Summary
Bu protokol, farelerde miyokard enfarktüsü sonrası modRNA kullanarak ilgi genini geçici olarak düzenlemenin basit ve tutarlı bir yolunu sunar.
Abstract
Miyokard enfarktüsü (MI) Batı dünyasında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. Son on yılda, gen tedavisi kalp hastalığı için umut verici bir tedavi seçeneği haline gelmiştir, verimliliği ve olağanüstü terapötik etkileri nedeniyle. MI sonrası hasarlı dokuyu onarmak için yapılan çeşitli çalışmalarda DNA tabanlı veya viral gen terapisi uygulandı, ancak teslim edilen genlerin, ödemin, aritminin ve kardiyak hipertrofisin zayıf ve kontrolsüz ekspresyonu nedeniyle önemli engellerle karşı karşıya kaldılar. Sentetik modifiye mRNA (modRNA), genomik entegrasyon riski olmaksızın kalp dokusuna yüksek, geçici, güvenli, immünojenik olmayan ve kontrollü mRNA iletimi sunan yeni bir gen terapisi yaklaşımı sunar. Kalpteki çan şekilli farmakokinetiği ile birleşen bu dikkat çekici özellikleri nedeniyle, modRNA kalp hastalığının tedavisinde cazip bir yaklaşım haline gelmiştir. Ancak, in vivo etkinliğini artırmak için, tutarlı ve güvenilir bir teslimat yöntemi takip edilmesi gerekir. Bu nedenle, in vivo uygulamaları için modRNA kullanımımodRNA kullanımda modRNA teslim verimliliğini ve verim tutarlılığını en üst düzeye çıkarmak için, bir fare MI modelinde modRNA intrakardiyak enjeksiyonun hazırlanması ve tesliminde optimize edilmiş bir yöntem sunulmuştur. Bu protokol, modRNA teslimatını temel ve çevirisel araştırmalar için daha erişilebilir hale getirecektir.
Introduction
Gen tedavisi, insan hastalıklarının tedavisi, tedavisi veya önlenmesi için nükleik asitlerin teslimini içeren güçlü bir araçtır. Kalp hastalığı için tanı ve tedavi yaklaşımlarında kaydedilen ilerlemeye rağmen, miyokard enfarktüsü (MI) ve kalp yetmezliği (HF) genlerin tesliminde sınırlı başarı olmuştur. Gen terapisi süreci ne kadar basit görünse de, belirli bir teslimat aracını kullanmadan önce optimize edilmesi gereken birçok faktörü göz önünde bulundurarak oldukça karmaşık bir yaklaşımdır. Doğru teslim vektörü insan vücudunda immünojenik olmayan, verimli ve kararlı olmalıdır. Bu alandaki çalışmalar iki tür dağıtım sistemi oluşturmuştur: viral veya viral olmayan. Adenovirüs, retrovirüs, lentivirüs veya adeno ilişkili virüs tarafından gen transferi de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan viral sistemler, olağanüstü transdüksiyon kapasitesi göstermiştir. Ancak, kliniklerde kullanımları nedeniyle güçlü bağışıklık yanıtı indüklenensınırlıdır 1, tümörigenez riski2, veya nötralize antikorların varlığı3, tüm bunlar insan gen tedavisinde viral vektörlerin geniş ve etkili uygulanması için önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Öte yandan, onların etkileyici ifade desen rağmen, çıplak plazmid DNA teslim düşük transfksiyon verimliliği görüntüler, mRNA transferi RNase tarafından bozulmaya yüksek immünjenite ve duyarlılık sunarken4.
mRNA alanında kapsamlı bir araştırma ile, modRNA gelenekselvektörler5 üzerinde sayısız avantajları nedeniyle kalp ve çeşitli diğer organlara genlerin teslimi için cazip bir araç haline gelmiştir. Doğal olarak meydana gelen psödoürin ile idrar tam değiştirilmesi daha sağlam ve geçici protein ekspresyonu sonuçları, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ve genomik entegrasyon riski minimal indüksiyon ile6. Son zamanlarda kurulan protokoller, sentetik mRNA7'ninstabilitesini ve transability'sini artırarak protein çevirisini daha da artıran optimize edilmiş bir anti-ters kapak analogu (ARCA) kullanmaktadır.
Önceki raporlar çeşitli muhabir veya fonksiyonel genlerin ifade göstermiştir mi sonra kemirgen miyokardinde modRNA tarafından teslim. ModRNA uygulamaları ile, kardiyomiyositler ve nonkardiyomiyositler de dahil olmak üzere miyokardiyumun önemli alanları, anjiyogenez9,10,kardiyak hücre sağkalım11ve kardiyomiyosit proliferasyonu12neden olmak için başarıyla post-kardiyak yaralanma8 transfected edilmiştir. Mutasyona uğramış insan follistatin benzeri 1 için kodlanmış modRNA tek bir uygulama fare yetişkin CMs çoğalmasını indükler ve önemli ölçüde kardiyak fonksiyonu artırır, skar boyutunu azaltır, ve kılcal damar yoğunluğunu artırır 4 hafta post-MI12. Daha yeni bir çalışmada bir domuz modeli nde VEGFA modRNA uygulaması ile MI sonra geliştirilmiş kardiyak fonksiyon bildirdi10.
Bu nedenle, kardiyak alanda modRNA artan popülaritesi ile, geliştirmek ve kalp sonrası MI modRNA teslimi için bir protokol optimize etmek esastır. Burada herhangi bir bağışıklık yanıtı uyarıcı olmadan sağlam, istikrarlı protein ifadesi sağlayan bir biyouyumlu sitrat-salin formülasyonu saf ve optimize modRNA hazırlanması ve teslim açıklayan bir protokoldür. Bu protokol ve videoda gösterilen yöntem, sol anterior inen arterin (LAD) kalıcı ligasyonu ile fare MI'nin standart cerrahi işlemini ve ardından üç adet modRNA intrakardiyak enjeksiyonunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, modRNA uygulamasını kardiyak gen tedavisi için yaygın olarak erişilebilir hale getirmek için minnet miyokardiyumuna modRNA teslimatının son derece doğru ve tekrarlanabilir bir yöntemini açıkça tanımlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Mount Sinai Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi'nde Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.
1. modRNA sentezi
NOT: ModRNA sentezinin ayrıntıları Kondrat ve ark.13'tebulunabilir.
- Plazmid şablonlarını(Malzeme Tablosu)sipariş edin ve mRNA şablonu olarak kullanmak üzere temiz bir PCR ürünü oluşturun.
- Aşağıdakiözelleştirilmiş ribonükleoside karışımı ile transkripsiyon in vitro ile modRNA'ları hazırlayın (Malzeme Tablosu): T7 transkripsiyon kiti, 6 mM anti-ters kapak analogu (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanozin trifosfat, 75 mM adenozin trifosfat, 75 mM sitidin trifosfat, 100 mM psödoürin-5-trifosfat ve T7 DNase enzimi.
- Bir transkripsiyon temizleme kiti(Malzeme Tablosu)ile adım 1.2 yapılan modRNA arındırın ve antarktika fosfataz ile tedavi. Daha sonra, transkripsiyon temizleme kiti ile modRNA repurify ve bir spektrofotometre kullanarak ölçmek.
- ModRNA'yı 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA'da etanol ve amonyum asetat ile çökeltin ve resuspend.
- Santrifüj filtreler ile in vivo teslimat için modRNA konsantre ve otomatik bir elektroforez platformu(Tablo Malzemeler)kullanarak kalite ölçmek.
2. In vivo doğum için modRNA enjeksiyonu hazırlanması
- 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA enjeksiyonu için gereken hacmi modRNA konsantrasyonuna göre hesaplayın.
- ModRNA'nın hesaplanan hacmini çekirdeksiz suda hazırlanan eşit parçadaki sakaroz çözeltisi (0,3 g/mL) ve 0,1 M sitrat çözeltisi (pH = 7) (her biri önerilen 20 μL) ile karıştırın.
- Enjeksiyonun son hacmini tuzlu çözelti ekleyerek 60 μL'ye getirin.
3. Miyokard enfarktüsü cerrahisi
- Anestezi ve hayvanın hazırlanması
NOT: Bu çalışmada 8−12 haftalık erkek ve dişi CFW fareler kullanBilen.- Bir indüksiyon odası kullanarak% 2 izofluran ile fare anestezi ve anestezi tutmak için burun ve ağız üzerinde bir yüz maskesi ile sırt üstü hayvan yerleştirin. 7−8 mm hava yolu tüpü ve filtre ile donatılmış bir solunum cihazı kullanarak mekanik ventilasyon ile anesteziyi koruyun.
- Fareyi ameliyat platformunda hareketsiz hale getirmek için, kol ve bacaklarını cerrahi bantla sabitleyin. boyun bölgesini ve göğüs kafesinin sol tarafını tıraş edin ve %70 etanol ve povison iyot kullanarak dezenfekte edin. Dezenfekte adımını iki kez tekrarlayın. Anestezi nin derinliğini değerlendirmek için kuyruk ve arka ayakları çimdikleme, refleksleri kontrol edin.
- Normothermia 'da (37.5−38 °C) çekirdek vücut sıcaklığını sürekli olarak izleyin ve koruyun.
- İntratrakeal entübasyon gerçekleştirerek açık hava yolunu koruyun. Bunu yapmak için fareyi, ağzı deneyciye bakacak şekilde ventral bir konuma yerleştirin ve dili yavaşça çekin. Boyun açısını ayarlayın ve entübasyon yolunu düzleştirmek ve entübasyon kanülitine itin.
- Hayvanın içinden nefes alamaması durumunda trakeostomi yapılabilir. Bir mikroskop kullanarak trakea özetleyen deri, kas ve doku izole orta hat boyunca bir servikal kesi gerçekleştirin. Trakea açıkça görülebildiğinde, küçük bir delik açarak ve mikrocerrahi forceps kullanarak trakeanın kranial kısmını tutarak glottisin altındaki iki kartuş halkası arasındaki dokuya endotrakeal tüpü yerleştirin.
- Her iki akciğerin de oksijen aldığını doğrulamak için farenin torasik hareketini gözlemleyin. Solunum hızı (RR) dakikada yaklaşık 120 nefes, 17−18 cm H2O inspiratuar basınç ile olmalıdır.
- Sol anterior inen (LAD) arter ligasyonu
- LAD ligasyonunu gerçekleştirmek için fareyi dikkatlice çevirin, böylece sağ tarafında durun. Cildi kaldırın ve 3 ve 4 kaburga arasında sol taraflı torakotomi yapmak ve dikkatle doku ve kas incelemek. Kanamayı önlemek için bir cautery kullanın.
- Thorax dikkatle açın ve bir kez açık, herhangi bir keskin nesne ile akciğer dokunmadan, kalp bulmak. Torasik boşluğu açık tutmak ve kalbi net bir şekilde görmek için retraktörleri kesiye yerleştirin. Şimdi kesi kenarına akciğerleri hareket ettirin ve kalbin ön yüzeyine erişmek için kalbi kaplayan perikardiyal kese parçası çıkarın.
- Dikkatle lad tanımlamak, pulmoner arter ve sol auricle arasında bulunan derin ışık kırmızı damar olarak görülebilir. 7-0 ipek dikiş tek bir dikiş ile LAD proksimal ligate. 4 ve 5 kaburga arasında bir göğüs tüpü (28 G, venal kateter) yerleştirin.
- Torasik kesiyi katmanlar halinde kapatın. Kaburga adapte ve cilt kapatmak için 5-0 ipek çalışan dikişler kullanmak için 6-0 ipek çalışan dikişler kullanın. Gelecekteki ekokardiyografik ölçüm için uygun bir pencere bıraktığından emin olun.
- 2 mL şırınga kullanarak toraksı ılık izotonik solüsyonla (1 L suda 9 g sodyum klorür) dikkatlice boşaltın. Fareyi sırtına yerleştirin. Trakeostomi yapıyorsanız, endotrakeal tüpü dışarı alın ve 7-0 ipek dikişler kullanarak tek bir dikiş ile trakeal kartuş halkaları adapte. Fare nin üzerine yüz maskesi yerleştirin ve 5-0 ipek çalışan dikişler kullanarak cildi kapatın.
- Kurtarma aşaması için entübasyon kanüllerini ventilatörden kesin ve spontan solunuma izin verin. Hayvanı, bilinçliliğe erişene kadar ısı lambasının altına yerleştirin. Tamamen uyanık olana kadar hayvanı ameliyattan sonra başıboş bırakmayın.
- 0.1 mg/kg vücut ağırlığında buprenophine ile ağrı tedavisi yönetin, 12 saat aralıklarla önümüzdeki 3 gün boyunca deri altı enjekte.
4. ModRNA kardiyak doğum
- Mi'den sonra insülin şırıngası (31 G) kullanarak 2.3 adımda hazırlanan modRNA'nın toplam 60 μL'sini insülin şırıngası (31 G) ile türün.
- Enfarkt alanı çevreleyen kalp kasının üç farklı yerinde modRNA 20 μL enjekte (ligasyon her iki tarafında iki ve apeks bir). Göğüs kapatmadan önce, LAD hemen sonra enjeksiyonları gerçekleştirin.
NOT: ModRNA enjeksiyon bölgelerinin temsili görüntüleri Şekil 1'degörülebilir.
- Enfarkt alanı çevreleyen kalp kasının üç farklı yerinde modRNA 20 μL enjekte (ligasyon her iki tarafında iki ve apeks bir). Göğüs kapatmadan önce, LAD hemen sonra enjeksiyonları gerçekleştirin.
5. Kalp sonrası MI protein ifade doğrulaması
- Biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak Luciferase modRNA ekspresyonu
NOT: Sakaroz sitrat tamponunun 60 μL'sinde hazırlanan toplam 100 μg Luc mRNA MI'den sonra CFW farelerin kalbine doğrudan enjekte edilir.- 24 saat mi sonrası ve modRNA enjeksiyon, bir indüksiyon odası kullanarak% 2 isofluran ile fareler anestezi ve intraperitoneally luciferin enjekte (150 mg / g vücut ağırlığı) in vivo Luc sinyalini doğrulamak için.
- Luc sinyali doygunluğa ulaşana kadar her 2 dakikada bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanan fareleri görüntüleyin.
- Toplanan görüntüleme verilerini görüntüleme analiz yazılımı ile ölçün. Sadece Luc ifadesi için temel okuma olarak tuzlu su enjekte fareler kullanın ve tuzlu enjekte fareler toplanan arka plan sinyali çıkarmak.
NOT: Luc sinyali p/s/cm2/sr x 106olarak ifade edilir.
- Cre transfeksiyon doğrulaması için immünoboyama
- Cre ile transfeksiyonu doğrulamak için, 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon uyarak 24 saat postenjeksiyon sonrası hayvanları kurban edin ve ardından servikal çıkığı takip edin. Bir kesi yapmadan önce, % 70 alkol bezi kullanarak göğüs ve karın dezenfekte.
- Göğüs kafesinden ~1 cm daha aşağıda enine bir kesi yaparak göğüs boşluğunu açın ve makası kafaya doğru hareket ettirin ve göğüs kafesini kesin.
- Göğsü açın ve fazla kanı çıkarmak için sağ ventrikül odasına 1 mL steril PBS enjekte edin. Kalbi hemen boşaltın ve kalan kanı temizlemek için steril PBS'ye yerleştirin.
- Kalbi 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile düzeltin ve ardından 4 °C'de %30 sakaroz çözeltisinde gece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün kalpleri optimum kesme sıcaklığına yerleştirin ve bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında kesin.
- Kardiyak troponin I (cTNI) karşı primer antikor ile kesitleri lekeleyin ve floresan sekonder antikor ile etiketleyin. Çekirdeği tanımlamak için, 5 dk. Floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüle 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile leke.
6. İstatistiksel analiz
- Tuzlu ve Luc enjekte edilmiş farelerdeki Luc ifadesine dayalı bir çubuk grafiği çizin ve değerleri ortalama ± SEM olarak bildirin. İki grubu eşleşmemiş bir t-testi (****p < 0,0001) kullanarak karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sekiz ila on haftalık fareler isoflurane ile anestezi ve entübe edildi. Hayvan anestezi altında kaldıktan sonra sol torasik bölge tıraş edildi ve etanol ile sterilize edildi ve kalp LAD ligasyonu için maruz kaldı. Sol koroner arter sıkıca arter altında dikiş düğümleme tarafından tıkanmış oldu (diyagram gösterimi Şekil 1A). Başarılı bir enfarktüsten sonra (sol ventrikül serbest duvarının paling ile gösterilir), sakaroz sitrat tamponunda çözünmüş 100 μg Luc veya Cre modRNA doğrudan enjeksiyonu doğrudan insülin şırıngası kullanılarak yaralanma bölgesini çevreleyen üç farklı bölgede(Şekil 1B)doğrudan miyokardiyuma teslim edildi. ModRNA enjeksiyonları ile MI işlemi hayvan başına 30−45 dk sürdü. Hayvanlarda yaklaşık %90 sağkalım oranı prosedür sonrası saptamıştır. İşlemden sonra, göğüs ve deri sıkıca katmanlar halinde dikildi ve hayvan normal nefes başlar başlamaz havalandırma kaldırıldı.
LAD ligasyonu ve Luc modRNA enjeksiyonunun sonraki teslimatını yaptıktan sonra, Luc protein ekspresyonunu kontrol ederek Luc modRNA transfeksiyonunu doğruladık 24 saat postenjeksiyon sonrası bir biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanarak(Şekil 2A). Önceki yayınlarda protein ekspresyonunun 6 posttransfeksiyon gününe kadar görülebilse de, modRNA'nın en yüksek transfeksiyon veriminin 24 saat8'degözlendiğini ortaya çıkarmıştız. Benzer şekilde, MI(3.0 x 105)(Şekil 2B)sonrası sakaroz sitrat tamponu enjekte edilen farelere kıyasla Luc modRNA enjeksiyonu (1.76 x 108)ile tedavi edilen kalpteki Luc sinyalini başarıyla tespit ettik.
Ayrıca, bir transgenik Rosa26mTmG fare onun çeviri ve biyodağıtım kontrol ederek modRNA ifade doğrulamak için çalıştı. Bu fare modeli sistemi tüm vücut hücrelerinde/dokularda hücre zarı lokalize tdTomato (mT) floresan ekspresyonunu ve Cre rekombinasyon üzerine hücre zarı lokalize EGFP (mG) floresan ekspresyonundaki değişiklikleri ifade eder. Böylece, Cre modRNA ekspresyonunu gözlemlemek için, 100 μg Cre modRNA Rosa26mTmG erkek ve dişi farelerde miyokard post-MI içine doğrudan enjekte edildi ve hayvanlar 24 saat ameliyat sonrası kurban edildi. Kalpler kardiyomiyosit marker cTNI ve nükleer marker DAPI ile immünboyama için sabit ve işlenmiş(Şekil 3A). Başarılı Cre ekspresyonu, fareye teslim edilen Cre modRNA ile rekombinasyon sonucu olan yeşil renkli hücrelerin(Şekil 3B)görünümü nden dolayı belirgindi, Cre enjeksiyon bölgesi etrafında TDTomato renginin EGFP'ye değiştirilmesi ile temsil edilir (Şekil 3C).
Şekil 1: LAD ligasyonu ve modRNA kardiyak doğum. (A) LAD ligasyon alanını ve modRNA enjeksiyonu üç bölgegösteren şematik diyagram. (B) Tüm fare kalp temsilcisi görüntüleri kalıcı ligasyon tarafından indüklenen başarılı bir MI sonrası (a) ve MI aşağıdaki modRNA enjeksiyon siteleri. 60 μL sakaroz sitrat tamponu içinde çözünmüş modRNA'nın 100 μg'si enfarktüsçevreleyen sınır bölgesi bölgesinde, iki tanesi ligasyonun her iki tarafında(b,c) ve bir tanesi de tepedeteslimedilmiştir . Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Luc ekspresyonu analizi modRNA enjeksiyonu sonrası. 100 g Luc modRNA içeren sakaroz sitrat tamponu açık göğüs cerrahisinde CFW farelerinin miyokardiyumuna doğrudan enjekte edildi. Biyolüminesans görüntüleme sistemi enjeksiyondan 24 saat sonra Luc protein ekspresyonunu hesaplamak için kullanıldı. (A) Kontrol farelerinin karşılaştırmalı biyolüminesans görüntüleri (sadece tampon ile transfected) ve Luc modRNA enjekte edilen fareler. (B) Luc sinyalinin biyolüminesans görüntüleyici kullanılarak 24 saat sonra ölçülen kontrol fareleriyle karşılaştırıldığında nicelleştirilmesi. Hata çubuğu p < 0.0001 ile SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: In vivo Cre ifadesinin doğrulanması. Rosa26mTmG farede Cre modRNA ekspresyonunu doğrulayan transfected kalp kesitlerinin (kısa eksengörünümü) temsili görüntüleri enjeksiyon sonrası 24 saat. (A) Kardiyomiyositler immünosüle cTNI (kırmızı). (B) Yeşil renkli hücreler Cre transfected hücreleri temsil eder. (C) Cre iki enjeksiyon etrafında aktif hücreleri gösteren birleştirilmiş görüntü. Mavi nükleer leke DAPI olduğunu. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen tedavisi önemli ölçüde kalp hastalığının tedavisi ilerlemek için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, HF tedavisi için ilk klinik çalışmalarda kullanılan geleneksel araçlar sınırlı başarı göstermiştir ve ciddi yan etkileri ile ilişkilidir. Modifiye RNA sürekli kalpte bir gen transfer aracı olarak popülerlik kazanıyor bir nonviral gen teslim sunuyor. ModRNA çeviri için genlerin hiçbir nükleer lokalizasyon gerektirir, ve böylece protein verimli ve hızlı bir ifade sunuyor. Ayrıca, mRNA genom konak entegre olmadığı gibi, modRNA ile gen iletimi mutagenez riskini atlar. Sonuç olarak, geleneksel gen dağıtım araçlarına göre avantajları sayesinde, modRNA kalbe tek gen veya gen kombinasyonları teslim için en cazip platformlarından biri haline gelmiştir. Ancak, modRNA'nın kalp sonrası yaralanmaya hazırlanması ve transferi için standart bir protokol bulunmamaktadır. Böylece burada amaç, modRNA'nın gen tedavisi aracı olarak kullanımını iyileştirmek ve tedavi amaçlı uygun hale getirmek için kemirgen kalpte modRNA'nın intrakardiyak teslimi için standart ve optimize edilmiş bir protokol oluşturmaktı.
Bu protokolde modRNA, idrarın psödoüri ile değiştirilmesi ve ardından 5' sonunda ARCA ile kaplanması ile hazırlanır. mRNA'nın sekonder yapısındaki bu değişikliklerin, diğer nükleotit modifikasyonlarına göre daha yüksek protein çevirisi gösterdiği gösterilmiştir8. Ayrıca, bu değiştirilmiş mRNA yapısı, farelerde IM enjeksiyonları sonrası, geçiş ücreti benzeri reseptörler ve nükleazlar tarafından tanınmasını sınırlandırarak immünojeniteden kaçarak6. Burada, sakaroz sitrat tampon ile çıplak mRNA teslim bir fare MI modeli kullanarak kalpgüçlü protein çevirisi üretir gösterdi. Daha önceki çalışmalarımızda, in vivo fectamin veya in vivo jetPEI gibi nano taneciklerde modRNA kapsülleme ile karşılaştırıldığında kalpte sakaroz sitrat tampon uğrama modRNA üstünlüğünü kurduk, hangi protein içine modRNA çeviri engelleyebilir8. Tek iplikli modRNA kümelenme kurtarma ek olarak endositoz için sakaroz ve ekstra enerji tarafından sağlanan rna yüksek korunması sakaroz sitrat tampon teslim modRNA çeviri belirgin artış nedeni olabilir.
Son on yılda10,14, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda modRNA kullanımı artmıştır rağmen, bazı alanlarda klinikte modRNA daha iyi başarısı için araştırılması gerekir. İlk olarak, terapötik araştırmalar için gerekli yüksek miktarlarda modRNA sentezleme maliyet-engelleyici olabilir. Bu nedenle, insanlarda klinik RNA tedavi aşamasına doğru alan taşımak için klinik dereceli ve uygun maliyetli modRNA geliştirmek esastır. İkinci olarak, modRNA için klinik olarak uygulanabilir bir doğum yöntemi tanımlanmalıdır. Kardiyak IM enjeksiyonlarının neden olduğu hasar göz önüne alındığında, daha az invaziv kateter bazlı doğum yöntemleri büyük kalpleri niçin gerekli olan modRNA'nın büyük miktarda aktarılmasında daha akla yatkın olabilir.
Sonuç olarak, bu çalışma fare kalp sonrası MI psödouridine değişiklikler içeren RNA başarılı teslim gösterdi. Sakaroz sitrat tamponunda modRNA'nın verilmesi enjeksiyondan 24 saat sonra güçlü bir protein ekspresyonu ortaya çıkmıştır. Bu protokol, araştırmacıların kalp sonrası yaralanmasında standart doğum ve protein değerlendirmesini takip etmelerini ve böylece modRNA'nın hazırlanması nda ve sunumunda daha fazla erişilebilirlik sağlamalarını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ann Anu Kurian'ı bu el yazmasına yardımlarından dolayı kabul ediyorlar. Bu çalışma Zangi laboratuvarına verilen kardiyoloji başlangıç hibesi ve ayrıca NIH hibe R01 HL142768-01 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
