Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante
Summary
Este protocolo describe un proceso para fabricar redes de nanotubos lipídicos utilizando la motilidad de la quinesina deslizante junto con vesículas lipídicas unilamelares gigantes.
Abstract
Las redes de nanotubos lipídicos (LNT) representan un sistema modelo in vitro para estudiar el transporte molecular y la biofísica lipídica con relevancia para los túbulos lipídicos ubicuos que se encuentran en las células eucariotas. Sin embargo, los LNT in vivo son estructuras altamente no equilibradas que requieren energía química y motores moleculares para ser ensamblados, mantenidos y reorganizados. Además, la composición de los LNT in vivo es compleja, compuesta por múltiples especies lipídicas diferentes. Los métodos típicos para extruir LNT requieren mucho tiempo y mano de obra, y requieren pinzas ópticas, microperlas y micropipetas para extraer por la fuerza nanotubos de vesículas lipídicas gigantes. Aquí se presenta un protocolo para el ensayo de motilidad de deslizamiento (GMA), en el que las redes LNT a gran escala se generan rápidamente a partir de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando la motilidad de microtúbulos alimentada por kinesina. Utilizando este método, las redes de LNT se forman a partir de una amplia gama de formulaciones lipídicas que imitan la complejidad de los LNT biológicos, lo que los hace cada vez más útiles para estudios in vitro de biofísica lipídica y transporte asociado a la membrana. Además, este método es capaz de producir de manera confiable redes LNT en poco tiempo (<30 min) utilizando equipos de laboratorio de uso común. Las características de la red LNT, como la longitud, el ancho y la partición de lípidos, también se pueden ajustar al alterar la composición lipídica de los GUV utilizados para fabricar las redes.
Introduction
La fabricación de redes de nanotubos lipídicos (LNT) es de creciente interés para el examen in vitro de estructuras lipídicas no equilibradas 1,2,3. Las células utilizan túbulos lipídicos para el transporte difusivo de proteínas4 y ácidos nucleicos5, así como para la comunicación de célula a célula 6,7. El retículo endoplásmico y el aparato de Golgi son particularmente interesantes, ya que estos orgánulos unidos a la membrana son los lugares principales para la síntesis de lípidos y proteínas, así como el transporte de estas biomoléculas integrales dentro del citoplasma de una célula 8,9. Las membranas de estos orgánulos están compuestas por múltiples especies de lípidos, incluidos esfingolípidos, colesterol y fosfolípidos10 que en última instancia ayudan a definir su funcionalidad. Por lo tanto, para replicar y estudiar más de cerca estos orgánulos, los LNT in vitro deben fabricarse a partir de vesículas con formulaciones lipídicas cada vez más complejas11.
Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) se utilizan de manera generalizada para estudiar el comportamiento de la membrana lipídica porque se pueden sintetizar de manera confiable con formulaciones complejas que incluyen colesterol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol (PI)12,13. Aquí se describe un método para fabricar LNT a partir de GUV con diferentes formulaciones lipídicas utilizando el ensayo de motilidad deslizante (GMA), en el que los LNT se extruyen en función del trabajo realizado por los motores de quinesina y los filamentos de microtúbulos que actúan sobre los GUV. En este sistema, las proteínas motoras de quinesina adsorbidas a una superficie impulsan microtúbulos biotinilados, convirtiendo la energía química de la hidrólisis del ATP en trabajo útil (específicamente, la extrusión de LNT a partir de vesículas biotiniladas)11. La red LNT resultante proporciona una plataforma modelo para estudiar los efectos de las diferencias en las fases lipídicas sobre los cambios en la morfología LNT.
Brevemente, las proteínas motoras de quinesina se introducen en una cámara de flujo en una solución que contiene caseína, lo que permite la adsorción de los motores en la superficie de vidrio de la cámara. A continuación, los microtúbulos biotinilados en una solución que contiene ATP fluyen a través de la cámara y se les permite unirse a los motores de quinesina y comenzar la motilidad. Luego se introduce una solución de estreptavidina en la cámara y se deja que se una de forma no covalente a los microtúbulos. Finalmente, los GUV que contienen un lípido biotinilado se introducen en la cámara y se unen a los microtúbulos recubiertos de estreptavidina, luego extruyen LNT para formar redes a gran escala en el transcurso de 15-30 min. Este método produce redes LNT grandes y ramificadas utilizando equipos de laboratorio estándar y reactivos a un bajo costo11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las redes LNT son una herramienta útil para estudios in vitro de las propiedades de la membrana y el transporte de biomoléculas como las proteínas transmembrana. Además, el uso de formulaciones lipídicas complejas para fabricar redes LNT permite estudios biológicamente más relevantes. Otros estudios de fabricación han utilizado 1) formulaciones lipídicas simples y vesículas multilamelares o 2) técnicas de motilidad más engorrosas para fabricar redes a partir de GUV compuestas de formulaciones lipídicas compl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, División de Ciencias e Ingeniería de Materiales (BES-MSE). La síntesis de kinesina y la microscopía de fluorescencia se realizaron a través de un proyecto de usuario (ZIM) en el Centro de Nanotecnologías Integradas, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencia operada para la Oficina de Ciencia del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE).
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
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