Summary
Denne protokol beskriver en metode til montering af Drosophila larver for at opnå længere end 10 timer uafbrudt tid-lapse billeddannelse i intaktlevende dyr. Denne metode kan bruges til at forestille mange biologiske processer tæt på larve kroppen væggen.
Abstract
Live imaging er en værdifuld tilgang til at undersøge cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver er særligt velegnet til in vivo live imaging fordi larve kroppen væggen og de fleste indre organer er gennemsigtige. Men kontinuerlig live imaging af intaktE Drosophila larver i længere end 30 min har været udfordrende, fordi det er vanskeligt at noninvasively immobiliserende larver i lang tid. Her præsenterer vi en larve montering metode kaldet LarvaSPA, der giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse af levende Drosophila larver med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i mere end 10 timer. Denne metode indebærer delvis fastgørelse larver til dæksslip ved hjælp af en UV-reaktiv lim og desuden fastholde larve bevægelse ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) blok. Denne metode er kompatibel med larver på udviklingsstadier fra anden instar til vandrer tredje instar. Vi demonstrerer anvendelser af denne metode i at studere dynamiske processer af Drosophila somatosensoriske neuroner, herunder dendrite vækst og skade-induceret dendrite degeneration. Denne metode kan også anvendes til at studere mange andre cellulære processer, der sker i nærheden af larve kroppen væggen.
Introduction
Time-lapse live imaging er en kraftfuld metode til at studere dynamiske cellulære processer. Den rumlige og tidsmæssige oplysninger fra time-lapse film kan afsløre vigtige detaljer for besvarelse af cellebiologi spørgsmål. Den Drosophila larver har været en populær in vivo model for undersøgelser ved hjælp af levende billeddannelse, fordi dens gennemsigtige krop væg giver mulighed for noninvasive billeddannelse af interne strukturer1,2. Desuden findes der talrige genetiske værktøjer i Drosophila til fluorescerende mærke anatomiske strukturer og makromolekyler3. Men, langsigtet tid-lapse billeddannelse af Drosophila larver er udfordrende. I modsætning til stationære tidlige embryoner eller pupper, Drosophila larver bevæge sig konstant, nødvendiggør immobilisering for live imaging. Effektive måder at immobilisere levende Drosophila larver omfatter montering i halocarbon olie med chloroform4, bedøvelse ved hjælp af isofluran eller Dichlorvos opløsning5, og komprimere mellem dæksrids og mikroskop dias6. Selv om nogle af disse metoder er blevet brugt til mikroskopi, ingen af dem er effektiv til langsigtet live imaging. Andre metoder blev udviklet til billeddannelse kropsvæg neuroner i kravle nde larver ved hjælp af konventionelle konfokale mikroskopi eller light-sheet mikroskopi7,8,9. Men disse metoder er ikke ideelle til overvågning cellulære dynamik på grund af flytning af larver.
Der er udviklet nye metoder for at opnå langsigtet tidsforfaldsscanning af Drosophila larver. Ved hjælp af en polydimethylsiloxan (PDMS) "larver chip", Drosophila larver kan effektivt immobiliseres gennem vakuum-genereret suge i et specialiseret mikrokammer uden bedøvelse. Men denne metode tilbyder ikke høj tidsmæssig opløsning for cellebiologi undersøgelser, og det har strenge begrænsninger på dyrs størrelse10. En anden metode ved hjælp af en anæstesianordning opnået levende billeddannelse af Drosophila larver på flere tidspunkter og er blevet anvendt til at studere neuromuskulære vejkryds11,12,13,14,15,16. Men, denne metode heller ikke giver mulighed for kontinuerlig billeddannelse i længere end 30 min og kræver brug af desflurane gentagne gange, som kan hæmme neurale aktivitet og påvirke den biologiske proces undersøgt17,18. For nylig, en ny metode, der kombinerer mikrofluidic enhed og kryoanesthesi er blevet brugt til at immobilisere larver i forskellige størrelser i korte perioder (minutter)19. Denne metode kræver dog specialiserede anordninger såsom et kølesystem, og længere perioder med immobilisering kræver gentagen afkøling af larverne.
Her præsenterer vi en alsidig metode til immobilisering Drosophila larver, der er kompatibel med uafbrudt time-lapse billeddannelse i længere end 10 timer. Denne metode, som vi kalder "Larva Stabilisering af delvis vedhæftet fil" (LarvaSPA), indebærer at overholde larve neglebånd til en coverslip til billedbehandling i en specialbygget billedbehandling kammer. Denne protokol beskriver, hvordan man laver billedkammeret, og hvordan man monterer larver på en række udviklingsstadier. I LarvaSPA-metoden anbringes de ønskede kropssegmenter på dækstrækket ved hjælp af en UV-reaktiv lim. En PDMS cuboid desuden anvender pres på larverne, forhindrer flugt. Luft og fugt i billedkammeret sikrer overlevelsen af de delvist immobiliserede larver under billeddannelse. Fordele ved LarvaSPA i forhold til andre teknikker omfatter følgende: (1) Det er den første metode, der giver mulighed for kontinuerlig live imaging af intakte Drosophila larver i timevis med høj tidsmæssig og rumlig opløsning; (2) Metoden har færre begrænsninger for larvestørrelse; (3) Billedkammeret og PDMS-kuboider kan fremstilles til en minimal pris og kan genbruges.
Ud over at beskrive larve montering metode, giver vi flere eksempler på dens anvendelse til at studere dendrite udvikling og dendrite degeneration af Drosophila dendritic arborization (da) neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gør billedkammeret
- Metalrammen kan konstrueres fra en aluminiumsblok i et typisk maskinværksted. Rammens specifikationer er illustreret i figur 1A.
- For at konstruere billedkammeret forsegles bunden af metalrammen med en lang dæksel (22 mm x 50 mm) og UV-lim (figur 1A). Kurer UV-limen ved hjælp af en håndholdt UV-lampe.
2. Fremstilling af PDMS cuboids
- Forbered formen til PDMS cuboids.
- Fastgør lag af emballagetape til indersiden af en rektangulær (80 mm x 55 mm) petriskål eller rund cellekulturplade. Brug et lag (0,063 mm tyk) til anden instar larver, 2 lag (0,126 mm tyk) for tidlig tredje instar larver, eller tre lag (0,189 mm tyk) for sen tredje instar larver (Figur 1B).
- Skær båndet i strimler af specifik bredde med et barberblad: 1,5 mm til 1-lags tapen og 2 mm til tape med 2 lag eller 3 lag. Bredden og tykkelsen af strimlen vil bestemme størrelsen af larver, at den endelige PDMS cuboid kan holde. Der efterlades mindst 5 mm mellemrum mellem de to strimler. Fjern de båndlag, der dækker rummet (Figur 1B).
- Fjern støv fra pladens indvendige overflade ved hjælp af tape. Formen er klar til brug.
- Forbered PDMS-blandingen.
- Bland 7 g PDMS-base og 0,7 g hærdningsmiddel (10:1-forhold) grundigt i en lille beholder.
- Beholderen anbringes i et vakuumekssikator i mindst 15 minutter for at fjerne luft fra blandingen.
- Hæld langsomt ca. 5,5 g PDMS-blanding på formen for at nå en tykkelse på 1-2 mm (Figur 1B).
- Pdms-blandingen anbringes igen i vakuumekssikatoren i mindst 15 minutter for at fjerne de resterende luftbobler fra blandingen. Bryd de sidste par bobler med en pipettespids.
- Pdms hærder på en flad overflade i et varmerugemaskine ved 65 °C i 2 timer.
- Brug et barberblad til at løsne den hærdede PDMS langs formens kant og løsrive det fra formen. Opbevar PDMS mellem to stykker stor tape ved stuetemperatur.
- For tidlige og sene tredje instar larver, skærePDMS i 8 mm x 2 mm x 1 mm cuboids (langs de stiplede linjer i figur 1B)ved at placere rillen skabt af båndstrimlen (trin 2.1.2) i midten af den lange side af kuboid (Figur 1B, C). For anden instar larver, skære skuede til 8 mm x 1 mm x 1 mm.
3. Montering af larver til langtidstidsudløbsbilleddannelse
- Forbered den øverste dæksel til montering.
- Vælg seks PDMS kuboider med riller, der matcher larvernes størrelse. Følg den anbefalede rille og størrelse af PDMS baseret på trin 2.1.1, 2.1.2 og 2.2.7.
- Fjern støv fra PDMS's overflade med tape.
- Fastgør fire stykker dobbeltklæbende tape (12 mm x 5 mm) på en lang dæksel (22 mm x 50 mm) til fastgørelse af PDMS-kuboider senere. Mellemrummene mellem de to stykker dobbeltklæbende tape skal være de samme som bredden af PDMS-rillen.
- Påfør en lille dråbe (~1,2 μL) UV-lim i rillen i hver PDMS-kuboid, og tilsæt seks små dråber UV-lim i rummet mellem det dobbeltsidede bånd på dæksgningen.
- Forbered larver til montering.
- Ved hjælp af et par pincet, rense larver i vand for at fjerne mad fra kroppens overflade.
- Placer rene larver på et lille stykke fugtet silkepapir i en lille (35 mm) petriskål uden låg. Placer den lille petriskål i en stor (60 mm) petriskål, der indeholder et stykke tørt silkepapir. I en kemisk hætte, anvende 8-12 dråber (160-240 μL) af isofluran på det tørre silkepapir ved hjælp af en plast overførsel pipette og lukke låget af den store Petriskål.
- Vent 2-3 min, mens overvågning af larver. Tag larverne ud af den store petriskål, når deres mundkroge holder op med at bevæge sig.
- Monter dyrene.
- Til billedstrukturer på dyrets rygside skal de immobiliserede larver placeres på UV-limen mellem det dobbeltsidede bånd på dæksgningen med rygnegleben en angående dæksslip.
- Dæk hver larver med en PDMS blok og passer stammen af larver i rillen af PDMS. Lad larvernes hoved og hale stå uden for PDMS-rillen. Undgå at blokere spiracles af larverne ved limen.
- Tryk ned på enderne af PDMS-blokken på det dobbeltsidede bånd uden at anvende kraft på rillen. Træk forsigtigt i larvernes hale for at flade neglebånd under PDMS.
- Hærd UV-limen i 4 minutter ved hjælp af en håndholdt UV-lampe ved den høje indstilling (ca. 0,07 mW/mm2).
FORSIGTIG: Beskyt øjnene med sikkerhedsbriller, mens du bruger UV-lampen. - Vend dækstrækket på hovedet, og gentag trin 3.3.4.
- Fugt et lille stykke linsepapir (15 mm x 30 mm) med 20 μL-30 μL vand. Placer det fugtede objektivpapir nederst i billedkammeret (figur 1A,D).
- Placer dæksel på kammeret, så larverne vender mod indersiden af kammeret. Klæbe begge ender af dæksel til metaloverfladen ved hjælp af UV-lim(figur 1A,D). Arvernes rygside er klar til billeddannelse under konfokalmikroskop (figur 1E).
4. Billeddannelse
- Billedlarver med et passende mikroskop. Alle resultater, der vises i denne protokol (Figur 2, Figur 3, Video S2, Video S3og Video S4) blev erhvervet ved hjælp af et konfokalsystem med et oliemål på 40 x (1,30 NA).
5. Inddrivelse af billedkammer og PDMS cuboids
- Efter billeddannelse skal olien fjernes på den øverste dæksel ved hjælp af et objektivpapir. Tag den øverste dæksel ud af metalrammen ved at skære ind i rummet mellem dækstrækket og metalrammen med et barberblad. Billedkammeret er klar til genbrug.
- Løslad PDMS cuboids fra den øverste coverslip med pincet. Rul PDMS cuboids på tape for at fjerne lim rester og støv. PDMS-kuboiderne er klar til genbrug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larverneimaging kammer er konstrueret ved limning af en specialfremstillet metalramme og to coverslips sammen. Metalrammens design er angivet i figur 1A. Drosophila larver inde i kammeret holdes til den øverste coverslip ved hjælp af UV-lim og PDMS cuboids. Rillen på PDMS-kuboidog det dobbeltsidede bånd, som kuboider er fastgjort til at skabe plads til at holde larverne (figur 1B,C). PDMS anvender også et let tryk for at flade larvevæggen og fysisk begrænse larvebevægelser. Endelig er et lille stykke vådt linsepapir placeret i bunden af kammeret for at give fugt. Denne opsætning kan immobilisere Drosophila larver i mere end 10 timer for kontinuerlig billedbehandling. De fleste af dyrene er i live efter 10 timer og kan inddrives til at vokse ind i pupal fase. Billedkammeret kan rumme op til ni larver på én gang. Figur 1D viser seks sene tredje instar larver monteret i kammeret. Larvernes stammer er fastgjort, mens deres hoveder og haler frit kan bevæge sig(figur 1E og Video S1). Denne metode er blevet anvendt til at billedet anden stjerne til vandrer tredje instar larver med kontinuerlig høj opløsning billeddannelse for op til 15 h. Kammeret er designet til billeddannelse ved hjælp af opretstående mikroskoper, men opsætningen virker også for omvendte mikroskoper ved blot at vende kammeret.
Her demonstrerer vi anvendelsen af LarvaSPA i at studere neuronal dendrite dynamik og dendrite degeneration ved hjælp af klasse IV da (C4 da) neuroner som model(Figur 2, Figur 3, Videoer S2-S4). C4 da neuroner er somatosensoriske nociceptorer placeret på larve kroppen væggen, hvis dendrites innervate larve epidermis1,20,21,22. C4 da dendrites udviser meget dynamisk vækst adfærd i hele larve udvikling, hvilket resulterer i fuldstændig dækning af kroppens overflade eller rumfyldning23. C4 da neuroner er også blevet anvendt med succes til at studere dendrite degeneration og regenerering efter fysisk skade24,25,26,27.
For billeddannelse dendrite dynamik, larver spænder fra 48 timer efter æglægning (AEL) ved anden stjerne til 120 h AEL på vandrende tredje instar blev monteret i billedbehandling kammer for time-lapse billeddannelse ved hjælp af punkt-scanning konfokal mikroskopi. Time-lapse film blev taget med en 3 min interval for at fange vækst adfærd C4 da dendritter mærket af ppk-CD4-tdTom eller UAS-CD4-tdTom drevet af ppk-Gal46. I hele billeddannelsesperioden (op til 12 timer), den høje orden dendrite grene af C4 da neuroner udstillet komplekse vækst adfærd, herunder udvidelse, tilbagetrækning, gren dannelse, og filial elimination(Figur 2A-2F), der angiver sundhedneuronerne. Vores film også fanget enslydige dendro-dendrite frastødninger, hvor dendrite tips trukket tilbage efter at have kontaktet andre dendrites(Figur 2F). Samlet set viser disse resultater, at time-lapse billedbehandling ved hjælp af LarvaSPA er effektiv til at studere neuroudvikling.
Til billedet dendrite degeneration, vi brugte en MaiTai laser til at bryde primære dendrites nær C4 da neuronal celle organer. Larverne blev inddrevet og monteret i kammeret til billeddannelse fra 1,5 timer efter skade (AI)(Figur 3, Video S4). Filmene indspillede vigtige begivenheder under dendrite degeneration, herunder dendrite hævelse, dendrite fragmentering, og clearance af dendrite vragrester. I samme eksperiment blev larvefedtkroppen også udviklet til at udskille annexin V-GFP (AV-GFP), en sensor, der etiketter eksterniseret fosfatylserin (PS) på celleoverfladen27. Vi observerede specifikke mærkning af av-GFP'ernes degenererende dendritter (figur 3),hvilket tyder på, at PS blev eksponeret på overfladen af degenererende dendritter til at fungere som et spise-mig-signal til efterfølgende clearance ved fagocytose27.
Figur 1: Billedkammeret til LarvaSPA montering. (A) Diagrammer af billedkammeret med detaljerede specifikationer, der viser både den øverste visning og sidevisningen. Den lyseblå skygge i den øverste visning angiver det fugtede linsepapir. Kammeret er forseglet af en top dæksel og en bund dæksel. Placeringen af en monteret larver er illustreret. (B) Diagrammer af PDMS mug (den øverste visning) og formen efter påfyldning med PDMS blandingen (sideview). Strimler i grå angiver henholdsvis to 1-lags, to 2-lags og to båndstrimler med 3 lag. Den gule skygge i sidevisningen angiver PDMS blandingen i formen. De stiplede linjer angiver, hvor den hærdede PDMS skal klippes. Sidevisningen af diagrammet er ikke tegnet til skalering. (C) Fotografier, der viser en topvisning og et sidebillede af en PDMS-kuboid. Skalabar = 1 mm. (D) Fotografier, der viser et billedkammer før montering, og et billedkammer med seks immobiliserede sene tredje instar Drosophila larver monteret rygside op. Skalabar = 10 mm. (E) Et nærmere billede af en larver i (D). Skalabjælke = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Time-lapse billeddannelse af dendrite dynamik. (A-F) Udvalgte billeder fra time-lapse film af klasse IV da neuron dendritter på bestemte tidspunkter efter starten af billeddannelse. Billeder af larverne blev taget 48 h AEL (A og F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C), og 120 h AEL (D). Neuronerne er mærket af ppk>CD4-tdTom (A, D, Eog F) eller ppk >CD4-tdTom (B og C). Blå pile indikerer dendrite tilbagetrækninger i forhold til det foregående tidspunkt. Gule pile angiver dendriteudvidelser sammenlignet med det forrige tidspunkt. (E) Dendrite morfologi i slutningen af 12 h billeddannelse. (F) På hinanden følgende rammer med 3 min intervaller i en film, der illustrerer, hvordan en dendrite gren i en anden instar larver forlænget (gule pile) og efterfølgende trukket tilbage (blå pile), efter at det har taget kontakt med en anden dendrite. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Time-lapse billeddannelse af dendrite degeneration og eksponering af en spise-mig signal. Udvalgte rammer fra en time-lapse film af degenererende dendritter af en klasse IV da neuron efter laser skade. Dendritterne blev mærket af ppk>CD4-tdTom. Den eat-me signal PS om degenererende dendrites blev opdaget af Annexin-GFP (AV-GFP), som udskilles af fedt kroppen. Gule pile peger på grenene, der viser AV-GFP-mærkning. Blå pile peger på dendritter under fragmentering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video S1: En tredje instar larver er immobiliseret i hakket af en PDMS cuboid. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).
Video S2: Dendrites udvide og trække sig tilbage dynamisk i en anden instar larver. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).
Video S3: Dendrites udvide og trække sig tilbage dynamisk i en omvandrende tredje instar larver. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).
Video S4: Dendrites degenerere og eksponere phosphatidylserin efter laser skade i en tredje instar larver. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi LarvaSPA, en alsidig metode til montering af levende Drosophila larver til langsigtet tidsforfaldsbilleddannelse. Denne metode kræver ikke genvinding eller genmontering af larver, hvilket muliggør uafbrudt billeddannelse. Det er derfor ideelt til sporing af biologiske processer, der tager timer at fuldføre, såsom dendrite degeneration og regenerering. Denne metode kan også bruges til billeddannelse intracellulære calcium dynamik og subcellulære begivenheder såsom microtubule vækst. Da larvekroppen væggen er stabil under billeddannelse, den rumlige og tidsmæssige opløsning kan justeres til at passe billeddannelse ansøgning ved hånden (f.eks at spore hurtige subcellulære vesikel bevægelse eller til at overvåge langsomme globale ændringer af neuronal gren mønstre). Desuden er denne metode kompatibel med larver på forskellige udviklingsstadier og kræver ikke særligt udstyr. Således kan LarvaSPA potentielt bruges af mange Drosophila labs til at løse forskellige spørgsmål.
Faktorer, der påvirker metodens succes, herunder PDMS-kuboidets art og larvernes udviklingsstadie
Størrelsen af PDMS cuboid og dybden af rillen skal matche størrelsen af larverne. En PDMS cuboid for bred til larver kan dække hovedet og halen og forårsage hypoxi. En smal PDMS-kuboid er dog muligvis ikke effektivt til at forhindre larver i at bevæge sig. En for dyb rille på samme måde ville ikke generere nok pres til at begrænse bevægelsen af larverne. En for lavvandet rille ville ikke holde nok lim til at holde larverne til dæksslip. Baseret på vores erfaring anbefales følgende dimensioner af PDMS og rillen til forskellige stadier af larver: 8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS kuboider med 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm riller til anden instar larver (~ 48 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS-kuboider med 2 mm x 2 mm x 0,126 mm riller til tidlige tredje instar larver (~72 h AEL) 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS-kuboider med 2 mm x 2 mm x 0,189 mm riller til sen tredje instar larver (~96 h AEL eller ældre).
Vandrer tredje instar larver (på eller ældre end 120 h AEL) bevæge sig mindre i forhold til yngre og kræver mindre fugt for at overleve, når monteret i kammeret. De har også en tykkere neglebånd og kan udholde mere fysisk stress. Derfor eksperimenter ved hjælp af vandrende tredje instar larver har den højeste succesrate. I vores hænder, mere end 80% af vandrende tredje instar larver overlevede og forblev immobile 12 h efter montering. For at forhindre larver fra pupariating under billeddannelse, anbefaler vi montering af larver mellem 96 h til 120 h AEL. Yngre tredje instar larver har en større chance for at undslippe eller død under billeddannelse. Typisk, mindst 2 ud af 6 unge tredje instar larver monteret i samme kammer ville overleve og forblive immobile 10 h efter montering. Vores erfaring med anden instar larver er begrænset, og overlevelsesraten er svært at vurdere. Ikke desto mindre har vi med succes afbildet anden instar larver i 7 timer ved hjælp af denne metode.
Potentielle problemer ved langtidsbehandling
Selvom LarvaSPA har været meget nyttig til billeddannelse dendrite vækst dynamik og degeneration, der er et par potentielle forbehold at overveje. For det første, i vores nuværende metode, larverne er berøvet mad for hele varigheden af billeddannelse, hvilket kan føre til sult-induceret reaktioner i mange væv. Vi har observeret dannelsen af granulære strukturer i epidermale celler omkring 10 timer efter montering, som kan skyldes autofagi. Derfor bør de resultater, der er opnået i de første par timers billeddannelse, være mere fysiologisk relevante. Resultater over længere tidsskalaer kræver mere forsigtig fortolkning. For at minimere denne bekymring, kunne vores procedure potentielt tilpasses til at give mulighed for larve fodring. For det andet kan vores metode forstyrre den hurtige vækst af yngre larver på grund af den fysiske begrænsning og manglen på næringsstofindtag. Denne bekymring gælder dog ikke for ældre dyr. For eksempel kan omvandrende tredje instar larver blive til pupper selv efter 12 h kontinuerlig billeddannelse, hvilket gør denne metode ideel til undersøgelser af tidlig metamorfose. For det tredje, billeddannelse af dybere strukturer såsom fedt krop og tarmen præsenterer nogle udfordringer. En af hovedårsagerne er, at dybere væv ofte bevæger sig under billedbehandling og derfor kræver bevægelseskorrektion i efterbehandling. Derudover kan uoverensstemmelser mellem brydningsindekser i lysstien forårsage sfærisk aberration, når der dannes dybere væv. Mens olie mål er passende for billeddannelse da neuroner, fordi deres dendritter er inden for 15 μm fra kroppens overflade, vand nedsænkning mål kunne være bedre valg til at korrigere brydningsindeks mismatch for billeddannelse dybere inde i larver. Fjerde, fordi C4 da neuroner kan aktiveres ved UV-lys28, ved hjælp af UV-lys under larve montering potentielt kan ændre C4 da neuron fysiologi. Selv om lysintensiteten anbefaler vi er langt under de niveauer, der robust aktivere C4da neuroner28, resultater relateret til C4da neuronal aktivitet skal fortolkes forsigtigt. UV lim er blevet brugt til billeddannelse en bred vifte af biologiske prøver29,30,31 og ikke forårsager indlysende toksicitet for larverne i vores hænder. Endelig bør man overveje den rette mikroskop setup for in vivo live imaging. For eksempel er resonansscannere og roterende skivekonfokale mikroskoper bedre muligheder for langsigtet live billeddannelse, fordi de forårsager mindre fototoksicitet og fotoblegning; multi-foton mikroskopi er mere effektiv til billeddannelse dybere interne strukturer i larverne; langtidsbilledbehandling kan være tilbøjelig til at prøve eller fokusere drivende, hvilket potentielt kunne korrigeres ved efterbehandling.
De mest almindelige årsager til, at LarvaSPA og de anbefalede løsninger kan afhjælpes
- Larver bevæger sig for meget eller undslippe: To almindelige årsager kan bidrage til dette problem. Den første er, at PDMS rillen kan være for lavvandet eller for dyb til larverne. Forsøger en anden PDMS cuboid med en anden rille dybde kan løse problemet. Den anden grund er, at der er for meget fugt i kammeret, svækkelse af UV lim. Reduktion af mængden af vand tilsættes til linsen papir i kammeret kan hjælpe med at immobilisere larver. Hertil kommer, så prøv at billedet kun de segmenter, der er omfattet af PDMS cuboid, fordi hovedet og halen er fri til at bevæge sig.
- Larver dør under billeddannelse: Hvis en larver dør kort efter billeddannelse, er det sandsynligt, at det blev udsat for for meget bedøvelsesmiddel. Korrekt bedøvet larver bør vågne op efter montering og vise bevægelser, herunder mund krog forlængelse og tilbagetrækning og rygaftrækning. For at løse dette problem, mindre isofluran kunne bruges til at bedøve larver. Overfør en larver ud af anæstesipetriskålen umiddelbart efter, at mundkrogen holder op med at bevæge sig. Hvis larver dør omkring en time efter billeddannelse, er det normalt på grund af dehydrering. Husk at placere et stykke fugtet linsepapir i billedkammeret før forsegling. En anden almindelig årsag til dødelighed er, at UV lim blokerer spiracles. Prøv at begrænse UV-lim til de midterste segmenter af larverne og undgå at dække hovedet og halen. En alt for bred PDMS cuboid kan også nemt forårsage UV lim til at blokere spiracles.
- Folder på karrosserivæggen forstyrrer billeddannelse: For at undgå at generere folder under montering, er det vigtigt at fuldt immobilisere larver under anæstesi trin. Når en larver er lammet, er det lettere at rette og strække kroppen. For dyr ældre end 96 h AEL kan du forsigtigt trække halerne, før du hærder UV-limen, effektivt reducere folddannelse. Trække haler af unge larver anbefales ikke, fordi deres krop vægge er skrøbelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Lingfeng Tang for at etablere en tidligere version af LarvaSPA-metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine butik for at gøre tidligere prototyper af billedbehandling kammer; Philipp Isermann til fremstilling af metalrammer og forslag til fremstilling af PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging facilitet for adgang til mikroskoper (finansieret af NIH tilskud S10OD018516); Maria Sapar for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en Cornell Fellowship tildelt HJ; en Cornell-startfond og NIH-tilskud (R01NS099125 og R21OD023824), der blev tildelt C.H.H.J. og C.H., udtænkte projektet og designede forsøgene. H.J. udførte eksperimenterne. H.J og C.H. skrev manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
