Summary

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

Abstract

רשתות ננו-צינוריות ליפידים (LNT) מייצגות מערכת מודלים חוץ גופית לחקר הובלה מולקולרית וביופיסיקה של שומנים עם רלוונטיות לצינוריות השומנים הנמצאות בכל מקום בתאים אאוקריוטים. עם זאת, LNTs in vivo הם מבנים מאוד לא שיווי משקל הדורשים אנרגיה כימית ומנועים מולקולריים כדי להרכיב, לתחזק ולארגן מחדש. יתר על כן, ההרכב של LNTs in vivo הוא מורכב, ומורכב ממספר מיני שומנים שונים. שיטות אופייניות להבלטת LNTs הן עתירות זמן ועבודה, והן דורשות פינצטה אופטית, מיקרובים ומיקרופיפטים כדי למשוך בכוח ננו-צינוריות מבועיות ליפידים ענקיות. מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת תנועתיות הגלישה (GMA), שבה רשתות LNT בקנה מידה גדול נוצרות במהירות מבועיות ענק חד-שכבתיות (GUVs) באמצעות תנועתיות מיקרוטובולים המופעלות על ידי קינזין. באמצעות שיטה זו, רשתות LNT נוצרות ממגוון רחב של פורמולציות שומנים המחקות את המורכבות של LNTs ביולוגיים, מה שהופך אותן לשימושיות יותר ויותר למחקרים חוץ גופיים של ביופיסיקה של שומנים ותחבורה הקשורה לממברנה. בנוסף, שיטה זו מסוגלת לייצר באופן אמין רשתות LNT בזמן קצר (<30 דקות) באמצעות ציוד מעבדה נפוץ. מאפייני רשת LNT כגון אורך, רוחב ומחיצות שומנים ניתנים גם לכוונון על ידי שינוי הרכב השומנים של ה- GUVs המשמשים לייצור הרשתות.

Introduction

ייצור רשתות ננו-צינוריות שומנים (LNT) מעורר עניין גובר בבדיקה חוץ גופית של מבנים שומניים ללא שיווי משקל 1,2,3. תאים משתמשים בצינוריות ליפידים להובלה מפוזרת של חלבונים4 וחומצות גרעין5, כמו גם תקשורת בין תאים לתא 6,7. הרשתית האנדופלסמית ומנגנון גולג’י מעניינים במיוחד, שכן אברונים אלה הקשורים לממברנה הם המיקומים העיקריים לסינתזת שומנים וחלבונים, כמו גם להובלה של ביומולקולות אינטגרליות אלה בתוך הציטופלסמה של תא 8,9. הממברנות של אברונים אלה מורכבות ממיני שומנים מרובים כולל ספינגולפידים, כולסטרול ופוספוליפידים10 שבסופו של דבר עוזרים להגדיר את הפונקציונליות שלהם. לפיכך, כדי לשכפל ולחקור בצורה הדוקה יותר את האברונים הללו, יש לייצר LNTs במבחנה משלפוחית עם נוסחאות שומנים מורכבות יותר ויותר11.

בועיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות באופן נרחב לחקר התנהגות קרום השומנים מכיוון שניתן לסנתז אותן באופן אמין עם פורמולציות מורכבות הכוללות כולסטרול, פוספטידילכולין (PC), פוספטידיל-ילתנולמין (PE), פוספטידיל-סרין (PS) ופוספטידילינוזיטול (PI)12,13. מתוארת כאן שיטה לייצור LNTs מ- GUVs עם נוסחאות ליפידים משתנות באמצעות בדיקת תנועתיות גלישה (GMA), שבה LNTs מובלטים על סמך העבודה המבוצעת על ידי מנועי קינזין וחוטים מיקרוטובולים הפועלים על גבי GUVs. במערכת זו, חלבונים מוטוריים של קינסין נספגים אל פני השטח מניעים מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה, וממירים אנרגיה כימית מהידרוליזה של ATP לעבודה שימושית (במיוחד, שחול של LNTs משלפוחיות ביוטינילציה)11. רשת LNT המתקבלת מספקת פלטפורמת מודל לחקר ההשפעות של ההבדלים בשלבי השומנים על שינויים במורפולוגיה של LNT.

בקצרה, חלבונים מוטוריים של קינזין מוכנסים לתא זרימה בתמיסה המכילה קזאין, המאפשרת את ספיגת המנועים על פני הזכוכית של התא. לאחר מכן, מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה בתמיסה המכילה ATP זורמים דרך התא ומותר להם להיקשר למנועי הקינזין ולהתחיל בתנועתיות. לאחר מכן מכניסים תמיסת סטרפטווידין לתוך התא ומאפשרים לה להיקשר באופן לא קוולנטי למיקרוטובולים. לבסוף, GUVs המכילים שומנים ביולוגיים מוכנסים לחדר ונקשרים למיקרוטובולים המצופה סטרפטווידין, ולאחר מכן מוציאים LNTs ליצירת רשתות בקנה מידה גדול במהלך 15-30 דקות. שיטה זו מייצרת רשתות LNT גדולות ומסועפות באמצעות ציוד מעבדה וריאגנטים סטנדרטיים בעלות נמוכה11.

Protocol

1. הכנת פתרונות מיקרוטובול מלאי אזהרה: תמיד יש לענוד משקפי בטיחות, כפפות ומעיל מעבדה לאורך כל הפרוטוקול. הכן 5x BRB80 buffer: הוסף 24.19 גרם של PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-חומצה אתאנסולפונית]) ו-0.38 גרם של EGTA (אתילן גליקול-ביס[אתר β-אמינואתיל]-N,N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית) לבקבוק זכוכית בנפח 1 ליט…

Representative Results

רשתות LNT (איור 4) יוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר, המשתמש בעבודה המבוצעת על ידי הובלת קינסין של מיקרוטובולים כדי להוציא LNTs מ-GUVs. בקצרה, GUVs הוכנו באמצעות התייבשות ג’ל אגרוז באמצעות תמיסת סוכרוז, ומיקרוטובולים פוזלו בתמיסת GPEM והתייצבו ב- BRB80T. לאחר מכן, מנועי קינסין הוכנסו לתא זר?…

Discussion

רשתות LNT הן כלי שימושי למחקרים במבחנה לתכונות הממברנה ולהובלת ביומולקולות כגון חלבוני טרנס-ממברנה. יתר על כן, שימוש בפורמולות ליפידים מורכבות לייצור רשתות LNT מאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. מחקרי ייצור אחרים השתמשו ב-1) ניסוחי ליפידים פשוטים ושלפוחיות מולטי-למלר או 2) טכניקות ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת האנרגיה של ארה”ב, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, המחלקה למדעי החומרים וההנדסה (BES-MSE). סינתזת קינסין ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בוצעו באמצעות פרויקט משתמש (ZIM) במרכז לננו-טכנולוגיה משולבת, מתקן משתמשים של משרד המדע המופעל עבור משרד המדע האמריקאי (DOE).

Materials

100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Play Video

Cite This Article
Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

View Video