Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding
Summary
Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.
Abstract
As redes lipídicas de nanotubos (LNT) representam um sistema de modelo in vitro para estudar o transporte molecular e a biofísica lipídica com relevância para os túbulos lipídicos onipresentes encontrados em células eucarióticas. No entanto, os LNTs in vivo são estruturas altamente não-equilibradas que requerem energia química e motores moleculares para serem montados, mantidos e reorganizados. Além disso, a composição dos In vivo LNTs é complexa, composta por várias espécies lipídicas diferentes. Métodos típicos para extrusão de LNTs são demorados e intensivos em mão-de-obra, e requerem pinças ópticas, microesferas e micropipettos para puxar à força nanotubos de vesículas lipídicas gigantes. Apresentado aqui é um protocolo para o ensaio de motilidade deslizante (GMA), no qual redes LNT em larga escala são rapidamente geradas a partir de vesículas unilamellar gigantes (GUVs) usando motilidade de microtúbula alimentada por cinesina. Usando este método, as redes LNT são formadas a partir de uma ampla gama de formulações lipídicas que imitam a complexidade dos LNTs biológicos, tornando-as cada vez mais úteis para estudos in vitro de biofísica lipídica e transporte associado à membrana. Além disso, este método é capaz de produzir redes LNT de forma confiável em um curto espaço de tempo (<30 min) utilizando equipamentos de laboratório comumente usados. Características da rede LNT, como comprimento, largura e particionamento lipíduo também são incapazes de alterar a composição lipídica dos GUVs usados para a fabricação das redes.
Introduction
A fabricação de redes lipídicas de nanotubos (LNT) é de crescente interesse pelo exame in vitro de estruturas lipídicas de noquilibrium 1,2,3. As células usam túbulos lipídios para o transporte difuso de proteínas4 e ácidos nucleicos5, bem como comunicação célula-celular 6,7. O ritúlume endoplasmático e o aparelho golgi são particularmente interessantes, pois essas organelas ligadas à membrana são os locais principais para síntese lipídica e proteica, bem como o transporte dessas biomoléculas integrais dentro do citoplasma de uma célula 8,9. As membranas dessas organelas são compostas de múltiplas espécies lipídicas, incluindo sphingolipids, colesterol e fosfolipídios10 que, em última análise, ajudam a definir sua funcionalidade. Assim, para replicar mais de perto e estudar essas organelas, os LNTs in vitro devem ser fabricados a partir de vesículas com formulações lipídicas cada vez mais complexas11.
Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são usadas de forma generalizada para estudar o comportamento da membrana lipídica porque podem ser sintetizadas de forma confiável com formulações complexas que incluem colesterol, fosfatidylcolina (PC), fosfatidyletanolamina (PE), fosfatidylserina (PS) e fosfatidylinositol (PI)12,13. Descrito aqui é um método para fabricar LNTs de GUVs com formulações lipídicas variadas usando o ensaio de motilidade deslizante (GMA), no qual os LNTs são extrudados com base no trabalho realizado por motores de cinesina e filamentos de microtúbulos que atuam em GUVs. Neste sistema, as proteínas motoras de cinesina adsorvidas a uma superfície propel microtúbulos biotinínos, convertendo energia química da hidrólise de ATP em trabalho útil (especificamente, a extrusão de LNTs de vesículas biotinína)11. A rede LNT resultante fornece uma plataforma modelo para estudar os efeitos das diferenças nas fases lipídicas sobre as alterações na morfologia LNT.
Resumidamente, as proteínas motoras da cinesina são introduzidas em uma câmara de fluxo em uma solução contendo caseína, que permite a adsorção dos motores na superfície de vidro da câmara. Em seguida, microtúbulos biotinínos em uma solução contendo fluxo ATP através da câmara e são autorizados a ligar-se aos motores de cinesina e começar a motilidade. Uma solução streptavidin é então introduzida na câmara e permitida a ligação não covalente aos microtúbulos. Finalmente, os GUVs contendo um lipídio biotinilatado são introduzidos na câmara e se ligam aos microtúbulos revestidos de streptavidin, em seguida, extrude LNTs para formar redes de grande escala ao longo de 15-30 min. Este método produz grandes redes LNT ramificadas utilizando equipamentos de laboratório padrão e reagentes a um baixo custo11.
Protocol
Representative Results
Discussion
As redes LNT são uma ferramenta útil para estudos in vitro para propriedades de membrana e o transporte de biomoléculas, como proteínas transmembranas. Além disso, o uso de formulações lipídicas complexas para fabricar redes LNT permite estudos mais biologicamente relevantes. Outros estudos de fabricação têm usado ou 1) formulações lipídicas simples e vesículos multilamellar ou 2) técnicas de motilidade mais complicadas para fabricar redes de GUVs compostas por formulações lipídicas complexas. O métod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Divisão de Ciências e Engenharia de Materiais (BES-MSE). A síntese de cinesina e a microscopia de fluorescência foram realizadas por meio de um projeto de usuário (ZIM) no Center for Integrated Nanotechnologies, um Office of Science User Facility operado para o Escritório de Ciência do Departamento de Energia dos EUA (DOE).
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
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