Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante
Summary
Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.
Abstract
Les réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) représentent un système modèle in vitro pour l’étude du transport moléculaire et de la biophysique des lipides en rapport avec les tubules lipidiques omniprésents présents dans les cellules eucaryotes. Cependant, les LNT in vivo sont des structures hautement non équilibrées qui nécessitent l’assemblage, la maintenance et la réorganisation de l’énergie chimique et des moteurs moléculaires. De plus, la composition des LNT in vivo est complexe, comprenant plusieurs espèces de lipides différentes. Les méthodes typiques d’extrusion des LNT sont à la fois chronophages et laborieuses, et nécessitent une pince optique, des microbilles et des micropipettes pour extraire de force des nanotubes de vésicules lipidiques géantes. Présenté ici est un protocole pour le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel des réseaux LNT à grande échelle sont rapidement générés à partir de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en utilisant la motilité de microtubule alimentée par la kinésine. En utilisant cette méthode, les réseaux LNT sont formés à partir d’un large éventail de formulations lipidiques qui imitent la complexité des LNT biologiques, ce qui les rend de plus en plus utiles pour les études in vitro de la biophysique des lipides et du transport associé à la membrane. De plus, cette méthode est capable de produire de manière fiable des réseaux LNT en peu de temps (<30 min) à l’aide d’équipements de laboratoire couramment utilisés. Les caractéristiques du réseau LNT telles que la longueur, la largeur et le partitionnement lipidique sont également accordables en modifiant la composition lipidique des GUV utilisés pour fabriquer les réseaux.
Introduction
La fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) présente un intérêt croissant pour l’examen in vitro des structures lipidiques non équilibrées 1,2,3. Les cellules utilisent des tubules lipidiques pour le transport diffusif des protéines4 et des acides nucléiques5 ainsi que pour la communication de cellule à cellule 6,7. Le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi sont particulièrement intéressants, car ces organites liés à la membrane sont les principaux emplacements pour la synthèse des lipides et des protéines ainsi que pour le transport de ces biomolécules intégrales dans le cytoplasme d’une cellule 8,9. Les membranes de ces organites sont composées de plusieurs espèces lipidiques, y compris les sphingolipides, le cholestérol et les phospholipides10 qui aident finalement à définir leur fonctionnalité. Ainsi, pour répliquer et étudier plus étroitement ces organites, les LNT in vitro doivent être fabriqués à partir de vésicules avec des formulations lipidiques de plus en plus complexes11.
Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont utilisées de manière omniprésente pour étudier le comportement de la membrane lipidique, car elles peuvent être synthétisées de manière fiable avec des formulations complexes comprenant le cholestérol, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI)12,13. Décrit ici est une méthode pour fabriquer des LNT à partir de GUV avec différentes formulations lipidiques en utilisant le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel les LNT sont extrudés en fonction du travail effectué par les moteurs de kinésine et les filaments de microtubules agissant sur les GUV. Dans ce système, les protéines motrices de la kinésine adsorbées à une surface propulsent des microtubules biotinylés, convertissant l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en un travail utile (en particulier, l’extrusion de LNT à partir de vésicules biotinylées)11. Le réseau LNT qui en résulte fournit une plate-forme modèle pour étudier les effets des différences dans les phases lipidiques sur les changements dans la morphologie des LNT.
En bref, les protéines motrices de la kinésine sont introduites dans une chambre d’écoulement dans une solution contenant de la caséine, ce qui permet l’adsorption des moteurs sur la surface vitrée de la chambre. Ensuite, les microtubules biotinylés dans une solution contenant de l’ATP circulent à travers la chambre et sont autorisés à se lier aux moteurs de kinésine et à commencer la motilité. Une solution de streptavidine est ensuite introduite dans la chambre et laissée se lier de manière non covalente aux microtubules. Enfin, les GUV contenant un lipide biotinylé sont introduits dans la chambre et se lient aux microtubules recouverts de streptavidine, puis extrudent les LNT pour former des réseaux à grande échelle pendant 15 à 30 minutes. Cette méthode produit de grands réseaux LNT ramifiés en utilisant des équipements de laboratoire standard et des réactifs à faible coût11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les réseaux LNT sont un outil utile pour les études in vitro des propriétés membranaires et du transport de biomolécules telles que les protéines transmembranaires. De plus, l’utilisation de formulations lipidiques complexes pour fabriquer des réseaux de LNT permet des études plus pertinentes sur le plan biologique. D’autres études de fabrication ont utilisé soit 1) des formulations lipidiques simples et des vésicules multilamellaires, soit 2) des techniques de motilité plus lourdes pour fabriquer des ré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). La synthèse de la kinésine et la microscopie à fluorescence ont été réalisées dans le cadre d’un projet utilisateur (ZIM) au Center for Integrated Nanotechnologies, une installation d’utilisateurs du Bureau des utilisateurs du Bureau des sciences du Bureau des sciences du Département de la science des États-Unis ( DOE).
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
