LarvaSPA, um método para montagem de larva drosophila para imagem de lapso de tempo de longo prazo
Summary
Este protocolo descreve um método para montar larvas drosophila para alcançar mais de 10 h de imagens ininterruptas de lapso de tempo em animais vivos intactos. Este método pode ser usado para visualizar muitos processos biológicos próximos à parede do corpo larval.
Abstract
Imagens vivas são uma abordagem valiosa para investigar questões de biologia celular. A larva Drosophila é particularmente adequada para imagens ao vivo ao vivo porque a parede do corpo larval e a maioria dos órgãos internos são transparentes. No entanto, imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por mais de 30 min têm sido desafiadoras porque é difícil imobilizar larvas não invasivamente imobilizadas por muito tempo. Aqui apresentamos um método de montagem larval chamado LarvaSPA que permite imagens contínuas de larvas Drosophila vivas com alta resolução temporal e espacial por mais de 10 horas. Este método envolve anexar parcialmente larvas ao deslizamento de cobertura usando uma cola uv-reativa e também restringir o movimento larval usando um bloco de polidimetilsiloxano (PDMS). Este método é compatível com larvas em estágios de desenvolvimento de segunda instar a terceira instar vagando. Demonstramos aplicações desse método no estudo de processos dinâmicos de neurônios somatosensoriais Drosophila, incluindo crescimento dendrito e degeneração induzida por lesões. Este método também pode ser aplicado para estudar muitos outros processos celulares que acontecem perto da parede corporal larval.
Introduction
A imagem ao vivo por lapso de tempo é um método poderoso para estudar processos celulares dinâmicos. As informações espaciais e temporais fornecidas por filmes de lapso de tempo podem revelar detalhes importantes para responder a perguntas de biologia celular. A larva Drosophila tem sido um modelo popular in vivo para investigações usando imagens vivas porque sua parede corporal transparente permite imagens não invasivas de estruturas internas1,2. Além disso, inúmeras ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila para rotular fluorescentemente estruturas anatômicas e macromoléculas3. No entanto, a imagem de lapso de tempo de longo prazo das larvas de Drosophila é desafiadora. Ao contrário dos embriões estacionários ou pupas, as larvas de Drosophila se movem constantemente, necessitando de imobilização para imagens vivas. Formas eficazes de imobilizar larvas drosophila vivas incluem montagem em óleo de halcarbono com clorofórmio4,anestesia usando solução isoflurano ou Dichlorvos5, e comprimindo entre o deslizamento de cobertura e o deslizamento de microscópio6. Embora alguns desses métodos tenham sido usados para microscopia, nenhum deles é eficaz para imagens ao vivo de longo prazo. Outros métodos foram desenvolvidos para imagens de neurônios da parede corporal em larvas rastejantes usando microscopia confocal convencional ou microscopia de folha de luz7,8,9. No entanto, esses métodos não são ideais para monitorar a dinâmica celular devido ao movimento das larvas.
Novos métodos foram desenvolvidos para alcançar imagens de lapso de tempo de longo prazo de larvas drosophila. Usando um “chip larva” de polidimetiletilsiloxano (PDMS), as larvas de Drosophila podem ser efetivamente imobilizadas através da sucção gerada pelo vácuo em uma microcâmara especializada sem anestesia. No entanto, este método não oferece alta resolução temporal para estudos de biologia celular e possui limitações estritas no tamanhoanimal 10. Outro método utilizando um dispositivo de anestesia alcançou imagens vivas de larvas de Drosophila em vários pontos de tempo e foi aplicado para estudar junções neuromusculares11,12,13,14,15,16. No entanto, este método também não permite imagens contínuas por mais de 30 min e requer o uso de desflurane repetidamente, o que pode inibir a atividade neural e afetar o processo biológico estudado17,18. Recentemente, um novo método que combina dispositivo microfluido e crioanesteria tem sido usado para imobilizar larvas de vários tamanhos por curtos períodos de tempo (minutos)19. No entanto, este método requer dispositivos especializados, como um sistema de resfriamento e períodos mais longos de imobilização, requerem resfriamento repetido das larvas.
Aqui apresentamos um método versátil de imobilizar larvas drosophila que é compatível com imagens ininterruptas de lapso de tempo por mais de 10 h. Este método, que chamamos de “Estabilização de Larvas por Anexo Parcial” (LarvaSPA), envolve a adesão da cutícula larval a um deslizamento de cobertura para imagem em uma câmara de imagem personalizada. Este protocolo descreve como fazer a câmara de imagem e como montar larvas em uma variedade de estágios de desenvolvimento. No método LarvaSPA, os segmentos do corpo desejado são afixados ao deslizamento de cobertura usando uma cola reativa UV. Um cuboide PDMS adicionalmente aplica pressão às larvas, impedindo a fuga. O ar e a umidade na câmara de imagens garantem a sobrevivência das larvas parcialmente imobilizadas durante a imagem. As vantagens do LarvaSPA sobre outras técnicas incluem o seguinte: (1) É o primeiro método que permite imagens contínuas ao vivo de larvas Drosophila intactas por horas com alta resolução temporal e espacial; (2) O método tem menos limitações no tamanho larval; (3) Os cuboides da câmara de imagem e do PDMS podem ser fabricados a um custo mínimo e são reutilizáveis.
Além de descrever o método de montagem larval, fornecemos vários exemplos de sua aplicação para estudar desenvolvimento dendrito e degeneração dendrite de neurônios de arborização dendríticas drosophila (da).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos larvaspa, um método versátil de montagem larvas drosophila vivas para imagens de lapso de tempo a longo prazo. Este método não requer recuperação ou remontagem de larvas, permitindo imagens ininterruptas. Por isso, é ideal para acompanhar processos biológicos que levam horas para serem concluídos, como degeneração e regeneração. Este método também pode ser usado para imagens de dinâmica scalcicelular e eventos subcelulares, como o crescimento de microtúbulos. Como a parede do co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Lingfeng Tang por estabelecer uma versão anterior do método LarvaSPA; Glenn Swan na loja Cornell Olin Hall Machine para fazer protótipos anteriores da câmara de imagem; Philipp Isermann para a construção de esquadrias metálicas e sugestões sobre a fabricação de cuboides PDMS; Instalação de imagem cornell BRC para acesso a microscópios (financiada pelo NIH grant S10OD018516); Maria Sapar para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa Cornell concedida a H.J.; um fundo inicial de Cornell e subvenções nih (R01NS099125 e R21OD023824) concedidos a C.H. H.J. e C.H. conceberam o projeto e projetaram os experimentos. H.J. conduziu os experimentos. H.J e C.H. escreveram o manuscrito.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
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