Summary

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מציג דרך פשוטה וקוהרנטית לupregulate גן של עניין באמצעות modRNA לאחר אוטם שריר הלב בעכברים.

Abstract

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה בעולם המערבי. בעשור האחרון, טיפול גנטי הפך לאפשרות טיפול מבטיח עבור מחלות לב, בשל היעילות שלה השפעות טיפוליות יוצאת דופן. במאמץ לתקן את הרקמה הפגומה post-MI, מחקרים שונים המועסקים DNA מבוססי או נגיפי טיפול גנטי אבל יש התמודד מכשולים ניכרים בשל הביטוי המסכן ובלתי מבוקרת של הגנים הנמסרים, בצקת, הפרעת קצב, והיפרפרס לב. שונה סינתטי mRNA (modRNA) מציג גישה גנטית הרומן טיפול המציעה גבוהה, ארעי, בטוח, לא חיסוני, מסירה mRNA מבוקרת לרקמת הלב ללא כל סיכון של אינטגרציה גנומית. בשל המאפיינים המדהימים הללו בשילוב עם הפרמקוקינטיקה בצורת פעמון בלב, הפכה modRNA לגישה אטרקטיבית לטיפול במחלת לב. עם זאת, כדי להגביר את יעילותו ב vivo, שיטת מסירה עקבית ואמינה צריך להיות אחריו. מכאן, כדי למקסם את יעילות מסירה modRNA ועקביות תשואה בשימוש modRNA עבור יישומים vivo, שיטה ממוטבת של הכנה ומסירה של הזרקת modRNA בתוך מודל MI העכבר מוצג. פרוטוקול זה יהפוך את מסירת modRNA לנגישה יותר עבור מחקר בסיסי וטרנסלייתי.

Introduction

טיפול גנטי הוא כלי רב עוצמה מעורבים המסירה של חומצות גרעין לטיפול, ריפוי, או מניעה של מחלות אנושיות. למרות ההתקדמות בגישות אבחון וטיפולי למחלת לב, יש הצלחה מוגבלת בהעברת גנים אוטם שריר הלב (MI) ואי ספיקת לב (HF). פשוט כמו תהליך של ריפוי גנטי נראה, היא גישה מורכבת במידה ניכרת בהתחשב גורמים רבים שצריכים להיות ממוטבים לפני שימוש ברכב משלוח מסוים. וקטור משלוח נכון צריך להיות לא חיסוני, יעיל, ויציב בתוך גוף האדם. המאמצים בתחום זה יצרו שני סוגים של מערכות משלוח: נגיפי או לא ויראלי. בשימוש נרחב מערכות ויראליות, כולל העברה גנטית על ידי אדנווירוס, רטרווירוס, הנגיף, או וירוס הקשורים adeno, הראו קיבולת התמרה יוצאת דופן. עם זאת, השימוש שלהם במרפאות מוגבל בשל התגובה החיסונית חזקה הנגרמת1, הסיכון של tumorigenesis2, או הנוכחות של נוגדנים לנטרל3, כולם נשארים מכשול גדול ליישום רחב ואפקטיבי של וקטורים ויראליות בטיפול גנטי האדם. מצד שני, למרות דפוס הביטוי המרשים שלהם, המסירה של ה-DNA העירום מציג יעילות הזיהום הנמוך, בעוד mRNA העברה מציג חיסוני גבוה ורגישות השפלה על ידי RNase4.

עם מחקר נרחב בתחום של mRNA, modRNA הפך לכלי אטרקטיבי עבור העברת גנים ללב ואיברים אחרים שונים בשל יתרונותיה הרבים על פני וקטורים מסורתיים5. החלפת השלמה של uridine עם התוצאות הטבעיות המתרחשות באופן טבעי ביטוי חלבונים חזקים יותר וארעי, עם אינדוקציה מינימלית של התגובה החיסונית מולדת הסיכון של אינטגרציה גנומית6. פרוטוקולים שהוקמו לאחרונה להשתמש כמות ממוטבת של אנטי הפוכה כובע אנלוגי (מארקה) כי עוד מגביר את תרגום החלבון על ידי הגברת היציבות והיכולת הטרנססינתטית של mRNA הסינתטי7.

דיווחים קודמים הראו את הביטוי של כתבת שונים או גנים פונקציונליים שנמסרו על ידי modRNA ב שריר הלב מכרסם לאחר MI. עם יישומים modrna, אזורים משמעותיים של שריר הלב, כולל הקרדיוציטים וללא קרדיוציטים, היתה בהצלחה לאחר הפגיעה הפוסט-קרדיולוגית8 כדי לגרום לאנגיוגנזה9,10, הישרדות תא הלב11, ו התפשטות קרדיומוציט12. מנהל יחיד של modRNA מקודד עבור האדם מוטציה follistatin כמו 1 גורם התפשטות של העכבר CMs למבוגרים ומגדילה באופן משמעותי את תפקוד הלב, מקטין את גודל הצלקת, ומגביר את צפיפות נימי 4 שבועות post-MI12. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על תפקוד לב משופר לאחר MI עם יישום של וודרנה modRNA במודל חזיר10.

כך, עם הפופולריות הגוברת של modRNA בשדה הלב, זה חיוני לפתח ולייעל פרוטוקול למשלוח של modRNA ללב post-MI. בזאת הוא פרוטוקול המתאר את ההכנה והמסירה של מודנה מטוהרים ואופטימיזציה בניסוח ביולוגי מלוחים ציטראט המספק חזק, ביטוי חלבון יציב מבלי לעורר תגובה חיסונית. השיטה המוצגת בפרוטוקול זה וידאו מדגים את ההליך הכירורגי הרגיל של העכבר MI על ידי הארכה לצמיתות של העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), ואחריו שלושה זריקות האתר תאיים של modRNA. המטרה של הנייר הזה היא להגדיר בבירור שיטה מדויקת מאוד מדויק של משלוח modRNA כדי שריר הלב murine כדי להפוך יישום modRNA נגיש באופן נרחב לטיפול גנטי לב.

Protocol

כל הליכי החיות המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה ע י Icahn בראש הועדה המוסדית של הר סיני. 1. סינתזה של modRNA הערה: הפרטים של סינתזה של modRNA ניתן למצוא ב-Kondrat ואח ’13. הזמן את תבניות הפלביניים (טבלת חומרים) וצור מוצר PCR נקי שישמש כתבנית mr…

Representative Results

שמונה עד עשרה עכברים בני שבוע. הורדם עם איזולבנה וצינורות לאחר שהחיה הייתה תחת הרדמה, אזור החזה השמאלי היה מגולח ומעוקר באתנול, והלב נחשף לקשר בחור. עורק העורקים השמאלי הושאר בחוזקה על ידי שיסוף התפר מתחת לעורק הראשי (ייצוג התרשים באיור 1A). לאחר אוטם מוצלח (המצוין על-ידי paling ?…

Discussion

טיפול גנטי הראה פוטנציאל עצום כדי לקדם באופן משמעותי את הטיפול במחלת לב. עם זאת, כלים מסורתיים המועסקים ניסויים קליניים הראשונית לטיפול ב-HF הראו הצלחה מוגבלת משויכים תופעות לוואי חמורות. RNA שונה מציג משלוח גנטי לא נגיפי כי הוא צובר פופולריות ברציפות ככלי העברת גנים בלב. ModRNA לא דורש לוקליזצ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מכירים אן אנו קונאן על עזרתה בכתב יד זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק הסטארט-up קרדיולוגיה הוענק המעבדה Zangi וגם על ידי NIH מענק R01 HL142768-01

Materials

Adenosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G TriLink Biotechnologies N-7003
Bioluminescense imaging system Perkin Elmer 124262 IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors FST 18200-09
Cardiac tropnin I Abcam 47003
Cytidine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System Harvard Apparatus 75-2001
Forceps- Adson FST 91106-12
Forceps- Dumont #7 FST 91197-00
Guanosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
In vitro transcription kit Invitrogen AMB13345 5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula Harvard Apparatus
Megaclear kit Life Technologies
Mouse ventilator Harvard Apparatus 73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081
NanoDrop Spectrometer Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors FST 12002-12
Plasmid templates GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors FST 14200-12
Stereomicroscope Zeiss
Sutures Ethicon Y433H 5.00
Sutures Ethicon Y432H 6.00
Sutures Ethicon 7733G 7.00
T7 DNase enzyme Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Tape station Aligent 4200
Transcription clean up kit Invitrogen AM1908 Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k Amicon UFC801096

References

  1. Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
  2. Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  3. Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
  4. Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
  5. Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
  6. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  7. Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
  8. Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
  9. Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  10. Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
  11. Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
  12. Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
  13. Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
  14. Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).

Play Video

Cite This Article
Kaur, K., Sultana, N., Hadas, Y., Magadum, A., Sharkar, M. T. K., Chepurko, E., Zangi, L. Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model. J. Vis. Exp. (160), e60832, doi:10.3791/60832 (2020).

View Video