입 갈고리 확장 및 철회 및 등잔 혈관 수축을 포함한 움직임을 보여줍니다. 이 문제를 해결하기 위해 유충을 마취시키는 데 더 적은 이소플루란을 사용할 수 있습니다. 입 갈고리가 움직이지 않는 직후 마취 페트리 접시에서 유충을 옮김을 옮니다. 유충이 화상 진찰 후에 대략 1 시간 정지하는 경우에, 그것은 일반적으로 탈수 때문에 입니다. 밀봉하기 전에 이미징 챔버에 촉촉한 렌즈 용지 조각을 놓는 것을 기억하십시오. 치사성의 또 다른 일반적인 이유는 UV 접착제가 첨탑을 차단하기 때문입니다. 유충의 중간 세그먼트에 UV 접착제를 제한하고 머리와 꼬리를 덮지 않도록하십시오. 지나치게 넓은 PDMS 입방체는 또한 쉽게 자외선 접착제가 첨탑을 차단하는 원인이 될 수 있습니다.
- 신체 벽에 접힌 것은 이미징을 방해합니다: 장착 하는 동안 접힌 을 발생 하지 않도록 하려면, 마 취 단계 동안 유충을 완전히 고정 하는 것이 중요 하다. 유충이 마비되면 몸을 곧게 펴고 스트레칭하는 것이 더 쉽습니다. 96h AEL 보다 오래된 동물의 경우 UV 접착제를 경화하기 전에 꼬리를 부드럽게 드래그하면 접힌 자조를 효과적으로 줄일 수 있습니다. 어린 애벌레의 꼬리를 드래그하는 것은 몸벽이 깨지기 쉽기 때문에 권장되지 않습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 LarvaSPA 방법의 이전 버전을 설정 링펑 탕 감사합니다; 이미징 챔버의 초기 프로토 타입을 만들기위한 코넬 올린 홀 기계 가게에서 글렌 스완; 금속 프레임을 구성하고 PDMS 입방체 를 만들기에 대한 제안을 제공하기위한 필립 Isermann; 현미경에 접근을 위한 코넬 BRC 화상 진찰 시설 (NIH 교부금 S10OD018516에 의해 투자됨); 원고의 비판적 독서에 대한 마리아 사파르. 이 작품은 H.J.에게 수여 된 코넬 펠로우십에 의해 지원되었다; 코넬 스타트업 펀드와 NIH 보조금(R01NS099125 및 R21OD023824)은 C.H.H.J. 및 C.H.에게 수여되어 프로젝트를 구상하고 실험을 설계했습니다. H.J.는 실험을 수행하였다. H.J와 C.H.는 원고를 썼습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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