Summary

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

Este protocolo apresenta uma maneira simples e coerente de regulamentar transitoriamente um gene de interesse usando modRNA após infarto do miocárdio em camundongos.

Abstract

O infarto do miocárdio (MI) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental. Na última década, a terapia genética tornou-se uma opção promissora de tratamento para doenças cardíacas, devido à sua eficiência e efeitos terapêuticos excepcionais. Em um esforço para reparar o tecido danificado pós-MI, vários estudos têm empregado terapia genética baseada em DNA ou viral, mas enfrentaram obstáculos consideráveis devido à expressão pobre e descontrolada dos genes entregues, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. O mRNA modificado sintético (modRNA) apresenta uma nova abordagem de terapia genética que oferece alta, transitória, segura, não imunomunogênica e entrega mRNA controlada ao tecido cardíaco sem qualquer risco de integração genômica. Devido a essas características notáveis combinadas com sua farmacocinética em forma de sino no coração, o modRNA tornou-se uma abordagem atraente para o tratamento de doenças cardíacas. No entanto, para aumentar sua eficácia in vivo, um método de entrega consistente e confiável precisa ser seguido. Assim, para maximizar a eficiência de entrega do modRNA e a consistência de rendimento no uso de modRNA para aplicações in vivo, é apresentado um método otimizado de preparação e entrega de injeção intracardiac modRNA em um modelo MI de mouse. Este protocolo tornará a entrega de modRNA mais acessível para pesquisas básicas e translacionais.

Introduction

A terapia genética é uma poderosa ferramenta que envolve a entrega de ácidos nucleicos para o tratamento, cura ou prevenção de doenças humanas. Apesar do progresso nas abordagens diagnósticas e terapêuticas para doenças cardíacas, houve sucesso limitado na entrega de genes no infarto do miocárdio (MI) e insuficiência cardíaca (HF). Por mais simples que o processo de terapia genética pareça, é uma abordagem marcadamente complexa considerando os muitos fatores que precisam ser otimizados antes de empregar um determinado veículo de entrega. O vetor de parto correto deve ser não-imunogênico, eficiente e estável dentro do corpo humano. Os esforços nesse campo geraram dois tipos de sistemas de entrega: viral ou não viral. Os sistemas virais amplamente utilizados, incluindo transferência de genes por adenovírus, retrovírus, lentivírus ou vírus associado ao adeno, mostraram uma capacidade de transdução excepcional. No entanto, seu uso em clínicas é limitado devido à forte resposta imune induzida1, risco de tumorigênese2, ou a presença de anticorpos neutralizantes3, todos os quais permanecem um grande obstáculo para a aplicação ampla e eficaz de vetores virais na terapia genética humana. Por outro lado, apesar de seu impressionante padrão de expressão, a entrega de DNA plasmídeo nu exibe uma baixa eficiência de transfecção, enquanto a transferência de mRNA apresenta alta imunogenicidade e suscetibilidade à degradação pelo RNase4.

Com a extensa pesquisa no campo do mRNA, o modRNA tornou-se uma ferramenta atraente para a entrega de genes ao coração e a vários outros órgãos devido às suas inúmeras vantagens sobre os vetores tradicionais5. A substituição completa do urido por pseudouridina de ocorrência natural resulta em expressão proteica mais robusta e transitória, com indução mínima de resposta imune inata e risco de integração genômica6. Protocolos recentemente estabelecidos utilizam uma quantidade otimizada de analógico de tampa antiverré (ARCA) que aumenta ainda mais a tradução proteica aumentando a estabilidade e transabilidade do mRNA7sintético .

Relatórios anteriores mostraram a expressão de vários genes repórteres ou funcionais entregues por modRNA no miocárdio roedor após MI. Com aplicações de modRNA, áreas significativas do miocárdio, incluindo tanto cardiomiócitos quanto nãocardiomiócitos, foram transfectadas com sucesso lesão pós-cardíaca8 para induzir angiogênese9,,10, sobrevivência de células cardíacas11e proliferação de cardiomiócitos12. Uma única administração de modRNA codificada para follistatina humana mutada 1 induz a proliferação de CMs adultos de camundongos e aumenta significativamente a função cardíaca, diminui o tamanho da cicatriz e aumenta a densidade capilar 4 semanas após o MI12. Um estudo mais recente relatou melhora da função cardíaca após o MI com a aplicação de modRNA VEGFA em um modelo de suíno10.

Assim, com o aumento da popularidade do modRNA no campo cardíaco, é essencial desenvolver e otimizar um protocolo para a entrega de modRNA ao coração pós-MI. Aqui é um protocolo que descreve a preparação e a entrega de modRNA purificado e otimizado em uma formulação citrato-salina biocompatível que fornece expressão proteica robusta e estável sem estimular qualquer resposta imune. O método mostrado neste protocolo e vídeo demonstra o procedimento cirúrgico padrão de um MI de camundongos por ligadura permanente da artéria descendente anterior esquerda (LAD), seguido por três injeções intracardiac de local de modRNA. O objetivo deste artigo é definir claramente um método altamente preciso e reprodutível de entrega de modRNA ao miocárdio murine para tornar a aplicação de modRNA amplamente acessível para terapia genética cardíaca.

Protocol

Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no Comitê de Cuidados Institucionais e De Uso do Monte Sinai. 1. Síntese de modRNA NOTA: Os detalhes da síntese modRNA podem ser encontrados em Kondrat et al.13. Peça os modelos plasmídeos(Tabela de Materiais)e gere um produto PCR limpo para usar como modelo mRNA. Prepare os modRNAs por transcrição in vitro c…

Representative Results

Camundongos de oito a dez semanas foram anestesiados com isoflurano e entubados. Após o animal estar sob anestesia, a região torácica esquerda foi raspada e esterilizada com etanol, e o coração foi exposto para ligadura LAD. A artéria coronária esquerda foi ocluída por amarrar firmemente a sutura sob a artéria (representação diagrama Figura 1A). Após um infarto bem sucedido (indicado pela paling da parede livre ventricular esquerda), uma injeção direta de 100 μg de Luc ou Cre …

Discussion

A terapia genética tem mostrado um enorme potencial para avançar significativamente no tratamento de doenças cardíacas. No entanto, as ferramentas tradicionais empregadas nos ensaios clínicos iniciais para o tratamento de HF têm mostrado sucesso limitado e estão associadas a efeitos colaterais graves. O RNA modificado apresenta uma entrega genética não-viral que está continuamente ganhando popularidade como uma ferramenta de transferência genética no coração. ModRNA não requer localização nuclear de gene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem Ann Anu Kurian por sua ajuda com este manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de iniciação em cardiologia concedida ao laboratório Zangi e também pela concessão do NIH R01 HL142768-01

Materials

Adenosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G TriLink Biotechnologies N-7003
Bioluminescense imaging system Perkin Elmer 124262 IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors FST 18200-09
Cardiac tropnin I Abcam 47003
Cytidine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System Harvard Apparatus 75-2001
Forceps- Adson FST 91106-12
Forceps- Dumont #7 FST 91197-00
Guanosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
In vitro transcription kit Invitrogen AMB13345 5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula Harvard Apparatus
Megaclear kit Life Technologies
Mouse ventilator Harvard Apparatus 73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081
NanoDrop Spectrometer Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors FST 12002-12
Plasmid templates GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors FST 14200-12
Stereomicroscope Zeiss
Sutures Ethicon Y433H 5.00
Sutures Ethicon Y432H 6.00
Sutures Ethicon 7733G 7.00
T7 DNase enzyme Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Tape station Aligent 4200
Transcription clean up kit Invitrogen AM1908 Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k Amicon UFC801096

References

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Cite This Article
Kaur, K., Sultana, N., Hadas, Y., Magadum, A., Sharkar, M. T. K., Chepurko, E., Zangi, L. Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model. J. Vis. Exp. (160), e60832, doi:10.3791/60832 (2020).

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