LarvaSPA, En metod för montering Drosophila Larva för långsiktig Time-Lapse Imaging
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för montering av Drosophila larver för att uppnå längre än 10 h oavbruten timelapse-avbildning hos intakta levande djur. Denna metod kan användas för att avbilda många biologiska processer nära larv kroppsväggen.
Abstract
Live imaging är ett värdefullt tillvägagångssätt för att undersöka cellbiologi frågor. Drosophila larven är särskilt lämpad för in vivo levande bildbehandling eftersom larv kroppsväggen och de flesta inre organ är transparenta. Kontinuerlig levande avbildning av intakta Drosophila larver längre än 30 min har dock varit utmanande eftersom det är svårt att noninvasively immobilismobilisera larver under lång tid. Här presenterar vi en larv monteringsmetod som kallas LarvaSPA som möjliggör kontinuerlig avbildning av levande Drosophila larver med hög tidsmässig och rumslig upplösning längre än 10 timmar. Denna metod innebär delvis fästa larver till täckslip med hjälp av en UV-reaktivt lim och dessutom hindra larv rörelse med hjälp av en polydimethylsiloxane (PDMS) block. Denna metod är kompatibel med larver i utvecklingsstadier från andra instar till vandrande tredje instar. Vi visar tillämpningar av denna metod för att studera dynamiska processer av Drosophila somatosensory nervceller, inklusive dendrit tillväxt och skada-inducerad dendrite degeneration. Denna metod kan också tillämpas för att studera många andra cellulära processer som händer nära larv kroppsväggen.
Introduction
Time-lapse live imaging är en kraftfull metod för att studera dynamiska cellulära processer. Den rumsliga och tidsmässiga information som tillhandahålls av time-lapse filmer kan avslöja viktiga detaljer för att svara cell biologi frågor. Den Drosophila larven har varit en populär in vivo modell för undersökningar med hjälp av levande bildbehandling eftersom dess genomskinliga kroppsvägg möjliggör noninvasive avbildning av interna strukturer1,2. Dessutom finns många genetiska verktyg i Drosophila för att fluorescerande märka anatomiska strukturer och makromolekyler3. Men långsiktig time-lapse imaging av Drosophila larver är utmanande. Till skillnad från stationära tidiga embryon eller pupae, Drosophila larver rör sig ständigt, vilket kräver immobilisering för levande avbildning. Effektiva sätt att immobilisera levande Drosophila larver inkluderar montering i halocarbon olja med kloroform4,anestesi med isofluran eller Dichlorvos lösning5, och komprimera mellan täckslip och mikroskop bild6. Även om vissa av dessa metoder har använts för mikroskopi, ingen av dem är effektiv för långsiktig live imaging. Andra metoder har utvecklats för att avbilda kroppsvägg si krypande larver med konventionell konfokal mikroskopi eller ljusarkmikroskopi7,8,9. Dessa metoder är dock inte idealiska för övervakning av cellulär dynamik på grund av larvernas rörelse.
Nya metoder har utvecklats för att uppnå långsiktig timelapse-avbildning av Drosophila larver. Med hjälp av en polydimetylsiloxan (PDMS) “larva chip”, Drosophila larver kan effektivt immobiliseras genom vakuumgenererad sug i en specialiserad mikrokammare utan anestesi. Denna metod erbjuder dock inte hög tidsmässig upplösning för cellbiologi studier och det har strikta begränsningar för djurstorlek10. En annan metod med hjälp av en anestesienhet uppnått levande bildbehandling av Drosophila larver vid flera tidpunkter och har tillämpats för att studera neuromuskulära korsningar11,12,13,14,15,16. Emellertid, denna metod tillåter inte heller kontinuerlig avbildning längre än 30 min och kräver att använda desfluranupprepade gånger, vilket kan hämma neural aktivitet och påverka den biologiska processen studerade17,18. Nyligen har en ny metod som kombinerar mikrofluidisk enhet och kryonarthesi använts för att immobilisera larver av olika storlekar under korta tidsperioder (minuter)19. Denna metod kräver dock specialiserade enheter som ett kylsystem och längre perioder av immobilisering kräver upprepad kylning av larverna.
Här presenterar vi en mångsidig metod för att immobilisera Drosophila larver som är kompatibel med oavbruten time-lapse imaging längre än 10 h. Denna metod, som vi kallar “Larva stabilisering av partiell bilaga” (LarvaSPA), innebär att följa larv nagelband till en täckslip för bildbehandling i en specialbyggd bildkammare. Detta protokoll beskriver hur man gör bildkammaren och hur man monterar larver på en mängd olika utvecklingsstadier. I LarvaSPA-metoden fästs de önskade karosssegmenten på täckslipen med hjälp av ett UV-reaktivt lim. En PDMS cuboid applicerar dessutom tryck på larverna, vilket förhindrar flykt. Luften och fukten i bildkammaren säkerställer de delvis immobiliserade larvernas överlevnad under avbildningen. Fördelar med LarvaSPA jämfört med andra tekniker inkluderar följande: (1) Det är den första metoden som möjliggör kontinuerlig liveavbildning av intakta Drosophila larver i timmar med hög tidsmässig och rumslig upplösning; (2) Metoden har färre begränsningar av larvstorlek. (3) Bildkammaren och PDMS cuboids kan tillverkas till en minimal kostnad och kan återanvändas.
Förutom att beskriva larv monteringsmetod, ger vi flera exempel på dess tillämpning för att studera dendrit utveckling och dendrite degeneration av Drosophila dendritic arborization (da) nervceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi LarvaSPA, en mångsidig metod för montering av levande Drosophila larver för långsiktig time-lapse imaging. Denna metod kräver inte att larver återhämtas eller återmonteras, vilket möjliggör oavbruten bildbehandling. Det är därför idealiskt för att spåra biologiska processer som tar timmar att slutföra, såsom dendrite degeneration och förnyelse. Denna metod kan också användas för att avbilda intracellulär kalciumdynamik och subcellulära händelser såsom mikrotubuli tillv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Lingfeng Tang för att upprätta en tidigare version av LarvaSPA metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine shop för att göra tidigare prototyper av bildkammaren; Philipp Isermann för att konstruera metallramar och ge förslag på att göra PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging anläggning för tillgång till mikroskop (finansieras av NIH bevilja S10OD018516); Maria Sapar för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en Cornell Fellowship tilldelas H.J.; En Cornell startfond och NIH bidrag (R01NS099125 och R21OD023824) tilldelas C.H. H.J. och C.H. tänkt ut projektet och utformade experimenten. H.J. utförde experimenten. H.J och C.H. skrev manuskriptet.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
