LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.
Abstract
Live imaging is een waardevolle aanpak voor het onderzoeken van celbiologie vragen. De Drosophila larve is bijzonder geschikt voor in vivo levende beeldvorming omdat de larve body wall en de meeste inwendige organen transparant zijn. Echter, continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor langer dan 30 min is een uitdaging, omdat het moeilijk is om niet-invasief immobilisatieimmobilizing larven voor een lange tijd. Hier presenteren we een larve montagemethode genaamd LarvaSPA die het mogelijk maakt voor continue beeldvorming van levende Drosophila larven met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie voor langer dan 10 uur. Deze methode omvat het gedeeltelijk bevestigen van larven aan de coverslip met behulp van een UV-reactieve lijm en bovendien het beperken van larve beweging met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) blok. Deze methode is compatibel met larven in ontwikkelingsstadia van tweede instar tot zwervende derde instar. We tonen toepassingen van deze methode bij het bestuderen van dynamische processen van Drosophila somatosensorische neuronen, waaronder dendrietgroei en door verwondingen veroorzaakte dendrite degeneratie. Deze methode kan ook worden toegepast om vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve body wall te bestuderen.
Introduction
Time-lapse live imaging is een krachtige methode voor het bestuderen van dynamische cellulaire processen. De ruimtelijke en tijdelijke informatie die door time-lapse films kan onthullen belangrijke details voor het beantwoorden van celbiologie vragen. De Drosophila larve is een populair in vivo model voor onderzoeken met behulp van live imaging, omdat de transparante carrosserie zorgt voor niet-invasieve beeldvorming van interne structuren1,2. Daarnaast zijn tal van genetische hulpmiddelen beschikbaar in Drosophila om fluorescerende label anatomische structuren en macromoleculen3. Echter, lange termijn time-lapse beeldvorming van Drosophila larven is een uitdaging. In tegenstelling tot stationaire vroege embryo’s of poppen bewegen Drosophila-larven voortdurend, waardoor immobilisatie nodig is voor live beeldvorming. Effectieve manieren om levende Drosophila-larven te immobiliseren zijn het monteren in halocarbon olie met chloroform4,verdoven met behulp van isoflurane of Dichlorvos oplossing5, en comprimeren tussen de coverslip en de microscoopdia6. Hoewel sommige van deze methoden zijn gebruikt voor microscopie, geen van hen is effectief voor de lange termijn live imaging. Andere methoden werden ontwikkeld voor beeldvorming body wall neuronen in kruipende larven met behulp van conventionele confocale microscopie of licht-sheet microscopie7,8,9. Deze methoden zijn echter niet ideaal voor het monitoren van cellulaire dynamiek als gevolg van de beweging van de larven.
Er zijn nieuwe methoden ontwikkeld om langdurige time-lapse beeldvorming van Drosophila-larven te bereiken. Met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) “larve chip” kunnen Drosophila larven effectief worden geïmmobiliseerd door vacuümgegenereerde zuigkracht in een gespecialiseerde microkamer zonder verdoving. Deze methode biedt echter geen hoge temporele resolutie voor celbiologiestudies en heeft strikte beperkingen op diergrootte10. Een andere methode met behulp van een verdovingsapparaat bereikte live beeldvorming van Drosophila larven op meerdere tijdpunten en is toegepast om neuromusculaire knooppunten11,12,13,14,15,16te bestuderen. Deze methode maakt echter ook geen continue beeldvorming langer dan 30 min mogelijk en vereist herhaaldelijk gebruik van desflurane, wat neurale activiteit kan remmen en het onderzochte biologische proces kan beïnvloeden17,18. Onlangs is een nieuwe methode die microfluïdeen en cryoanesthesie combineert gebruikt om larven van verschillende groottes te immobiliseren voor korte tijd (minuten)19. Deze methode vereist echter gespecialiseerde apparaten zoals een koelsysteem en langere perioden van immobilisatie vereisen herhaalde koeling van de larven.
Hier presenteren we een veelzijdige methode om Drosophila larven te immobiliseren die langer dan 10 uur compatibel is met ononderbroken time-lapse beeldvorming. Deze methode, die we “Larva Stabilization by Partial Attachment” (LarvaSPA) noemen, houdt in dat de larvecuticula wordt vastgemaakt aan een coverslip voor beeldvorming in een op maat gemaakte beeldkamer. Dit protocol beschrijft hoe de beeldkamer te maken en hoe larven te monteren in een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia. In de LarvaSPA-methode worden de gewenste lichaamssegmenten met behulp van een UV-reactieve lijm op de coverslip aangebracht. Een PDMS-cuboïde oefent bovendien druk uit op de larven, waardoor ontsnapping wordt voorkomen. De lucht en het vocht in de beeldkamer zorgen voor het overleven van de gedeeltelijk geïmmobiliseerde larven tijdens beeldvorming. Voordelen van LarvaSPA ten opzichte van andere technieken zijn het volgende: (1) Het is de eerste methode die het mogelijk maakt voor continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor uren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie; (2) De methode kent minder beperkingen op de grootte van de larve; (3) De beeldkamer en PDMS-cuboïden kunnen tegen minimale kosten worden vervaardigd en herbruikbaar zijn.
Naast het beschrijven van de larve montage methode, bieden we verschillende voorbeelden van de toepassing ervan voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling en dendriet degeneratie van Drosophila dendritic arborization (da) neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we LarvaSPA, een veelzijdige methode om levende Drosophila larven te monteren voor langdurige time-lapse beeldvorming. Deze methode vereist geen herstellende of opnieuw monterende larven, waardoor ononderbroken beeldvorming mogelijk is. Het is daarom ideaal voor het bijhouden van biologische processen die uren in beslag nemen, zoals dedenrite degeneratie en regeneratie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor beeldvorming intracellulaire calciumdynamica en subcellulaire gebeurtenissen zoals mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Lingfeng Tang voor het opzetten van een eerdere versie van de LarvaSPA methode; Glenn Swan bij Cornell Olin Hall Machine shop voor het maken van eerdere prototypes van de imaging kamer; Philipp Isermann voor het bouwen van metalen frames en het geven van suggesties over het maken van PDMS-cuboïden; Cornell BRC Imaging faciliteit voor toegang tot microscopen (gefinancierd door NIH subsidie S10OD018516); Maria Sapar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Cornell Fellowship toegekend aan H.J.; een Cornell start-up fonds en NIH subsidies (R01NS099125 en R21OD023824) toegekend aan C.H. H.J. en C.H. bedacht het project en ontwierp de experimenten. H.J. voerde de experimenten uit. H.J. en C.H. schreven het manuscript.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
