Fremstilling af multikomponent lipid nanorør netværk ved hjælp af Glidende Kinesin Motility Assay
Summary
Denne protokol beskriver en proces til fremstilling af lipid nanorør netværk ved hjælp af glidende kinesin motilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesikler.
Abstract
Lipid nanorør (LNT) netværk repræsenterer et in vitro model system til undersøgelse af molekylær transport og lipid biofysik med relevans for de allestedsnærværende lipid tubuli findes i eukaryote celler. Imidlertid er in vivo LNT’er meget ikke-ligevægtsstrukturer, der kræver kemisk energi og molekylære motorer, der skal samles, vedligeholdes og omorganiseres. Desuden er sammensætningen af in vivo LNT’er kompleks og består af flere forskellige lipidarter. Typiske metoder til ekstrudering af LNT’er er både tids- og arbejdskrævende, og de kræver optisk pincet, mikroperler og mikropipetter for med magt at trække nanorør fra gigantiske lipidvesikler. Præsenteret her er en protokol til glidende motilitetsassay (GMA), hvor store LNT-netværk hurtigt genereres fra gigantiske unilamellare vesikler (GUV’er) ved hjælp af kinesindrevet mikrotubululmotilitet. Ved hjælp af denne metode dannes LNT-netværk fra en bred vifte af lipidformuleringer, der efterligner kompleksiteten af biologiske LNT’er, hvilket gør dem mere og mere nyttige til in vitro-undersøgelser af lipidbiofysik og membranassocieret transport. Derudover er denne metode i stand til pålideligt at producere LNT-netværk på kort tid (<30 min) ved hjælp af almindeligt anvendt laboratorieudstyr. LNT-netværkskarakteristika såsom længde, bredde og lipidpartitionering kan også indstilles ved at ændre lipidsammensætningen af guv'erne, der bruges til fremstilling af netværkene.
Introduction
Fremstillingen af lipid nanorør (LNT) netværk er af stigende interesse for in vitro undersøgelse af ikke-ligevægt lipidstrukturer 1,2,3. Celler bruger lipidtubuli til diffus transport af proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle-kommunikation 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparat er særligt interessante, da disse membranbundne organeller er de primære steder for lipid- og proteinsyntese samt transport af disse integrerede biomolekyler i cytoplasmaet i en celle 8,9. Membranerne i disse organeller består af flere lipidarter, herunder sphingolipider, kolesterol og fosfolipider10, der i sidste ende hjælper med at definere deres funktionalitet. For nærmere at replikere og studere disse organeller skal in vitro LNT’er fremstilles af vesikler med stadig mere komplekse lipidformuleringer11.
Gigantiske unilamellare vesikler (GUV’er) anvendes gennemgribende til undersøgelse af lipidmembranadfærd, fordi de pålideligt kan syntetiseres med komplekse formuleringer, der inkluderer kolesterol, phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS) og phosphatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode til fremstilling af LNT’er fra GUV’er med varierende lipidformuleringer ved hjælp af glidemotilitetsassay (GMA), hvor LNT’er ekstruderes baseret på det arbejde, der udføres af kinesinmotorer og mikrotubulilofilamenter, der virker på GUV’er. I dette system adsorberes kinesinmotoriske proteiner til en overflade fremdrive biotinylerede mikrotubuli og omdanner kemisk energi fra hydrolysen af ATP til nyttigt arbejde (specifikt ekstrudering af LNT’er fra biotinylerede vesikler)11. Det resulterende LNT-netværk giver en modelplatform til at studere virkningerne af forskellene i lipidfaser på ændringer i LNT-morfologi.
Kort fortalt indføres kinesinmotoriske proteiner i et flowkammer i en opløsning indeholdende kasein, hvilket muliggør adsorption af motorerne på kammerets glasoverflade. Dernæst strømmer biotinylerede mikrotubuli i en opløsning indeholdende ATP gennem kammeret og får lov til at binde til kinesinmotorerne og begynde motilitet. En streptavidinopløsning indføres derefter i kammeret og får lov til at binde ikke-kovalent til mikrotubuli. Endelig indføres GUV’er indeholdende et biotinyleret lipid i kammeret og binder til de streptavidinbelagte mikrotubuli og ekstruderer derefter LNT’er for at danne store netværk i løbet af 15-30 minutter. Denne metode producerer store, forgrenede LNT-netværk ved hjælp af standard laboratorieudstyr og reagenser til en lav pris11.
Protocol
Representative Results
Discussion
LNT-netværk er et nyttigt værktøj til in vitro-undersøgelser af membranegenskaber og transport af biomolekyler såsom transmembranproteiner. Desuden muliggør brug af komplekse lipidformuleringer til fremstilling af LNT-netværk mere biologisk relevante undersøgelser. Andre fabrikationsundersøgelser har brugt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellare vesikler eller 2) mere besværlige motilitetsteknikker til fremstilling af netværk fra GUV’er bestående af komplekse lipidformuleringer. Metoden beskrevet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntese og fluorescensmikroskopi blev udført gennem et brugerprojekt (ZIM) på Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility, der drives for US Department of Energy (DOE) Office of Science.
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
