Summary
Denne protokollen presenterer en enkel og sammenhengende måte å midlertidig oppreisning et gen av interesse ved hjelp av modRNA etter hjerteinfarkt hos mus.
Abstract
Hjerteinfarkt (MI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden. I det siste tiåret har genterapi blitt et lovende behandlingsalternativ for hjertesykdom, på grunn av effektiviteten og eksepsjonelle terapeutiske effekter. I et forsøk på å reparere det skadede vevet etter MI har ulike studier brukt DNA-basert eller viral genterapi, men har møtt betydelige hindringer på grunn av det dårlige og ukontrollerte uttrykket av de leverte genene, ødemet, arytmien og hjertehypertrofi. Syntetisk modifisert mRNA (modRNA) presenterer en ny genterapi tilnærming som tilbyr høy, forbigående, trygg, nonimmunogen, og kontrollert mRNA levering til hjertevevet uten risiko for genomisk integrasjon. På grunn av disse bemerkelsesverdige egenskapene kombinert med sin klokkeformede farmakokinetikk i hjertet, har modRNA blitt en attraktiv tilnærming for behandling av hjertesykdom. Men for å øke effektiviteten in vivo, må en konsekvent og pålitelig leveringsmetode følges. Derfor, for å maksimere modRNA levering effektivitet og gi konsistens i modRNA bruk for in vivo applikasjoner, en optimalisert metode for forberedelse og levering av modRNA intracardiac injeksjon i en mus MI-modell presenteres. Denne protokollen vil gjøre modRNA levering mer tilgjengelig for grunnleggende og translasjonell forskning.
Introduction
Genterapi er et kraftig verktøy som involverer levering av nukleinsyrer for behandling, kur eller forebygging av menneskelige sykdommer. Til tross for fremgangen i diagnostiske og terapeutiske tilnærminger for hjertesykdom, har det vært begrenset suksess i levering av gener i hjerteinfarkt (MI) og hjertesvikt (HF). Så enkelt som prosessen med genterapi ser ut, er det en markert kompleks tilnærming med tanke på de mange faktorene som må optimaliseres før du bruker et bestemt leveringskjøretøy. Den riktige leveringsvektoren skal være ikke-immunogen, effektiv og stabil inne i menneskekroppen. Arbeidet på dette feltet har generert to typer leveringssystemer: viral eller ikke-viral. De mye brukte virussystemene, inkludert genoverføring av adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-assosiert virus, har vist eksepsjonell transduksjonskapasitet. Imidlertid er deres bruk i klinikker begrenset på grunn av den sterke immunresponsen indusert1, risiko for tumorigenesis2, eller tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer3, som alle forblir et stort hinder for bred og effektiv anvendelse av virale vektorer i menneskelig genterapi. På den annen side, til tross for deres imponerende uttrykksmønster, viser levering av naken plasmid DNA en lav transfection effektivitet, mens mRNA overføring presenterer høy immunogenitet og mottakelighet for nedbrytning av RNase4.
Med den omfattende forskningen innen mRNA har modRNA blitt et attraktivt verktøy for levering av gener til hjertet og ulike andre organer på grunn av sine mange fordeler fremfor tradisjonelle vektorer5. Fullstendig utskifting av uridin med naturlig forekommende pseudouridin resulterer i mer robust og forbigående proteinuttrykk, med minimal induksjon av medfødt immunrespons og risiko for genomisk integrasjon6. Nylig etablerte protokoller bruker en optimalisert mengde anti-omvendt cap analog (ARCA) som ytterligere forbedrer proteinoversettelsen ved å øke stabiliteten og transabiliteten til den syntetiske mRNA7.
Tidligere rapporter har vist uttrykk for ulike reporter eller funksjonelle gener levert av modRNA i gnager myokardiet etter MI. Med modRNA-applikasjoner har betydelige områder av myokardiet, inkludert både kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter, blitt vellykket transfisert post-hjerteskade8 for å indusere angiogenese9,,10,hjertecelleoverlevelse11, og kardiomyocyteproliferasjon12. En enkelt administrasjon av modRNA kodet for mutert menneskelig follistatin-lignende 1 induserer spredning av mus voksen CMs og øker hjertefunksjonen betydelig, reduserer arrstørrelse, og øker kapillærtetthet 4 uker etter MI12. En nyere studie rapporterte forbedret hjertefunksjon etter MI med anvendelse av VEGFA modRNA i en svinemodell10.
Dermed, med økt popularitet av modRNA i hjertefeltet, er det viktig å utvikle og optimalisere en protokoll for levering av modRNA til hjertet post-MI. Her er en protokoll som beskriver utarbeidelse og levering av renset og optimalisert modRNA i en biokompatibel citrate-saltvann formulering som gir robust, stabilt proteinuttrykk uten å stimulere noen immunrespons. Metoden som vises i denne protokollen og videoen demonstrerer standard kirurgisk prosedyre av en mus MI ved permanent ligation av venstre fremre synkende arterie (LAD), etterfulgt av tre sted intracardiac injeksjoner av modRNA. Målet for dette papiret er å klart definere en svært nøyaktig og reproduserbar metode for modRNA levering til murine myokardiet for å gjøre modRNA søknad allment tilgjengelig for hjertegenterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer som er skissert her, er godkjent av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Syntese av modRNA
MERK: Detaljene i modRNA syntese finnes i Kondrat et al.13.
- Bestill plasmidmalene (Tabell over materialer) og generer et rent PCR-produkt som skal brukes som mRNA-mal.
- Forbered modRNAs ved transkripsjon in vitro med en tilpasset ribonucleoside blanding av følgende (Tabell over materialer): T7 transkripsjon kit, 6 mM anti-revers cap analog (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosin triphosphate, 75 mM adenosin triphosphate, 75 mM cytidin triphosphate, 100 mM pseudouridin-5-triphosphate, og T7 DNase enzymet.
- Rens modRNA laget i trinn 1.2 med et transkripsjonsoppryddingssett (Table of Materials) og behandle med antarktisk fosfatase. Deretter repurify modRNA med transkripsjon opprydding kit og kvantifisere den ved hjelp av en spektrofotometer.
- Utfell modRNA med etanol og ammoniumacetat og resuspend i 10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA.
- Konsentrat modRNA for in vivo levering av sentrifugalfiltre og måle kvaliteten ved hjelp av en automatisert elektroforese plattform (Tabell over materialer).
2. Utarbeidelse av modRNA injeksjon for in vivo levering
- Beregn volumet som trengs for 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA injeksjon basert på modRNA-konsentrasjonen.
- Bland det beregnede volumet av modRNA med like deler av sukroseoppløsning tilberedt i nukleasefritt vann (0,3 g/ml) og 0,1 M citratløsning (pH = 7) (20 μL hver anbefales).
- Før det endelige volumet av injeksjonen til 60 μL ved å tilsette saltvannsoppløsning.
3. Hjerteinfarkt kirurgi
- Anestesi og fremstilling av dyret
MERK: Denne studien bruker hann- og hunn-CFW-mus 8–12 uker.- Bedøv musen med 2% isofluran ved hjelp av et induksjonskammer og plasser dyret på ryggen i en ryggstilling med en ansiktsmaske over nesen og munnen for å holde opp anestesi. Opprettholde anestesi ved mekanisk ventilasjon ved hjelp av åndedrettsvern utstyrt med en 7-8 mm luftveisrør og et filter.
- For å immobilisere musen på operasjonsplattformen, fest lemmer med kirurgisk tape. barbere nakkeområdet og venstre side av brystkassen og desinfisere ved hjelp av 70% etanol og povidon jod. Gjenta desinfiseringstrinnet to ganger. Sjekk refleksene, klemme halen og bakføttene for å vurdere dybden av anestesi.
- Undervåk og vedlikehold kjernetemperaturen ved normotermi (37,5 –38 °C).
- Opprettholde en åpen luftvei ved å utføre intratrakeal intubasjon. For å gjøre dette, plasser musen i en ventral stilling med munnen vendt mot eksperimentereren og trekk forsiktig ut tungen. Juster vinkelen på nakken og rett ut intubasjonsbanen og skyv innubasjonskanten.
- I tilfelle dyret ikke er i stand til å puste gjennom det, kan trakeostomi utføres. Utfør et cervikal snitt langs midtlinjen isolerer huden, muskelen, og vev som skisserer luftrøret ved hjelp av et mikroskop. Når luftrøret er godt synlig, sett inn endotrakealrøret i vevet mellom to patronringer under glottiene ved å lage et lite hull og holde den kraniale delen av luftrøret ved hjelp av mikrokirurgiske tang.
- Vær oppmerksom på musens thoraxbevegelse for å kontrollere at begge lungene mottar oksygen. Respirasjonsfrekvensen (RR) skal være ca. 120 åndedrag per minutt, med et inspiratorisk trykk på 17−18 cm H2O.
- Venstre fremre synkende (LAD) arterie ligation
- For å utføre LAD ligation, snu musen forsiktig slik at den ligger på høyre side. Løft huden og utfør en venstre sidet thoracotomy mellom 3rd og fjerde ribbe og dissekere vevet og muskelen nøye. Bruk en cautery for å forhindre blødning.
- Åpne thoraxen forsiktig, og når den er åpen, finn hjertet, uten å berøre lungene med noen skarp gjenstand. Plasser tilbaketrekkingene i snittet for å holde thoraxhulen åpen og ha et klart syn på hjertet. Flytt nå lungene til kanten av snittet og fjern den delen av perikardsekken som dekker hjertet for å få tilgang til den fremre overflaten av hjertet.
- Identifiser nøye LAD, som kan sees som et dypt lys rødt fartøy som ligger mellom lungearterien og venstre auricle. Ligate LAD proksimal med en enkelt sutur av en 7-0 silke sutur. Plasser et brystrør (28 G, venal kateter), mellom 4th og 5th ribben.
- Lukk thorax snittet i lag. Bruk 6-0 silkeløpssuturer til å tilpasse ribber og bruke 5-0 silkeløpsuturer for å lukke huden. Sørg for å legge igjen et riktig vindu for fremtidig ekkokardiografisk måling.
- Tøm forsiktig thoraxen med varm isotonisk oppløsning (9 g natriumklorid i 1 L vann) ved hjelp av en 2 ml sprøyte. Plasser musen på ryggen. Hvis du utfører trakeostomi, ta endotrakealrøret ut og bruk 7-0 silkesyturer tilpasser trakealpatronringene med én enkelt søm. Plasser ansiktsmasken på musen og lukk huden ved hjelp av 5-0 silkeløpende suturer.
- For gjenopprettingsfasen, koble intubasjonsevinlen fra ventilatoren og la spontan pusting. Plasser dyret under en varmelampe til det oppnår bevissthet. Ikke la dyret stå uten tilsyn etter operasjonen før det er helt våkent.
- Administrer smertebehandling med buprenofin ved 0,1 mg/kg kroppsvekt, injisert subkutøst de neste 3 dagene med 12 timer intervaller.
4. Hjertelevering av modRNA
- Lever totalt 60 μL av modRNA som er klargjort i trinn 2.3 intramuskulært (IM) ved hjelp av en insulinsprøyte (31 G) etter en MI.
- Injiser 20 μL av modRNA på tre forskjellige steder i hjertemuskelen rundt infarktområdet (to på hver side av ligasjon og en i toppunktet). Utfør injeksjonene umiddelbart etter LAD, før du lukker brystet.
MERK: Representative bilder av modRNA injeksjonssteder kan ses i figur 1.
- Injiser 20 μL av modRNA på tre forskjellige steder i hjertemuskelen rundt infarktområdet (to på hver side av ligasjon og en i toppunktet). Utfør injeksjonene umiddelbart etter LAD, før du lukker brystet.
5. Protein uttrykk validering i hjerte innlegg MI
- Luciferase modRNA uttrykk ved hjelp av en bioluminescence bildebehandling system
MERK: Totalt 100 μg Luc mRNA tilberedt i 60 μL av sukrosesitratbufferen injiseres direkte i hjertet av CFW-mus etter MI.- Ved 24 timers postMI og modRNA injeksjon, bedøve musene med 2% isofluran ved hjelp av et induksjonskammer og intraperitonealt injisere luciferin (150 mg / g kroppsvekt) for å validere Luc signal in vivo.
- Bilde musene ved hjelp av et bioluminescensbildesystem hvert 2.
- Kvantifiser de innsamlede bildedataene med bildeanalyseprogramvare. Bruk musene injisert med saltvann bare som en grunnlinjeavlesning for Luc-uttrykk og trekk bakgrunnssignalet samlet inn fra de saltvannsinjiserte musene.
MERK: Luc-signalet uttrykkes i p/s/cm2/sr x 106.
- Immunostaining for Cre transfection validering
- For å validere transfeksjonen med Cre, ofre dyrene 24 h postinjeksjon ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon på 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazine etterfulgt av cervical dislokasjon. Før du gjør et snitt, desinfiser brystet og magen ved hjelp av en 70% alkoholvattpinne.
- Åpne thoraxhulen ved å gjøre et tverrgående snitt ~ 1 cm lavere enn brystbenet og flytt saksen mot hodet, kutte gjennom brystkassen.
- Åpne brystet og injiser 1 ml steril PBS i høyre ventrikkelkammer for å fjerne overflødig blod. Avgifter hjertet umiddelbart og legg det i den sterile PBS for å vaske bort det gjenværende blodet.
- Fest hjertet i 4 % paraformaldehyd (PFA) i 24 timer, etterfulgt av inkubasjon over natten i 30 % sukroseoppløsning ved 4 °C. Neste dag legger hjertene i optimalt skjæretemperaturmedium og deler dem i en tykkelse på 10 μm ved hjelp av en kryostat.
- Flekk seksjonene med primær antistoff mot hjertetroponin I (cTNI) og merk dem med et fluorescerende sekundært antistoff. For å identifisere kjernen, flekk med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 min. Bilde lysbildene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
6. Statistisk analyse
- Tegn en stolpediagram basert på Luc-uttrykket i saltvanns- og Luc-injiserte mus og rapporter verdiene som gjennomsnitt ± SEM. Sammenlign de to gruppene ved hjelp av en ikke-test (****p < 0,0001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Åtte til ti uker gamle mus ble bedøvet med isofluran og intubert. Etter at dyret var under anestesi, ble venstre thoraxregion barbert og sterilisert med etanol, og hjertet ble utsatt for LAD ligation. Venstre koronararterie ble okkludert ved å knytte suturen under arterien (diagramrepresentasjon Figur 1A). Etter et vellykket infarkt (indikert ved paling av venstre ventrikulær fri vegg), ble en direkte injeksjon av 100 μg Luc eller Cre modRNA oppløst i sukrose citratbuffer levert direkte inn i myokardiet på tre forskjellige steder (Figur 1B) rundt skadeområdet ved hjelp av en insulinsprøyte. MI-prosedyren med modRNA-injeksjoner varte i 30−45 min per dyr. Dyrene viste ca 90% overlevelse etterprocedure. Etter prosedyren ble brystet og huden godt suturert i lag, og dyret ble fjernet fra ventilasjon så snart det begynte å puste normalt.
Etter å ha utført LAD ligation og påfølgende levering av Luc modRNA injeksjon, validerte vi Luc modRNA transfection ved å se etter Luc protein uttrykk 24 h postinjection ved hjelp av en bioluminescence bildebehandling system (Figur 2A). Vi etablerte i tidligere publikasjoner at selv om proteinuttrykket kan ses til dag 6 ettertransfeksjon, observeres den høyeste transfeksjonseffektiviteten til modRNA ved 24 t8. På samme måte oppdaget vi Luc-signalet i hjertet behandlet med Luc modRNA-injeksjon (1,76 x 108) sammenlignet med musene injisert med sukrosesitratbuffer etter MI (3,0 x 105) (figur 2B).
Videre forsøkte vi å validere modRNA-uttrykket ved å sjekke oversettelsen og biodistribusjonen i en transgen Rosa26mTmG-mus. Dette musemodellsystemet uttrykker cellemembran-lokalisert tdTomato (mT) fluorescensuttrykk i alle kroppsceller / vev og endringer i cellemembran-lokalisert EGFP (mG) fluorescens uttrykk ved Cre rekombinasjon. Dermed, for å observere uttrykket av Cre modRNA, 100 μg Cre modRNA ble injisert direkte inn i myokardiet post-MI i Rosa26mTmG mannlige og kvinnelige mus, og dyrene ble ofret 24 h postsurgery. Hjerter ble løst og behandlet for immunostaining med kardiomyocyte markør cTNI og kjernefysisk markør DAPI (Figur 3A). Vellykket Cre uttrykk var tydelig på grunn av utseendet av grønne fargede celler (Figur 3B), som var et resultat av rekombinasjon med Cre modRNA levert til musen, representert ved endring av tdTomato farge til EGFP rundt Cre injeksjonsstedet (Figur 3C).
Figur 1: LAD ligation og hjertelevering av modRNA. (A)Skjematisk diagram som viser området LAD ligation og tre steder av modRNA injeksjon. (B)Representative bilder av hele musen hjerte innlegg en vellykket MI indusert av permanent ligation(a)og steder av modRNA injeksjon etter MI. Den 100 μg modRNA oppløst i 60 μL av sukrose citrate buffer ble levert i grensesoneområdet rundt infarkt, to på hver side av ligation (b,c) og en i toppunktet (d). Skala bar = 1 cm. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Luc uttrykk analyse etter modRNA injeksjon. Sukrose citrat buffer som inneholder 100 μg Luc modRNA ble injisert direkte i myokardi av CFW mus i en åpen bryst kirurgi. Bioluminescence bildebehandlingssystemet ble brukt til å beregne Luc protein uttrykk ved 24 timer etter injeksjon. (A) Komparative bioluminescerende bilder av kontrollmus (transfected med buffer) vs. mus injisert med Luc modRNA. (B) Kvantifisering av Luc-signal sammenlignet med kontrollmusene målt etter 24 timer ved hjelp av bioluminescensimager. Feillinjen representerer SEM med p < 0.0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Validering av Cre-uttrykk in vivo. Representative bilder av transfiserte hjertekorsseksjoner (kortaksevisning) som validerer uttrykket cre modRNA i Rosa26mTmG-mus 24 timer etter injeksjon. (A) Kardiomyocytter immunostainert med cTNI (rød). (B)Grønne fargede celler representerer Cre transfected celler. (C) Sammenslått bilde som viser Cre aktiverte celler rundt de to injeksjonene. Blå er den kjernefysiske flekken DAPI. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genterapi har vist et enormt potensial til å redusere behandlingen av hjertesykdom betydelig. Tradisjonelle verktøy som brukes i de første kliniske studiene for behandling av HF har imidlertid vist begrenset suksess og er forbundet med alvorlige bivirkninger. Modifisert RNA presenterer en nonviral genlevering som kontinuerlig blir populært som et genoverføringsverktøy i hjertet. ModRNA krever ingen kjernefysisk lokalisering av gener for oversettelse, og tilbyr dermed et effektivt og raskt uttrykk for proteinet. Videre, som mRNA ikke integreres i genomverten, genlevering av modRNA hopper risikoen for mutagenesis. Følgelig, på grunn av sine fordeler over konvensjonelle genleveringskjøretøy, har modRNA blitt en av de mest attraktive plattformene for levering av enkeltgen- eller genkombinasjoner til hjertet. Men til dags dato er det ingen standardisert protokoll for fremstilling og overføring av modRNA til hjertet etterinjury. Dermed var målet her å etablere en standard og optimalisert protokoll for intratracardiac levering av modRNA i gnagerhjerte for å forbedre bruken av modRNA som et genterapiverktøy og for å gjøre den egnet for terapeutiske formål.
I denne protokollen er modRNA utarbeidet ved å erstatte uridin med pseudouridin, etterfulgt av capping med ARCA på 5'-enden. Disse endringene i den sekundære strukturen av mRNA har vist seg å gjengi høyere proteinoversettelse sammenlignet med ulike andre nukleotidmodifikasjoner8. Videre unnslipper denne endrede mRNA-strukturen immunogeniteten etter IM-injeksjoner hos mus ved å begrense anerkjennelsen av tolllignende reseptorer og kjerner6. Her viste vi at naken mRNA-levering med sukrose citratbuffer gir sterk proteinoversettelse i hjertet ved hjelp av en mus-MI-modell. I våre tidligere studier etablerte vi overlegenhet av modRNA levert med sukrose citrate buffer i hjertet i forhold til innkapsling av modRNA i nanopartikler, for eksempel in vivo fectamine eller in vivo jetPEI, som kan hindre modRNA oversettelse til protein8. Den høye bevaringen av RNA ved citrate og ekstra energi levert av sukrose for endoktose i tillegg til å redde den enkelttrådede modRNA-klumpingen kan være årsaken til den markerte økningen i oversettelsen av modRNA levert i sukrose citrate buffer.
Selv om bruken av modRNA har eskalert i prekliniske og kliniske studier10,14 i det siste tiåret, må visse områder undersøkes for forbedret suksess for modRNA i klinikken. For det første kan syntetisering av modRNA i de høye mengdene som kreves for terapeutiske undersøkelser være kostnadsoverkommelig. Dermed er det viktig å utvikle klinisk-grade og kostnadseffektiv modRNA å flytte feltet mot en klinisk RNA terapi fase hos mennesker. For det andre må en klinisk anvendelig leveringsmetode for modRNA identifiseres. Tatt i betraktning skaden forårsaket av hjerte-IM injeksjoner, mindre invasive kateter-baserte leveringsmetoder kan være mer sannsynlig i å overføre den store mengden modRNA nødvendig å transfisere store hjerter.
Til slutt viste dette arbeidet vellykket levering av RNA som inneholder pseudouridin modifikasjoner i musehjertet post MI. Levering av modRNA i sukrose citrate buffer ga et sterkt proteinuttrykk 24 timer etter injeksjonen. Denne protokollen gjør det mulig for forskerne å følge en standardisert levering og proteinevaluering i hjertepostskaden og dermed gi mer tilgjengelighet i utarbeidelse og levering av modRNA for sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Ann Anu Kurian for hennes hjelp med dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av et kardiologi oppstartsstipend tildelt Zangi-laboratoriet og også av NIH-stipendet R01 HL142768-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
