Summary

Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

Este protocolo descreve um processo para a fabricação de redes lipídicas de nanotubos usando motilidade de quinase deslizante em conjunto com vesículas lipídicas unilamellar gigantes.

Abstract

As redes lipídicas de nanotubos (LNT) representam um sistema de modelo in vitro para estudar o transporte molecular e a biofísica lipídica com relevância para os túbulos lipídicos onipresentes encontrados em células eucarióticas. No entanto, os LNTs in vivo são estruturas altamente não-equilibradas que requerem energia química e motores moleculares para serem montados, mantidos e reorganizados. Além disso, a composição dos In vivo LNTs é complexa, composta por várias espécies lipídicas diferentes. Métodos típicos para extrusão de LNTs são demorados e intensivos em mão-de-obra, e requerem pinças ópticas, microesferas e micropipettos para puxar à força nanotubos de vesículas lipídicas gigantes. Apresentado aqui é um protocolo para o ensaio de motilidade deslizante (GMA), no qual redes LNT em larga escala são rapidamente geradas a partir de vesículas unilamellar gigantes (GUVs) usando motilidade de microtúbula alimentada por cinesina. Usando este método, as redes LNT são formadas a partir de uma ampla gama de formulações lipídicas que imitam a complexidade dos LNTs biológicos, tornando-as cada vez mais úteis para estudos in vitro de biofísica lipídica e transporte associado à membrana. Além disso, este método é capaz de produzir redes LNT de forma confiável em um curto espaço de tempo (<30 min) utilizando equipamentos de laboratório comumente usados. Características da rede LNT, como comprimento, largura e particionamento lipíduo também são incapazes de alterar a composição lipídica dos GUVs usados para a fabricação das redes.

Introduction

A fabricação de redes lipídicas de nanotubos (LNT) é de crescente interesse pelo exame in vitro de estruturas lipídicas de noquilibrium 1,2,3. As células usam túbulos lipídios para o transporte difuso de proteínas4 e ácidos nucleicos5, bem como comunicação célula-celular 6,7. O ritúlume endoplasmático e o aparelho golgi são particularmente interessantes, pois essas organelas ligadas à membrana são os locais principais para síntese lipídica e proteica, bem como o transporte dessas biomoléculas integrais dentro do citoplasma de uma célula 8,9. As membranas dessas organelas são compostas de múltiplas espécies lipídicas, incluindo sphingolipids, colesterol e fosfolipídios10 que, em última análise, ajudam a definir sua funcionalidade. Assim, para replicar mais de perto e estudar essas organelas, os LNTs in vitro devem ser fabricados a partir de vesículas com formulações lipídicas cada vez mais complexas11.

Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são usadas de forma generalizada para estudar o comportamento da membrana lipídica porque podem ser sintetizadas de forma confiável com formulações complexas que incluem colesterol, fosfatidylcolina (PC), fosfatidyletanolamina (PE), fosfatidylserina (PS) e fosfatidylinositol (PI)12,13. Descrito aqui é um método para fabricar LNTs de GUVs com formulações lipídicas variadas usando o ensaio de motilidade deslizante (GMA), no qual os LNTs são extrudados com base no trabalho realizado por motores de cinesina e filamentos de microtúbulos que atuam em GUVs. Neste sistema, as proteínas motoras de cinesina adsorvidas a uma superfície propel microtúbulos biotinínos, convertendo energia química da hidrólise de ATP em trabalho útil (especificamente, a extrusão de LNTs de vesículas biotinína)11. A rede LNT resultante fornece uma plataforma modelo para estudar os efeitos das diferenças nas fases lipídicas sobre as alterações na morfologia LNT.

Resumidamente, as proteínas motoras da cinesina são introduzidas em uma câmara de fluxo em uma solução contendo caseína, que permite a adsorção dos motores na superfície de vidro da câmara. Em seguida, microtúbulos biotinínos em uma solução contendo fluxo ATP através da câmara e são autorizados a ligar-se aos motores de cinesina e começar a motilidade. Uma solução streptavidin é então introduzida na câmara e permitida a ligação não covalente aos microtúbulos. Finalmente, os GUVs contendo um lipídio biotinilatado são introduzidos na câmara e se ligam aos microtúbulos revestidos de streptavidin, em seguida, extrude LNTs para formar redes de grande escala ao longo de 15-30 min. Este método produz grandes redes LNT ramificadas utilizando equipamentos de laboratório padrão e reagentes a um baixo custo11.

Protocol

1. Preparação de soluções de microtúbulos de estoque ATENÇÃO: Óculos de segurança, luvas e um jaleco devem ser sempre usados em todo o protocolo. Prepare 5x tampão BRB80: adicione 24,19 g de PIPES (piperazine-N,N’-bis[2-ácido elfofônico]) e 0,38 g de EGTA (etileno glycol-bis[β-aminoetil éter]-N,N,N′,N′-tetraacético ácido) a uma garrafa de vidro 1 L. Adicione 1 mL de 1 M MgCl2 e ajuste o pH para 6,9 com KOH. Adicione água deionizada para levar a soluç?…

Representative Results

As redes LNT (Figura 4) foram fabricadas utilizando o protocolo descrito, que utiliza o trabalho realizado pelo transporte de cinesina de microtúbulos para extrusão de LNTs de GUVs. Resumidamente, os GUVs foram preparados utilizando a reidratação do gel de agarose utilizando solução de sacarose, e os microtúbulos foram polimerizados em solução GPEM e estabilizados em BRB80T. Em seguida, motores de cinesina foram introduzidos em uma célula de fluxo formando uma camada ativa de motor…

Discussion

As redes LNT são uma ferramenta útil para estudos in vitro para propriedades de membrana e o transporte de biomoléculas, como proteínas transmembranas. Além disso, o uso de formulações lipídicas complexas para fabricar redes LNT permite estudos mais biologicamente relevantes. Outros estudos de fabricação têm usado ou 1) formulações lipídicas simples e vesículos multilamellar ou 2) técnicas de motilidade mais complicadas para fabricar redes de GUVs compostas por formulações lipídicas complexas. O métod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Divisão de Ciências e Engenharia de Materiais (BES-MSE). A síntese de cinesina e a microscopia de fluorescência foram realizadas por meio de um projeto de usuário (ZIM) no Center for Integrated Nanotechnologies, um Office of Science User Facility operado para o Escritório de Ciência do Departamento de Energia dos EUA (DOE).

Materials

100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

References

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Cite This Article
Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

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