長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法
Summary
このプロトコルは、ドロショウジョウバエ幼虫を取り付け、無傷の生きている動物における10時間以上の中断のないタイムラプス画像を達成する方法を記載している。この方法は、幼虫の身体壁に近い多くの生物学的プロセスを画像化するために使用することができる。
Abstract
ライブイメージングは、細胞生物学の問題を調査するための貴重なアプローチです。ショウジョウバの幼虫は、幼虫の体壁とほとんどの内臓が透明であるため、生体内のライブイメージングに特に適しています。しかし、30分を超えて無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングは、幼虫を長時間非侵襲的に固定固定化することが困難であるため困難であった。ここでは、高時間的および空間的分解能を有する生きたショウジョウバエ幼虫を10時間以上連続的にイメージングできるLarvaSPAと呼ばれる幼虫取り付け方法を紹介する。この方法は、UV反応性接着剤を使用してカバースリップに幼虫を部分的に取り付け、さらにポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックを使用して幼虫の動きを抑制することを含む。この方法は、第二のインスターから放浪第三のインスターまでの発達段階での幼虫と互換性があります。我々は、デンドライトの成長および傷害誘発性の樹状皮質変性を含むショウジョウバエ体体性体性感覚ニューロンの動的プロセスを研究する上で、この方法の応用を実証する。この方法は、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するためにも適用することができます。
Introduction
タイムラプスライブイメージングは、動的細胞プロセスを研究するための強力な方法です。タイムラプス映画によって提供される空間的および時間的情報は、細胞生物学の質問に答えるために重要な詳細を明らかにすることができます。ショウジョウバエ幼虫は、その透明な体壁が内部構造1、2の非侵襲的なイメージングを可能にするので、ライブイメージングを使用した調査のための人気のインビボモデルとなっています。さらに、ショウジョウバエでは解剖学的構造および高分子を蛍光標識する多数の遺伝的ツールが利用可能である。しかし、ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化は困難である。静止した初期胚や子犬とは異なり、ショウジョウバエ幼虫は絶えず動き、ライブイメージングのために固定化が必要である。生きたショウジョウバエ幼虫を固定化する有効な方法は、クロロホルム4でハロカーボン油に取り付けること、イソフルランまたはジクロルボス溶液5を用いた麻酔、およびカバースリップと顕微鏡スライド6との間の圧縮を含む。これらの方法のいくつかは顕微鏡検査に使用されてきたが、いずれも長期のライブイメージングに有効ではない。他の方法は、従来の共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡7、8、9を用いて幼虫をクロールする際の身体壁ニューロンのイメージングのために開発された。しかし、これらの方法は、幼虫の動きによる細胞動態のモニタリングには理想的ではありません。
ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化を達成するための新しい方法が開発されました。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の「幼虫チップ」を使用すると、ショウジョウバエ幼虫は麻酔なしで特殊なマイクロチャンバーで真空発生吸引を通して効果的に固定化することができる。しかし、この方法は、細胞生物学の研究のための高い時間分解能を提供していないし、それは動物のサイズ10に厳しい制限を有する。麻酔装置を用いた別の方法は、ショウジョウバエ幼虫のライブイメージングを複数の時点で達成し、神経筋接合部11、12、13、14、15、16の研究に応用されている。しかしながら、この方法は、30分を超える連続イメージングを可能にせず、デスフルランを繰り返し使用する必要があり、これは神経活動を阻害し、研究された生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある17,18である。近年、微小流体装置と凍結麻酔を組み合わせた新しい方法が、短時間(分)19の間、様々なサイズの幼虫を固定化するために使用されている。しかし、この方法は、冷却システムなどの特殊なデバイスを必要とし、固定化の長い期間は、幼虫の繰り返し冷却を必要とします。
ここでは、10時間以上の時間経過画像化と互換性のあるショウジョウバエ幼虫を固定化する汎用性の高い方法を紹介します。この方法は「部分的な取り付けによる幼虫の安定化」(LarvaSPA)と呼び、幼虫のキューティクルをカスタムメイドのイメージングチャンバーでのイメージング用のカバースリップに付着することを含む。このプロトコルは、イメージングチャンバーを作る方法と、様々な発達段階で幼虫を取り付ける方法を説明します。LarvaSPA法では、UV反応性接着剤を使用して、所望のボディセグメントをカバースリップに貼り付けます。PDMS立方体はさらに幼虫に圧力をかけ、脱出を防ぐ。撮像チャンバー内の空気と水分は、イメージング中に部分的に固定化された幼虫の生存を保証します。他の技術よりもLarvaSPAの利点は次のとおりです:(1)それは高い時間的および空間的解像度で何時間も無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。(2)この方法は幼虫のサイズに対する制限が少ない。(3)イメージングチャンバーとPDMS立方体は、最小限のコストで製造することができ、再利用可能です。
幼虫の取り付け方法を説明することに加えて、ショウジョウバエ樹状樹状樹状樹状(da)ニューロンの樹状突起発生および樹状変性を研究するためのその応用例をいくつか紹介する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、長期経過イメージングのために生きたショウジョウバエ幼虫を取り付ける汎用性の高い方法であるLarvaSPAについて説明します。この方法は幼虫の回復や再装着を必要とせず、中断のないイメージングを可能にする。従って、樹状変性や再生など、完了までに数時間かかる生物学的プロセスを追跡するのに理想的です。この方法は、細胞内カルシウムの動態や微小管の成長な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
以前のバージョンのLarvaSPAメソッドを確立してくれたリンフェン・タンに感謝します。イメージングチャンバーの以前のプロトタイプを作るためのコーネルオリンホールマシンショップでグレンスワン。金属フレームを構築し、PDMS立方体を作るための提案を提供するためのフィリップ・イザーマン;コーネル BRC 顕微鏡へのアクセスのための施設 (NIH 助成金 S10OD018516)原稿の批判的な読書のためのマリア・サパー。この作品は、H.J.に授与されたコーネル・フェローシップによって支えられ、H.J.に授与されました。C.H.H.J.とC.H.に授与されたコーネルのスタートアップファンドとNIH助成金(R01NS099125とR21OD023824)は、プロジェクトを考案し、実験を設計しました。H.J.が実験を行った。H.JとC.H.は原稿を書いた。
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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