Denne protokollen presenterer en enkel og sammenhengende måte å midlertidig oppreisning et gen av interesse ved hjelp av modRNA etter hjerteinfarkt hos mus.
Hjerteinfarkt (MI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden. I det siste tiåret har genterapi blitt et lovende behandlingsalternativ for hjertesykdom, på grunn av effektiviteten og eksepsjonelle terapeutiske effekter. I et forsøk på å reparere det skadede vevet etter MI har ulike studier brukt DNA-basert eller viral genterapi, men har møtt betydelige hindringer på grunn av det dårlige og ukontrollerte uttrykket av de leverte genene, ødemet, arytmien og hjertehypertrofi. Syntetisk modifisert mRNA (modRNA) presenterer en ny genterapi tilnærming som tilbyr høy, forbigående, trygg, nonimmunogen, og kontrollert mRNA levering til hjertevevet uten risiko for genomisk integrasjon. På grunn av disse bemerkelsesverdige egenskapene kombinert med sin klokkeformede farmakokinetikk i hjertet, har modRNA blitt en attraktiv tilnærming for behandling av hjertesykdom. Men for å øke effektiviteten in vivo, må en konsekvent og pålitelig leveringsmetode følges. Derfor, for å maksimere modRNA levering effektivitet og gi konsistens i modRNA bruk for in vivo applikasjoner, en optimalisert metode for forberedelse og levering av modRNA intracardiac injeksjon i en mus MI-modell presenteres. Denne protokollen vil gjøre modRNA levering mer tilgjengelig for grunnleggende og translasjonell forskning.
Genterapi er et kraftig verktøy som involverer levering av nukleinsyrer for behandling, kur eller forebygging av menneskelige sykdommer. Til tross for fremgangen i diagnostiske og terapeutiske tilnærminger for hjertesykdom, har det vært begrenset suksess i levering av gener i hjerteinfarkt (MI) og hjertesvikt (HF). Så enkelt som prosessen med genterapi ser ut, er det en markert kompleks tilnærming med tanke på de mange faktorene som må optimaliseres før du bruker et bestemt leveringskjøretøy. Den riktige leveringsvektoren skal være ikke-immunogen, effektiv og stabil inne i menneskekroppen. Arbeidet på dette feltet har generert to typer leveringssystemer: viral eller ikke-viral. De mye brukte virussystemene, inkludert genoverføring av adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-assosiert virus, har vist eksepsjonell transduksjonskapasitet. Imidlertid er deres bruk i klinikker begrenset på grunn av den sterke immunresponsen indusert1, risiko for tumorigenesis2, eller tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer3, som alle forblir et stort hinder for bred og effektiv anvendelse av virale vektorer i menneskelig genterapi. På den annen side, til tross for deres imponerende uttrykksmønster, viser levering av naken plasmid DNA en lav transfection effektivitet, mens mRNA overføring presenterer høy immunogenitet og mottakelighet for nedbrytning av RNase4.
Med den omfattende forskningen innen mRNA har modRNA blitt et attraktivt verktøy for levering av gener til hjertet og ulike andre organer på grunn av sine mange fordeler fremfor tradisjonelle vektorer5. Fullstendig utskifting av uridin med naturlig forekommende pseudouridin resulterer i mer robust og forbigående proteinuttrykk, med minimal induksjon av medfødt immunrespons og risiko for genomisk integrasjon6. Nylig etablerte protokoller bruker en optimalisert mengde anti-omvendt cap analog (ARCA) som ytterligere forbedrer proteinoversettelsen ved å øke stabiliteten og transabiliteten til den syntetiske mRNA7.
Tidligere rapporter har vist uttrykk for ulike reporter eller funksjonelle gener levert av modRNA i gnager myokardiet etter MI. Med modRNA-applikasjoner har betydelige områder av myokardiet, inkludert både kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter, blitt vellykket transfisert post-hjerteskade8 for å indusere angiogenese9,,10,hjertecelleoverlevelse11, og kardiomyocyteproliferasjon12. En enkelt administrasjon av modRNA kodet for mutert menneskelig follistatin-lignende 1 induserer spredning av mus voksen CMs og øker hjertefunksjonen betydelig, reduserer arrstørrelse, og øker kapillærtetthet 4 uker etter MI12. En nyere studie rapporterte forbedret hjertefunksjon etter MI med anvendelse av VEGFA modRNA i en svinemodell10.
Dermed, med økt popularitet av modRNA i hjertefeltet, er det viktig å utvikle og optimalisere en protokoll for levering av modRNA til hjertet post-MI. Her er en protokoll som beskriver utarbeidelse og levering av renset og optimalisert modRNA i en biokompatibel citrate-saltvann formulering som gir robust, stabilt proteinuttrykk uten å stimulere noen immunrespons. Metoden som vises i denne protokollen og videoen demonstrerer standard kirurgisk prosedyre av en mus MI ved permanent ligation av venstre fremre synkende arterie (LAD), etterfulgt av tre sted intracardiac injeksjoner av modRNA. Målet for dette papiret er å klart definere en svært nøyaktig og reproduserbar metode for modRNA levering til murine myokardiet for å gjøre modRNA søknad allment tilgjengelig for hjertegenterapi.
Genterapi har vist et enormt potensial til å redusere behandlingen av hjertesykdom betydelig. Tradisjonelle verktøy som brukes i de første kliniske studiene for behandling av HF har imidlertid vist begrenset suksess og er forbundet med alvorlige bivirkninger. Modifisert RNA presenterer en nonviral genlevering som kontinuerlig blir populært som et genoverføringsverktøy i hjertet. ModRNA krever ingen kjernefysisk lokalisering av gener for oversettelse, og tilbyr dermed et effektivt og raskt uttrykk for proteinet. Vid…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Ann Anu Kurian for hennes hjelp med dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av et kardiologi oppstartsstipend tildelt Zangi-laboratoriet og også av NIH-stipendet R01 HL142768-01
Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
Megaclear kit | Life Technologies | ||
Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
Stereomicroscope | Zeiss | ||
Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
Tape station | Aligent | 4200 | |
Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |