Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af multikomponent lipid nanorør netværk ved hjælp af Glidende Kinesin Motility Assay

Published: July 26, 2021 doi: 10.3791/60899
Automatic Translation
1, 1
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

Summary

Denne protokol beskriver en proces til fremstilling af lipid nanorør netværk ved hjælp af glidende kinesin motilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesikler.

Abstract

Lipid nanorør (LNT) netværk repræsenterer et in vitro model system til undersøgelse af molekylær transport og lipid biofysik med relevans for de allestedsnærværende lipid tubuli findes i eukaryote celler. Imidlertid er in vivo LNT'er meget ikke-ligevægtsstrukturer, der kræver kemisk energi og molekylære motorer, der skal samles, vedligeholdes og omorganiseres. Desuden er sammensætningen af in vivo LNT'er kompleks og består af flere forskellige lipidarter. Typiske metoder til ekstrudering af LNT'er er både tids- og arbejdskrævende, og de kræver optisk pincet, mikroperler og mikropipetter for med magt at trække nanorør fra gigantiske lipidvesikler. Præsenteret her er en protokol til glidende motilitetsassay (GMA), hvor store LNT-netværk hurtigt genereres fra gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) ved hjælp af kinesindrevet mikrotubululmotilitet. Ved hjælp af denne metode dannes LNT-netværk fra en bred vifte af lipidformuleringer, der efterligner kompleksiteten af biologiske LNT'er, hvilket gør dem mere og mere nyttige til in vitro-undersøgelser af lipidbiofysik og membranassocieret transport. Derudover er denne metode i stand til pålideligt at producere LNT-netværk på kort tid (<30 min) ved hjælp af almindeligt anvendt laboratorieudstyr. LNT-netværkskarakteristika såsom længde, bredde og lipidpartitionering kan også indstilles ved at ændre lipidsammensætningen af guv'erne, der bruges til fremstilling af netværkene.

Introduction

Fremstillingen af lipid nanorør (LNT) netværk er af stigende interesse for in vitro undersøgelse af ikke-ligevægt lipidstrukturer 1,2,3. Celler bruger lipidtubuli til diffus transport af proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle-kommunikation 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparat er særligt interessante, da disse membranbundne organeller er de primære steder for lipid- og proteinsyntese samt transport af disse integrerede biomolekyler i cytoplasmaet i en celle 8,9. Membranerne i disse organeller består af flere lipidarter, herunder sphingolipider, kolesterol og fosfolipider10, der i sidste ende hjælper med at definere deres funktionalitet. For nærmere at replikere og studere disse organeller skal in vitro LNT'er fremstilles af vesikler med stadig mere komplekse lipidformuleringer11.

Gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) anvendes gennemgribende til undersøgelse af lipidmembranadfærd, fordi de pålideligt kan syntetiseres med komplekse formuleringer, der inkluderer kolesterol, phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS) og phosphatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode til fremstilling af LNT'er fra GUV'er med varierende lipidformuleringer ved hjælp af glidemotilitetsassay (GMA), hvor LNT'er ekstruderes baseret på det arbejde, der udføres af kinesinmotorer og mikrotubulilofilamenter, der virker på GUV'er. I dette system adsorberes kinesinmotoriske proteiner til en overflade fremdrive biotinylerede mikrotubuli og omdanner kemisk energi fra hydrolysen af ATP til nyttigt arbejde (specifikt ekstrudering af LNT'er fra biotinylerede vesikler)11. Det resulterende LNT-netværk giver en modelplatform til at studere virkningerne af forskellene i lipidfaser på ændringer i LNT-morfologi.

Kort fortalt indføres kinesinmotoriske proteiner i et flowkammer i en opløsning indeholdende kasein, hvilket muliggør adsorption af motorerne på kammerets glasoverflade. Dernæst strømmer biotinylerede mikrotubuli i en opløsning indeholdende ATP gennem kammeret og får lov til at binde til kinesinmotorerne og begynde motilitet. En streptavidinopløsning indføres derefter i kammeret og får lov til at binde ikke-kovalent til mikrotubuli. Endelig indføres GUV'er indeholdende et biotinyleret lipid i kammeret og binder til de streptavidinbelagte mikrotubuli og ekstruderer derefter LNT'er for at danne store netværk i løbet af 15-30 minutter. Denne metode producerer store, forgrenede LNT-netværk ved hjælp af standard laboratorieudstyr og reagenser til en lav pris11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af lagermikrotubululeopløsninger

FORSIGTIG: Sikkerhedsbriller, handsker og en kittel skal altid bæres under hele protokollen.

  1. 5x BRB80-bufferen klargøres: Der tilsættes 24,19 g RØR (piperazin-N,N′-bis[2-ethanesulfonsyre]) og 0,38 g EGTA (ethylenglycol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre) til en 1 L glasflaske. Tilsæt 1 ml 1 M MgCl2 og juster pH til 6,9 med KOH. Tilsæt deioniseret vand for at bringe opløsningen til et slutvolumen på 500 ml.
  2. Forbered 100 mM lager af GTP-opløsning: veje 52 mg GTP og suspendere i 1 ml destilleret vand. 100 mM opløsning opdeles i 20 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C.
  3. Forbered GPEM-opløsning: Bland 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-opløsning, 100 μL 100% glycerol og 600 μL deioniseret vand. GPEM-opløsningen opdeles i 100 μL alikvoter og opbevares i -20 °C.
  4. Forbered mikrotubulusopløsning ved at rekonstituere hætteglas med kommercielt tilgængeligt, frysetørret tubulin (et hætteglas hver af biotinyleret, fluorescerende mærket og umærket) i kold (4 ° C) GPEM-opløsning til en lagerkoncentration på 5 mg / ml.
  5. Udfør mikrotubulpolymerisation ved at blande 4 μL biotinyleret tubulin, 4 μL fluorescerende mærket tubulin og 24 μL umærket tubulin (alle ved 5 mg / ml koncentrationer) for at skabe et forhold på 1: 1: 6 ved et endeligt volumen på 32 ml. Hold det på is. Tubulinblandingen opdeles i 2 μL alikvoter og opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Effektiv polymerisation kræver, at koncentrationen af tubulin er lig med eller over den kritiske koncentration (5 mg/ml)14. Her optimeres udvælgelsen af tubulinforholdet til en tilstrækkelig koncentration af biotinyleret tubulin til effektivt at binde streptavidin og GUV'er samt en tilstrækkelig koncentration af fluorescerende tubulin til mikroskopisk karakterisering.

2. Forberedelse af gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er)

  1. Forberedelse af Agarose-film
    BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra Greene et al.15.
    1. Der fremstilles en 1% w/v opløsning ved at blande 1 g agarose i 100 ml deioniseret vand i 250 ml Erlenmeyer kolbe. Brug en standard mikrobølgeovn til at opvarme agaroseopløsningen i 1-2 min.
      BEMÆRK: Opløsningen bliver gennemskinnelig, når agarosen er helt opløst. Opløsningen afkøles til 65-75 °C før brug.
    2. Brug en skåret 1.000 μL pipettespids til at pipettere 300-400 μL agaroseopløsning på en 25 mm x 25 mm glasovertrækslip. Mens du holder kanten af dækslippen med behandskede fingre, skal du bruge en anden 1.000 μL pipettespids til at sprede den smeltede agarose jævnt over dækslippen.
      BEMÆRK: Vedligeholdelse af agarosen ved 65-75 °C giver mulighed for effektiv spredning på dækslens overflade.
    3. De agarosebelagte dæksler tørres i en 37 °C inkubator i mindst 2 timer, hvorefter agarosen bliver gennemsigtig. Opbevar dækslipsene ved at placere den agarosebelagte overflade opad på en ren overflade, såsom fnugfrit papir eller voksbaseret film ved stuetemperatur (RT).
  2. Lipid formulering
    1. Hent lipider opløst i chloroform fra en -20 °C fryser og læg dem i en kemisk røghætte, indtil de når RT.
    2. Beregn mængden af lipidbestand af hver komponent lipid, der er nødvendig til formuleringen ved hjælp af følgende formel:
      Equation 1
      Hvor: Vlipid er volumenet af lipid, der skal anvendes, mol % er den molære procentdel af lipidkomponenten, n er det samlede antal mol lipid, der anvendes i formuleringen, og M er koncentrationen af lipid i molære enheder.
      BEMÆRK: Hvis der f.eks. anvendes en formulering indeholdende 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) med en stamopløsningskoncentration på 12,72 mM og 1 mikromol total lipider i formuleringen, vil mængden af DOPC-lager, der anvendes i formuleringen, være:
      Equation 2
    3. Bland lipiderne sammen ved det beregnede forhold i et hætteglas i den kemiske røghætte.
    4. 30 μL lipidopløsning pipetteres på de agarosebelagte dæksler på en forvarmet kogeplade, der er anbragt over smeltepunktet for formuleringens mættede lipidkomponent (f.eks. 50 °C kogeplade for et lipid med Tm på 40 °C).
    5. Spred opløsningen over agarosefilmen i en cirkulær bevægelse ved hjælp af den lange kant af en 18 G nål til, indtil chloroformen er fordampet, og der er dannet et ensartet lag af lipid. Hold kanten af dækslippen med behandskede fingre, mens du udfører dette trin.
      BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige agaroselaget med nålen.
    6. Anbring dækslen med agaroselag og lipidfilm i en aluminiumsfoliedækket petriskål, filmsiden opad, og læg petriskålen i en vakuumsikkator i mindst 2 timer for at fjerne resterende opløsningsmiddel.
  3. I mellemtiden fremstilles 560 mM saccharoseopløsning ved at blande 1,92 g saccharose med 10 ml deioniseret vand.
    BEMÆRK: Koncentrationen af saccharoseopløsningen afhænger af osmolariteten af bufferen GUV'er fortyndes i. Typisk bør saccharoseopløsningens osmolaritet ikke være mere end 10% større end den buffer, guv'erne fortyndes i, specifikt motilitetsbufferen (se trin 3.11).
  4. GUV dannelse
    1. Klæbe et klæbekammer til dækslippen belagt med lipidfilmen ved forsigtigt at trykke klæbekammeret på den lipidbelagte dækslip med lipidfilmen opad, hvilket sikrer, at der dannes en tæt tætning.
    2. Der tilsættes 400 μL 560 mM saccharoseopløsning (fremstillet i trin 2.3) til kammeret.
    3. Placer dækslen i fugtighedskammeret og luk låget.
    4. Anbring fugtighedskammeret på en forvarmet kogeplade, der er anbragt over smeltepunktet for formuleringens mættede lipidkomponent.
    5. Lad vesikler danne sig i ≥1 time før genopretning.
      BEMÆRK: Vesikeldannelse kan kontrolleres med fluorescensmikroskopi med en 40x luftmålslinse.

3. Forberedelse af motilitetsassaylagre og reagenser

  1. Fremstilling af kaseinbestand
    1. Der tilsættes 3 g tørt kasein til et 50 ml konisk centrifugerør, derefter tilsættes 30 ml 1x BRB80 og roteres, indtil opløsningen bliver tyktflydende. Centrifuger røret ved 15.000 x g i 30 min.
    2. Supernatanten overføres til et andet 50 ml konisk centrifugerør, og pelleten kasseres. Opløsningen filtreres gennem et 1 μm sprøjtefilter, og opløsningen opsamles i et 50 ml konisk hætteglas. Opløsningen filtreres gennem et 0,2 μm filter, og opløsningen opsamles i et 50 ml konisk hætteglas.
    3. Bestem proteinkoncentrationen ved at måle absorbansen ved 280 nm ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer og kvartskuvette.
    4. Kaseinkoncentrationen i mg/ml beregnes ved hjælp af følgende formel:
      Equation 3
    5. Opløsningen fortyndes til 20 mg/ml i 1x BRB80, opdeles i 100 μL alikvoter, og der opbevares -20 °C.
  2. Der fremstilles stamopløsning af glucoseoxidase (2 mg/ml) ved at blande 2 mg glucoseoxidase med 1 ml 1x BRB80. Opdel i 100 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
  3. Der fremstilles stamopløsning af katalase (0,8 mg/ml) ved at blande 0,8 mg katalase med 1 ml 1x BRB80. Opdel i 100 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
  4. Forbered 2 M glucoseopløsning ved at suspendere 0,3 g D-glucose i 1 ml deioniseret vand. Opdel i 100 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
  5. Forbered 100 mM DTT-lager ved at suspendere 0,015 g DTT i 1 ml deioniseret vand. Opdel i 100 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
  6. 100 mM Mg-ATP-lager fremstilles ved at suspendere 0,055 g dinatrium-ATP i 1 ml opløsning af 100 mM MgCl2. Opdel i 100 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
  7. Der fremstilles 100 mM Mg-AMP-PNP-opløsning ved at suspendere 0,055 g AMP-PNP i en 1 ml opløsning af 100 mM MgCl2, derefter opdeles i 100 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C.
  8. 100 mM Trolox-opløsning fremstilles ved tilsætning af 25,03 mg Trolox til 1 ml methanol og opbevares ved -20 °C.
  9. Der fremstilles 10 mg/ml streptavidinopløsning ved tilsætning af 1 mg streptavidin til 100 μL BRB80, opdeles derefter i 2 μL alikvoter og opbevares ved -80 °C.
  10. Brb90CAT fremstilles ved at blande 200 μL 5x BRB80, 20 μL kaseinopløsning, 10 μL MgATP-opløsning, 10 μL Trolox, 5 μL paclitaxelopløsning og 765 μL DI-vand. Opbevares ved 4 °C.
  11. Motilitetsopløsningen fremstilles ved at blande 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glucoseopløsning, 2 μL glucoseoxidaseopløsning, 2 μL DTT-opløsning og 2 μL katalaseopløsning. Opbevares ved 4 °C.
  12. Der fremstilles en 1 μM kinesinopløsning ved fortynding af stamkinesinopløsningen i BRB80CAT (f.eks. 2 μL 50 mM kinesinopløsning i 98 μL BRB80CAT) og opbevares ved 4 °C.
  13. Der fremstilles en 10 μg/ml mikrotubulusopløsning ved fortynding af 10 μL stabiliserede mikrotubuli i 90 μL stuetemperatur BRB80CAT. Opbevares hos RT.
  14. Der fremstilles en 10 μg/ml streptavidinopløsning ved tilsætning af 0,1 μL 10 mg/ml streptavidinopløsning i 99,9 μL motilitetsopløsning. Opbevares ved 4 °C.
  15. Der fremstilles en 12x GUV-opløsning ved fortynding af 5 μL GUV-lager til 55 μL motilitetsopløsning. Opbevares ved 4 °C.
  16. Polymerisation af tubulin i mikrotubuli
    1. Et tidligere tilberedt 2 μL aliquot tubulin opsamles fra -80 °C fryseren (tilberedt i trin 1.5) og anbringes i et 37 °C vandbad i 30 minutter.
    2. Der fremstilles en 2 mM paclitaxelopløsning ved tilsætning af 1,71 mg paclitaxel i 1 ml vandfri DMSO, opdeles i 10 μL alikvoter og opbevares ved -20 °C.
    3. Frisk tilbered BRB80T ved at blande 99,5 μL 1x BRB80 med 0,5 μL 2 mM paclitaxel.  Varm 100 μL BRB80T til 37 °C i vandbadet.
    4. Efter 30 minutter tilsættes 100 μL BRB80T til tubulinalquotet for at stabilisere mikrotubuli. Opbevares hos RT.

4. Glidende motilitetsassay (GMA)

  1. Forbered et flowkammer ved at fastgøre to strimler dobbeltsidet tape adskilt af 5 mm på et glasglas. Gentag denne proces, indtil tre lag tape udgør hver strimmel.
  2. Placer en dækslip oven på tapen, og tryk derefter forsigtigt ned på dækslip/tape-grænsefladen med en pincet eller pen for at sikre tilstrækkelig vedhæftning.
    BEMÆRK: Kanalen skal være 5 mm i bredden ved 25 mm i længden og 300 mm i højden.
  3. 30 μL 1 mm kinesinopløsning (fremstillet i trin 3.12) pipetteres i flowcellen, og lad den inkubere i 5 minutter.
    BEMÆRK: Kasein danner et dobbeltlag på overfladen af dækslen/ glasglasset og letter fastgørelsen af kinesinhalen til overfladen.
  4. 30 μL 10 μg/ml mikrotubulusopløsning (fremstillet i trin 3.13) pipetteres ind i flowcellen ved hjælp af en laboratorierietiet, der forsigtigt presses mod den modsatte ende af strømningskanalen for at lette udvekslingen af opløsningen. Inkuberes i 5 min.
  5. Flowcellen 1x-3x vaskes med 1x motilitetsopløsning ved RT (fremstillet i trin 3.11).
    BEMÆRK: Fluorescensmikroskopi ved hjælp af et 40x luftmål kan bruges på dette tidspunkt til at bekræfte mikrotubulusfastgørelse og bevægelighed. Mikrotubuli vises som fluorescerende filamenter (snesevis af mikron i længden), der bevæger sig (glider) over overfladen ved ~ 0,5 μm / s (figur 1).
  6. 30 μL 10 μg/ml streptavidinopløsning (fremstillet i trin 3.14) pipetteres ind i flowcellen ved hjælp af en laboratorierieteurt, der forsigtigt presses mod den modsatte ende af strømningskanalen for at lette udvekslingen af opløsningen. Inkuberes i 10 min.
  7. 30 μL 12x GUV-opløsning (fremstillet i trin 3.15) hældes ind i strømmen ved hjælp af en laboratorierestatning, der presses forsigtigt mod den modsatte ende af strømningskanalen for at lette udvekslingen af opløsningen. Inkuberes i 30 min.
  8. Der tilsættes 2 μL 100 mM AMP-PNP-opløsning (fremstillet i trin 3.7) for at standse bevægeligheden, hvorefter kammeret forsegles med fugemasse.

5. Karakterisering af LNT-netværk

  1. Overfør strømningskammeret til et omvendt mikroskop til billeddannelse.
  2. Vælg det passende filtersæt baseret på bølgelængderne af de anvendte fluorescerende lipider eller tubulin. For eksempel, når du bruger Texas Rødmærkede lipider, skal du bruge et 560 nm / 25 nm excitationsfilter og 607 nm / 36 nm emissionsfilter.
  3. Brug et 100x oliemål til at fokusere på overfladen af dækslippen.
  4. Afbild LNT-netværkene ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
    BEMÆRK: LNT'er er lineære strukturer, der ekstruderer fra de større vesikler. LNT'er meget mindre end GUV'er og har svagere fluorescenssignaler. Således skal eksponeringen og kontrasten justeres i overensstemmelse hermed til billed-LNT'er. Disse justeringer fører også til overeksponering af GUV'erne, og det anbefales derfor, at lamellæriteten og faseadskillelsen i GUV'er karakteriseres uafhængigt.
  5. Fokuser mikroskopet på et netværk af interesse og tag et standard- eller flisebelagt billede.
  6. Juster eksponeringstiden og neutrale densitetsfiltre for at afbilde LNT'erne og minimere mættet eksponering af GUV'erne. Få billeder både i røde og grønne kanaler.
    BEMÆRK: Her tillader den røde kanal visualisering af Texas-Red lipider, mens den grønne kanal tillader visualisering af mikrotubuli (f.eks. Oregon Green lipider og HiLyte488 farvestoffer).
  7. Opret et sammensat billede ved at overlejre de røde og grønne kanaler (Figur 1).
  8. Karakterisering af LNT-netværk ved at måle LNT-længde
    1. Åbn de erhvervede billeder ved hjælp af en billedanalysesoftware som ImageJ.
    2. Kalibrer skalaen til mikroskopet ved hjælp af funktionen indstil skala, udfyld pixel til mm-konverteringsfaktoren, og klik på OK.
      BEMÆRK: Konverteringsfaktoren afhænger af mikroskopet, objektivlinsen og kameraet, og den kan opnås ved hjælp af et mikroskopkalibreringsglas. Det udtrykkes generelt i pixels / mm.
    3. Brug multipoint line-værktøjet til at måle længden af nanorørene startende fra den overordnede GUV. Hold Ctrl +M nede for at måle længden.
    4. Fortsæt med at måle længderne på de enkelte rør ved at følge ovenstående trin. Billedbehandlingsværktøjet gemmer hver ny måling i resultatvinduet.
    5. Hold Ctrl + D nede efter at have tegnet hver linje for at holde styr på, hvilke rør der er målt.
  9. Måling af LNT-tykkelse (figur 2)
    1. Åbn billedet i ImageJ, og vælg funktionen Tærskel under fanen Billede .
    2. Klik på Anvend for at anvende tærsklen.
    3. Tegn et rektangel med kendt længde over det ønskede rør (sorte pixels har en værdi på 0, og røde pixels har en værdi på 255).
    4. Mål områdets integrerede tæthed.
    5. Opdel densiteten med længden (i pixels) af LNT for at opnå tykkelsen (i pixels).
      BEMÆRK: Tykkelsesmålingerne kan kun sammenlignes på tværs af billeder, når billeddannelsesindstillingerne og tærsklen er indstillet identisk.
  10. Bestemmelse af lipidpartitionering i knuder af LNT'er (figur 3)
    1. Åbn billedet i ImageJ.
    2. Brug stregværktøjet til at tegne en streg over den ønskede node.
    3. Mål nodeintensiteten i både Oregon Green og Texas Red kanaler.
    4. Flyt linjen til LNT, og mål LNT-intensiteten i både Oregon Green- og Texas Red-kanalerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LNT-netværk (figur 4) blev fremstillet ved hjælp af den beskrevne protokol, som bruger det arbejde, der udføres af kinesintransport af mikrotubuli til at ekstrudere LNT'er fra GUV'er. Kort fortalt blev GUV'er fremstillet under anvendelse af agarosegelrehydrering under anvendelse af saccharoseopløsning, og mikrotubuli blev polymeriseret i GPEM-opløsning og stabiliseret i BRB80T. Dernæst blev kinesinmotorer introduceret i en flowcelle, der dannede et aktivt lag af motorer på overfladen af dækslippen. Mikrotubuli blev derefter introduceret, og en streptavidinopløsning blev tilsat, hvilket lettede bindingen mellem de biotinylerede lipider og GUV'er (som efterfølgende blev introduceret).

Med alle komponenter til stede i flowcellen fik LNT'er lov til at danne sig i 30 minutter, hvorefter AMP-PNP blev introduceret for at stoppe bevægelighed. Derefter blev LNT'erne afbildet under et epifluorescensmikroskop ved hjælp af et 100x oliemål. LNT'er kan være ret store; således kan et lavere drevet mål også bruges til at fange større LNT'er. LNT-netværkene er kendetegnet ved tynde, weblignende fremspring, der strækker sig fra og forbinder GUV'er. Antallet og forgreningen af LNT'erne afhænger af flere faktorer, herunder tætheden af mikrotubuli på overfladen, strøptoviantkoncentrationen og antallet af tilstedeværende GUV'er.

Denne metode kan generere GUV'er og LNT'er sammensat af faste, væskeforordnede og væskeordnede faser samt faseseparerede vesikler, der udviser sameksistensen af disse faser over en lang række forskellige sammensætninger (figur 4). For eksempel resulterer syntetisering af vesikler med 45% mættet lipid og 55% umættet lipid i vesikler, der adskiller sig i sameksisterende flydende forstyrrede og faste faser. Hvis kolesterol er inkluderet, kan væske-væske sameksistens imidlertid observeres. For eksempel vil en blanding bestående af 50% umættede lipider, 30% kolesterol og 20% mættede lipider skabe GUV'er, der adskiller sig i sameksisterende væskeordnede (Lo) og væskeforstyrrede (LD) faser. Inkorporeringen af kolesterol i denne formulering fluidiserer de mættede lipider, hvilket muliggør dannelsen af en flydende fase.

Desuden blev knuder (dvs. runde sfæriske strukturer større end LNT'erne) observeret at danne i de faseseparerede blandinger (figur 4). Opdeling af lipidtyper inden for nanorør og noder kan karakteriseres ved hjælp af linjeprofilværktøjet var at finde den maksimale baggrundstrukne topintensitet af en knude. Linjeprofilerne for noden og LNT blev bestemt, og baggrundsfluorescensen af disse profiler blev trukket fra for at bestemme den maksimale værdi. Partitionering beregnes derefter ved at dividere den maksimale værdi af fluorescensen i noden med den maksimale fluorescensværdi af LNT. Denne tilgang muliggør partitionering af lipider i både LNT såvel som noder, der dannes i de større netværk.

Figure 1
Figur 1: Sammensat billede af LNT'er fremstillet af GUV'er og mikrotubuli. LNT'er ekstruderes fra GUV'er af bevægelige mikrotubuli, der glider oven på kinesinmotorer. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Tærskelproces for at opnå tykkelse. (A) Vælg Tærskel under fanen Billede | Juster . (B) Anvend tærsklen. (C) Tegn et rektangel af kendt længde over det ønskede rør. Sorte pixel har en værdi på 0, og røde pixel har en værdi på 255. (D) Måle områdets integrerede tæthed. For at beregne rørbredden skal du dividere den integrerede densitet med 255 og derefter dividere dette output med længden af det rektangel, der er oprettet i (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af lipidpartitionering i knuder. (A) Åbn billedet i ImageJ, og brug stregværktøjet til at tegne en linje over den ønskede node. (B) Mål nodeintensiteten i Oregon Green-kanalen. (C) Flyt linjen til LNT, og mål intensiteten i Oregon Green-kanalen. (D,E,F) Gentag processen for Texas Red-kanalen. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: LNT'er fremstillet af forskellige GUV-lipidformuleringer. LNT'er ekstruderet fra den væskeforordnede (LD) fase er tynde og lange, mens LNT'er ekstruderet fra den væskeordnede (Lo) fase er korte og tykke. LNT'er af begge typer observeres, når Lo-L D faseseparerede vesikler anvendes i GMA. LNT'er fra flydende-fastfase GUV'er ligner dem, der ekstruderes fra LD GUV'er. Flydende ordnede formuleringer kan oprettes ved anvendelse af en kombination af mættede lipider og kolesterol, mens væskeforstyrrede formuleringer oprettes ved anvendelse af umættede lipider. Skalabjælker = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LNT-netværk er et nyttigt værktøj til in vitro-undersøgelser af membranegenskaber og transport af biomolekyler såsom transmembranproteiner. Desuden muliggør brug af komplekse lipidformuleringer til fremstilling af LNT-netværk mere biologisk relevante undersøgelser. Andre fabrikationsundersøgelser har brugt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellare vesikler eller 2) mere besværlige motilitetsteknikker til fremstilling af netværk fra GUV'er bestående af komplekse lipidformuleringer. Metoden beskrevet her muliggør effektiv fremstilling af store LNT-netværk fra komplekse lipidformuleringer og GUV'er og ved hjælp af billige reagenser og udstyr. Som sådan giver denne metode mulighed for at studere en række biologiske processer, herunder faseseparation og membranproteintransport. Protokollen anvender en in vitro-model, hvor sammensætningen af LNT'erne kan indstilles optimalt til at tilnærme deres biologiske analoger (f.eks. Golgi-apparater).

Dannelsen af LNT-netværk i den her beskrevne metode har mange fordele. For eksempel polymeriseres mikrotubuli let og hurtigt ved anvendelse af frysetørret tubulin, og de forbliver stabile ved RT i mindst 1-2 uger, når de stabiliseres med paclitaxel16. Som sådan implementeres de let for at drive ekstrudering af LNT'er og dannelse af et stort netværk 1,2. Derudover kan GUV'er sammensat af flere lipidkomponenter (dvs. umættede og mættede lipider og kolesterol) hurtigt dannes baseret på en tidligere protokol med små ændringer. Disse modifikationer muliggør syntesen af GUV'erne, der er i stand til at gennemgå den fysiske kemiske proces med membranfaseseparation. Når de er forberedt, kan GUV'er opbevares i uger til måneder afhængigt af opbevaringsforholdene. Det anbefales dog at bruge GUVS i op til 1 måned, før du forbereder en ny batch. Lipidopløsninger kan opbevares ved -20 °C eller -80 °C i flere måneder samt agarosegel og coatede dæksler, som kan opbevares ved RT i flere måneder. Lipidfilmene på de agarosebelagte dæksler skal opbevares under vakuum og rehydreres inden for 48 timer.

En udfordring ved at bruge denne teknik til at danne LNT'er fra GUV'er er at afbalancere koncentrationen af GUV'er, streptavidin og mikrotubuli i flowcellen. For eksempel vil LNT-dannelse være begrænset, hvis forholdet mellem mikrotubuli og GUV'er ikke er korrekt. Hvis koncentrationen af GUV'er er for lav, dannes der ikke aggregater, hvilket er det første trin i LNT-dannelse. For koncentrationerne af mikrotubulus og GUV, der er beskrevet i denne protokol, resulterede en 10x fortynding af mikrotubuluslager og 12x fortynding af GUV-lager generelt i gode LNT-netværk. Fortyndinger på henholdsvis 5x og 6x har også givet gode netværk.

En anden udfordring er at sikre, at GUV-løsningen er osmotisk afbalanceret med mikrotubululeopløsningen. Hvis forskellen i osmolaritet mellem de to opløsninger er for stor, bliver GUV'erne ustabile og potentielt brister. Hvis opløsningerne ikke er osmotisk afbalancerede (f.eks. en forskel på 10 % mellem den målte osmolaritet mellem de to opløsninger), skal der anvendes en koncentreret (f.eks. 2 M) saccharoseopløsning for at øge opløsningens osmolaritet med den lavere målte osmolaritet. En anden begrænsning af dette system er stabiliteten af de resulterende LNT-netværk, som er stabile i størrelsesordenen timer og meget afhængige af, at strømningskammeret kontinuerligt hydreres (eller forsegles kammeret med fugemasse). Når opløsningen er fordampet fra strømningskammeret, vil LNT'erne ikke længere være nyttige, på trods af at tilstedeværelsen af nogle få resterende LNT'er kan fortsætte efter fordampning.

LNT-netværkene skabt af disse glidende mikrotubuli og GUV'er kan være nyttige til at forstå lipid dobbeltlagsdynamik samt protein (f.eks. Transmembranproteiner) diffusion på membranoverflader. Protokollen beskrevet her kan hurtigt skabe LNT-netværk bestående af forskellige lipidformuleringer, der lettere efterligner biologiske LNT-lignende tunnel nanorør samt nanorør, der findes i membranbundne organeller (dvs. endoplasmatisk retikulum og Golgi-apparater). Evnen til at danne store LNT-netværk er et vigtigt første skridt i retning af at studere cellekommunikation, studere nanofluid biomolekyletransport og udvikle syntetiske neuronale netværk. Denne protokol åbner døren for bredere undersøgelser af LNT'ernes fysiokemiske egenskaber ved hjælp af et minimalt in vitro-modelsystem, hvor sammensætningen af LNT'erne let kan ændres for at efterligne naturlige cellulære strukturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sandia National Laboratories er et multi-mission laboratorium, der forvaltes og drives af National Technology &Engineering Solutions of Sandia, LLC., et helejet datterselskab af Honeywell International, Inc., for US DOE's National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-NA-0003525. Dette papir beskriver objektive tekniske resultater og analyser. Eventuelle subjektive synspunkter eller meninger, der måtte blive udtrykt i papiret, repræsenterer ikke nødvendigvis synspunkterne fra det amerikanske energiministerium eller den amerikanske regering.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntese og fluorescensmikroskopi blev udført gennem et brugerprojekt (ZIM) på Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility, der drives for US Department of Energy (DOE) Office of Science.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Tags

Bioengineering udgave 173 bioengineering lipid nanorør kinesin mikrotubulus glidemotilitet faseseparation
Fremstilling af multikomponent lipid nanorør netværk ved hjælp af Glidende Kinesin Motility Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imam, Z. I., Bachand, G. D.… More

Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter