Summary

Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel

Published: June 11, 2020
doi:

Summary

Dit protocol presenteert een eenvoudige en coherente manier om een gen van belang te upreguleren met behulp van modRNA na een hartinfarct bij muizen.

Abstract

Myocardiaal infarct (MI) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld. In het afgelopen decennium is gentherapie een veelbelovende behandelingsoptie geworden voor hart- en vaatziekten, vanwege de efficiëntie en uitzonderlijke therapeutische effecten. In een poging om het beschadigde weefsel post-MI te herstellen, hebben verschillende studies gebruik genomen van DNA-gebaseerde of virale gentherapie, maar hebben aanzienlijke hindernissen ondervonden als gevolg van de slechte en ongecontroleerde expressie van de geleverde genen, oedeem, aritmie en cardiale hypertrofie. Synthetische gemodificeerde mRNA (modRNA) presenteert een nieuwe gentherapie benadering die hoge, voorbijgaande, veilige, niet-immunogenic, en gecontroleerde mRNA levering aan het hartweefsel biedt zonder enig risico van genomische integratie. Door deze opmerkelijke kenmerken in combinatie met de klokvormige farmacokinetiek in het hart is modRNA een aantrekkelijke aanpak geworden voor de behandeling van hartziekten. Om de effectiviteit ervan in vivo te vergroten, moet echter een consistente en betrouwbare leveringsmethode worden gevolgd. Om de modRNA-leveringsefficiëntie en de consistentie van modRNA voor in vivo-toepassingen te maximaliseren, wordt daarom een geoptimaliseerde methode voor voorbereiding en levering van modRNA intracardiac-injectie in een muis-MI-model gepresenteerd. Dit protocol zal modRNA levering toegankelijker maken voor fundamenteel en translationeel onderzoek.

Introduction

Gentherapie is een krachtig instrument waarbij de levering van nucleïnezuren voor de behandeling, genezing, of preventie van menselijke ziekten. Ondanks de vooruitgang in de diagnostische en therapeutische benaderingen voor hart-en vaatziekten, is er beperkt succes in de levering van genen in hartinfarct (MI) en hartfalen (HF). Zo eenvoudig als het proces van gentherapie lijkt, het is een duidelijk complexe aanpak gezien de vele factoren die moeten worden geoptimaliseerd voordat u een bepaald leveringsvoertuig in dienst neemt. De juiste toedoogd moet niet-immunogeen, efficiënt en stabiel zijn in het menselijk lichaam. Inspanningen op dit gebied hebben geleid tot twee soorten leveringssystemen: virale of niet-virale. De veelgebruikte virale systemen, met inbegrip van genoverdracht door adenovirus, retrovirus, lentivirus, of adeno-geassocieerd virus, hebben aangetoond uitzonderlijke transduction capaciteit. Het gebruik ervan in klinieken is echter beperkt als gevolg van de sterke immuunrespons geïnduceerde1, risico op tumorigenese2, of de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen3, die allemaal een groot obstakel blijven voor een brede en effectieve toepassing van virale vectoren in menselijke gentherapie. Aan de andere kant, ondanks hun indrukwekkende expressie patroon, de levering van naakte plasmiDE DNA toont een lage transfectie efficiëntie, terwijl mRNA overdracht presenteert een hoge immunogeniciteit en gevoeligheid voor afbraak door RNase4.

Met het uitgebreide onderzoek op het gebied van mRNA is modRNA een aantrekkelijk instrument geworden voor de levering van genen aan het hart en diverse andere organen vanwege de vele voordelen ten opzichte van traditionele vectoren5. Volledige vervanging van uridine door natuurlijk voorkomende pseudouridine resulteert in een robuustere en voorbijgaande eiwitexpressie, met minimale inductie van aangeboren immuunrespons en risico op genomische integratie6. Recent vastgestelde protocollen maken gebruik van een geoptimaliseerde hoeveelheid anti-reverse cap analog (ARCA) die de eiwitvertaling verder verbetert door de stabiliteit en transabiliteit van het synthetische mRNA7te verhogen.

Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de uitdrukking van verschillende verslaggever of functionele genen geleverd door modRNA in het knaagdier myocardium na MI. Met modRNA-toepassingen zijn belangrijke gebieden van het myocardium, waaronder zowel cardiomyocyten als noncardiomyocyten, met succes doorgetransfecteerd na hartletsel8 om angiogenese9,10,hartceloverleving11en cardiomyocyte proliferatie12te induceren . Een enkele toediening van modRNA gecodeerd voor gemuteerde menselijke follistatine-achtige 1 induceert de proliferatie van muis volwassen CMs en aanzienlijk verhoogt de cardiale functie, vermindert litteken grootte, en verhoogt capillaire dichtheid 4 weken na MI12. Een meer recente studie gemeld verbeterde cardiale functie na MI met toepassing van VEGFA modRNA in een varkens model10.

Dus, met de toegenomen populariteit van modRNA in het hartveld, is het essentieel om een protocol te ontwikkelen en te optimaliseren voor de levering van modRNA aan het hart post-MI. Herein is een protocol dat de voorbereiding en levering van gezuiverde en geoptimaliseerde modRNA beschrijft in een biocompatibele citraat-zoutoplossing die robuuste, stabiele eiwitexpressie biedt zonder enige immuunrespons te stimuleren. De methode in dit protocol en video toont de standaard chirurgische ingreep van een muis MI door permanente ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD), gevolgd door drie site intracardiac injecties van modRNA. Het doel van dit document is om een zeer nauwkeurige en reproduceerbare methode van modRNA levering aan murine myocardium duidelijk te definiëren om modRNA toepassing wijd toegankelijk voor hartgentherapie te maken.

Protocol

Alle dierprocedures die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door Icahn School of Medicine op mount Sinai Institutional Care and Use Committee. 1. Synthese van modRNA OPMERKING: De details van modRNA synthese zijn te vinden in Kondrat et al.13. Bestel de plasmide sjablonen(Tabel van materialen) en het genereren van een schoon PCR-product te gebruiken als de mRNA-sjabloon. Bereid de modRNAs door transcript…

Representative Results

Acht tot tien weken oude muizen werden verdoofd met isoflurane en geïntubeerd. Nadat het dier onder narcose was, werd het linker thoracale gebied geschoren en gesteriliseerd met ethanol, en het hart werd blootgesteld voor LAD ligatie. De linker kransslagader werd afgesloten door stevig knopen van de hechting onder de slagader (diagram vertegenwoordiging Figuur 1A). Na een succesvol infarct (aangegeven door de paling van de linker ventriculaire vrije muur), werd een directe injectie van 100 …

Discussion

Gentherapie heeft aangetoond enorm potentieel om aanzienlijk te bevorderen van de behandeling van hart-en vaatziekten. Echter, traditionele instrumenten die worden gebruikt in de eerste klinische studies voor de behandeling van HF hebben aangetoond beperkt succes en worden geassocieerd met ernstige bijwerkingen. Gemodificeerd RNA presenteert een niet-virale genlevering die voortdurend aan populariteit wint als een genoverdrachtsinstrument in het hart. ModRNA vereist geen nucleaire lokalisatie van genen voor vertaling, en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen Ann Anu Kurian voor haar hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een cardiologie start-up subsidie toegekend aan het Zangi laboratorium en ook door NIH subsidie R01 HL142768-01

Materials

Adenosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G TriLink Biotechnologies N-7003
Bioluminescense imaging system Perkin Elmer 124262 IVIS100 charge-coupled device imaging system
Blunt retractors FST 18200-09
Cardiac tropnin I Abcam 47003
Cytidine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Dual Anesthesia System Harvard Apparatus 75-2001
Forceps- Adson FST 91106-12
Forceps- Dumont #7 FST 91197-00
Guanosine triphosphate Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
In vitro transcription kit Invitrogen AMB13345 5X MEGAscript T7 Kit
Intubation cannula Harvard Apparatus
Megaclear kit Life Technologies
Mouse ventilator Harvard Apparatus 73-4279
N1-methylpseudouridine-5-triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081
NanoDrop Spectrometer Thermo Scientific
Olsen hegar needle holder with suture scissors FST 12002-12
Plasmid templates GeneArt, Thermo Fisher Scientific
Sharp-Pointed Dissecting Scissors FST 14200-12
Stereomicroscope Zeiss
Sutures Ethicon Y433H 5.00
Sutures Ethicon Y432H 6.00
Sutures Ethicon 7733G 7.00
T7 DNase enzyme Invitrogen AMB13345 Included in Megascript kit
Tape station Aligent 4200
Transcription clean up kit Invitrogen AM1908 Megaclear
Ultra-4 centrifugal filters 10k Amicon UFC801096

References

  1. Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
  2. Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  3. Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
  4. Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
  5. Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
  6. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  7. Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
  8. Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
  9. Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  10. Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
  11. Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
  12. Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
  13. Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
  14. Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).

Play Video

Cite This Article
Kaur, K., Sultana, N., Hadas, Y., Magadum, A., Sharkar, M. T. K., Chepurko, E., Zangi, L. Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model. J. Vis. Exp. (160), e60832, doi:10.3791/60832 (2020).

View Video