Summary
Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.
Abstract
Lipide nanobuisjes (LNT) netwerken vertegenwoordigen een in vitro modelsysteem voor het bestuderen van moleculair transport en lipide biofysica met relevantie voor de alomtegenwoordige lipide tubuli in eukaryote cellen. In vivo LNT's zijn echter zeer niet-evenwichtsstructuren die chemische energie en moleculaire motoren vereisen om te worden geassembleerd, onderhouden en gereorganiseerd. Bovendien is de samenstelling van in vivo LNT's complex, bestaande uit meerdere verschillende lipidesoorten. Typische methoden om LNT's te extruderen zijn zowel tijd- als arbeidsintensief, en ze vereisen optische pincetten, microbeads en micropipettes om nanobuisjes met geweld uit gigantische lipideblaasjes te trekken. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de gliding motility assay (GMA), waarbij grootschalige LNT-netwerken snel worden gegenereerd uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van kinesine-aangedreven microtubule motiliteit. Met behulp van deze methode worden LNT-netwerken gevormd uit een breed scala aan lipideformuleringen die de complexiteit van biologische LNT's nabootsen, waardoor ze steeds nuttiger worden voor in vitro studies van lipidebiofysica en membraangeassocieerd transport. Bovendien is deze methode in staat om in korte tijd (<30 min) op betrouwbare wijze LNT-netwerken te produceren met behulp van veelgebruikte laboratoriumapparatuur. LNT-netwerkkenmerken zoals lengte, breedte en lipidenverdeling zijn ook instelbaar door de lipidesamenstelling van de GUVs die worden gebruikt voor het fabriceren van de netwerken te veranderen.
Introduction
De fabricage van lipide nanobuis (LNT) netwerken is van toenemend belang voor in vitro onderzoek van niet-evenwicht lipidestructuren 1,2,3. Cellen gebruiken lipide tubuli voor het diffusieve transport van eiwitten4 en nucleïnezuren5 en cel-naar-cel communicatie 6,7. Het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat zijn bijzonder interessant, omdat deze membraangebonden organellen de primaire locaties zijn voor lipide- en eiwitsynthese en transport van deze integrale biomoleculen in het cytoplasma van een cel 8,9. De membranen van deze organellen bestaan uit meerdere lipidesoorten, waaronder sfingolipiden, cholesterol en fosfolipiden10 die uiteindelijk helpen bij het definiëren van hun functionaliteit. Dus, om deze organellen nauwkeuriger te repliceren en te bestuderen, moeten in vitro LNT's worden vervaardigd uit blaasjes met steeds complexere lipideformuleringen11.
Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden alomtegenwoordig gebruikt voor het bestuderen van lipidemembraangedrag omdat ze betrouwbaar kunnen worden gesynthetiseerd met complexe formuleringen die cholesterol, fosfatidylcholine (PC), fosfatidylethanolamine (PE), fosfatidylserine (PS) en fosfatidylinositol (PI) bevatten 12,13. Hier wordt een methode beschreven om LNT's te fabriceren uit GUVs met verschillende lipideformuleringen met behulp van de gliding motility assay (GMA), waarbij LNT's worden geëxtrudeerd op basis van het werk dat wordt uitgevoerd door kinesinemotoren en microtubule-filamenten die op GUVs werken. In dit systeem stuwen kinesinemotoreiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak gebiotinyleerde microtubuli aan, waardoor chemische energie van de hydrolyse van ATP wordt omgezet in nuttig werk (met name de extrusie van LNT's uit gebiotinyleerde blaasjes)11. Het resulterende LNT-netwerk biedt een modelplatform om effecten van de verschillen in lipidefasen op veranderingen in LNT-morfologie te bestuderen.
In het kort worden kinesinemotoreiwitten in een stroomkamer ingebracht in een oplossing die caseïne bevat, waardoor de motoren op het glazen oppervlak van de kamer kunnen worden geplaatst. Vervolgens stromen gebiotinyleerde microtubuli in een oplossing die ATP bevat door de kamer en mogen ze binden aan de kinesinemotoren en beginnen met motiliteit. Een streptavidin-oplossing wordt vervolgens in de kamer ingebracht en mag niet-covalent aan de microtubuli binden. Ten slotte worden GUVs met een gebiotinyleerd lipide in de kamer gebracht en binden ze aan de gestreepte microtubuli en extruderen ze vervolgens LNT's om grootschalige netwerken te vormen in de loop van 15-30 minuten. Deze methode produceert grote, vertakte LNT-netwerken met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en reagentia tegen lage kosten11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van voorraad microtubule oplossingen
LET OP: Veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas moeten altijd worden gedragen tijdens het protocol.
- Bereid 5x BRB80-buffer: voeg 24,19 g PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-ethaansulfonzuur]) en 0,38 g EGTA (ethyleenglycol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetra-azijnzuur) toe aan een glazen fles van 1 L. Voeg 1 ml 1 M MgCl2 toe en stel de pH in op 6,9 met KOH. Voeg gedeïoniseerd water toe om de oplossing op een eindvolume van 500 ml te brengen.
- Bereid 100 mM voorraad GTP-oplossing: weeg 52 mg GTP af en suspensie in 1 ml gedestilleerd water. Verdeel 100 mM oplossing in 20 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Gpem-oplossing bereiden: meng 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-oplossing, 100 μL 100% glycerol en 600 μL gedeïoniseerd water. Verdeel de GPEM-oplossing in 100 μL aliquots en bewaar in -20 °C.
- Bereid microtubulioplossing door injectieflacons met in de handel verkrijgbare, gelyofiliseerde tubuline (één injectieflacon elk van gebiotinyleerd, fluorescerend geëtiketteerd en niet-geëtiketteerd) in koude (4 °C) GPEM-oplossing te reconstrueren tot een voorraadconcentratie van 5 mg/ml.
- Voer microtubulepolymerisatie uit door 4 μL biotinylated tubulin, 4 μL fluorescerend gelabeld tubuline en 24 μL ongelabeld tubuline (allemaal bij concentraties van 5 mg / ml) te mengen om een verhouding van 1: 1: 6 te creëren bij een eindvolume van 32 ml. Houd het op ijs. Verdeel het tubulinemengsel in 2 μL aliquots en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is.
OPMERKING: Efficiënte polymerisatie vereist dat de concentratie tubuline gelijk is aan of hoger is dan de kritische concentratie (5 mg / ml)14. Hier wordt de selectie van de tubulineverhouding geoptimaliseerd voor een voldoende concentratie gebiotinyleerd tubuline om streptavidin en GUVs efficiënt te binden, evenals een voldoende concentratie fluorescerende tubuline voor microscopische karakterisering.
2. Bereiding van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)
- Agarose filmvoorbereiding
OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Greene et al.15.- Bereid een oplossing van 1% w/v door 1 g agarose in 100 ml gedeïoniseerd water in een Erlenmeyer van 250 ml te mengen. Gebruik een standaard magnetron om de agarose-oplossing gedurende 1-2 minuten te verwarmen.
OPMERKING: De oplossing wordt doorschijnend zodra de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot 65-75 °C. - Gebruik een gesneden pipetpunt van 1.000 μL om 300-400 μL agarose-oplossing op een glazen afdeklip van 25 mm x 25 mm te pipeten. Terwijl u de rand van de coverslip met gehandschoende vingers vasthoudt, gebruikt u nog een pipetpunt van 1.000 μL om de gesmolten agarose gelijkmatig over de coverslip te verspreiden.
OPMERKING: Door de agarose op 65-75 °C te houden, kunt u efficiënt op het oppervlak van de afdekplaat worden verspreid. - Droog de met agarose gecoate dekplaten in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 2 uur, waarna de agarose transparant wordt. Bewaar de coverslips door het agarose gecoate oppervlak naar boven gericht op een schoon oppervlak te plaatsen, zoals pluisvrij papier of op was gebaseerde film bij kamertemperatuur (RT).
- Bereid een oplossing van 1% w/v door 1 g agarose in 100 ml gedeïoniseerd water in een Erlenmeyer van 250 ml te mengen. Gebruik een standaard magnetron om de agarose-oplossing gedurende 1-2 minuten te verwarmen.
- Lipide formulering
- Haal in chloroform opgeloste lipiden uit een vriezer van -20 °C en plaats ze in een chemische zuurkast totdat ze RT bereiken.
- Bereken het volume lipidevoorraad van elke component lipide die nodig is voor de formulering met behulp van de volgende formule:
Waarbij: V-lipide het te gebruiken lipidevolume is, mol % het molaire percentage van de lipidecomponent, n het totale aantal mol lipide dat in de formulering wordt gebruikt en M de concentratie van lipide in molaire eenheden.
OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een formulering gebruikt die 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) bevat met een stockoplossingsconcentratie van 12,72 mM en 1 micromol totaal lipiden in de formulering, is het volume DOPC-voorraad dat in de formulering wordt gebruikt:
- Meng de lipiden samen in de berekende verhouding in een glazen injectieflacon in de chemische zuurkast.
- Pipetteer 30 μL lipideoplossing op de met agarose gecoate coverslips op een voorverwarmde hete plaat die boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering is geplaatst (bv. hete plaat van 50 °C voor een lipide met Tm van 40 °C).
- Verdeel de oplossing in een cirkelvormige beweging over de agarosefilm met behulp van de lange rand van een naald van 18 G totdat de chloroform is verdampt en een uniforme laag lipide is gevormd. Houd de rand van de coverslip vast met gehandschoende vingers tijdens het uitvoeren van deze stap.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de agaroselaag niet met de naald wordt beschadigd. - Plaats de coverslip met agaroselaag en lipidefilm in een met aluminiumfolie bedekte petrischaal, filmzijde naar boven gericht, en plaats de petrischaal gedurende ten minste 2 uur in een vacuümdesiccator om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
- Bereid ondertussen 560 mM sucrose-oplossing door 1,92 g sucrose te mengen met 10 ml gedeïoniseerd water.
OPMERKING: De concentratie van de sucrose-oplossing is afhankelijk van de osmolariteit van de buffer-GUVs waarin wordt verdund. Doorgaans mag de osmolariteit van de sucroseoplossing niet meer dan 10% groter zijn dan de buffer waarin de GUVs worden verdund, met name de motiliteitsbuffer (zie stap 3.11). - GUV-formatie
- Bevestig een kleefkamer aan de coverslip bedekt met de lipidefilm door de kleefkamer voorzichtig op de met lipiden gecoate coverslip te drukken met de lipidefilm naar boven gericht, zodat een strakke afdichting wordt gevormd.
- Voeg 400 μL 560 mM sucrose-oplossing (bereid in stap 2.3) toe aan de kamer.
- Plaats de dekselslip in de vochtigheidskamer en sluit het deksel.
- Plaats de vochtigheidskamer op een voorverwarmde kookplaat boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering.
- Laat blaasjes zich ≥1 uur vormen voordat u herstelt.
OPMERKING: De vorming van blaasjes kan worden gecontroleerd met fluorescentiemicroscopie met een 40x luchtobjectieflens.
3. Bereiding van motiliteitstestvoorraden en reagentia
- Bereiding van caseïnevoorraden
- Voeg 3 g droge caseïne toe aan een conische centrifugebuis van 50 ml, voeg vervolgens 30 ml 1x BRB80 toe en draai tot de oplossing stroperig wordt. Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 30 minuten.
- Breng het supernatant over in een andere conische centrifugebuis van 50 ml en gooi de pellet weg. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 1 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml.
- Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij 280 nm te meten met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en kwarts cuvette.
- Bereken de caseïneconcentratie in mg/ml met behulp van de volgende formule:
- Verdun de oplossing tot 20 mg/ml in 1x BRB80, verdeel in aliquots van 100 μL en bewaar bij -20 °C.
- Bereid glucoseoxidase (2 mg/ml) stamoplossing door 2 mg glucoseoxidase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid catalase (0,8 mg/ml) stockoplossing door 0,8 mg catalase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 2 M glucose-oplossing door 0,3 g D-glucose in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 100 mM DTT-voorraad door 0,015 g DTT in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 100 mM Mg-ATP voorraad door 0,055 g dinatrium ATP te suspenseren in 1 ml oplossing van 100 mM MgCl2. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 100 mM Mg-AMP-PNP-oplossing door 0,055 g AMP-PNP op te schorten in een 1 ml-oplossing van 100 mM MgCl2, verdeel vervolgens in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 100 mM Trolox-oplossing door 25,03 mg Trolox toe te voegen aan 1 ml methanol en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 10 mg/ml streptavidinoplossing door 1 mg streptavidin toe te voegen aan 100 μL BRB80, verdeel vervolgens in 2 μL aliquots en bewaar bij -80ۛ °C.
- Bereid BRB90CAT door 200 μL 5x BRB80, 20 μL caseïneoplossing, 10 μL MgATP-oplossing, 10 μL Trolox, 5 μL paclitaxeloplossing en 765 μL DI-water te mengen. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid de motiliteitsoplossing door 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glucoseoplossing, 2 μL glucoseoxidaseoplossing, 2 μL DTT-oplossing en 2 μL catalaseoplossing te mengen. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid een kinesineoplossing van 1 μM door de stockkineïneoplossing in BRB80CAT te verdunnen (bijv. 2 μL 50 mM kinesineoplossing in 98 μL BRB80CAT) en bewaar bij 4 °C.
- Bereid een microtubuleoplossing van 10 μg/ml door 10 μL gestabiliseerde microtubuli te verdunnen in 90 μL BRB80CAT bij kamertemperatuur. Winkel bij RT.
- Bereid een streptavidinoplossing van 10 μg/ml door 0,1 μL 10 mg/ml streptavidinoplossing toe te voegen aan 99,9 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid een 12x GUV-oplossing door 5 μL GUV-bouillon te verdunnen tot 55 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.
- Polymerisatie van tubuline tot microtubuli
- Haal een vooraf bereide aliquot tubuline van 2 μL uit de vriezer van -80 °C (bereid in stap 1.5) en plaats gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
- Bereid een paclitaxeloplossing van 2 mM door toevoeging van 1,71 mg paclitaxel in 1 ml watervrije DMSO, verdeel in 10 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.
- Bereid BRB80T vers door 99,5 μL 1x BRB80 te mengen met 0,5 μL 2 mM paclitaxel. Verwarm 100 μL BRB80T tot 37 °C in het waterbad.
- Voeg na 30 minuten de 100 μL BRB80T toe aan het tubuline aliquot om de microtubuli te stabiliseren. Winkel bij RT.
4. Glijdende motiliteitstest (GMA)
- Bereid een stroomkamer voor door twee stroken dubbelzijdige tape, gescheiden door 5 mm, op een glazen schuif te bevestigen. Herhaal dit proces totdat elke strip drie lagen tape bevat.
- Plaats een coverslip op de tape en druk vervolgens zachtjes op de coverslip / tape-interface met een pincet of pen om voldoende hechting te garanderen.
OPMERKING: Het kanaal moet 5 mm breed en 25 mm lang en 300 mm hoog zijn. - Pipetteer 30 μL 1 mm kinesineoplossing (bereid in stap 3.12) in de stroomcel en laat deze gedurende 5 minuten incuberen.
OPMERKING: De caseïne vormt een dubbellaag op het oppervlak van de coverslip / glasschuif en vergemakkelijkt de bevestiging van de kinesinestaart aan het oppervlak. - Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml microtubulioplossing (bereid in stap 3.13) in de stroomcel, met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 5 min.
- Was de flowcel 1x–3x met 1x motiliteitsoplossing op RT (bereid in stap 3.11).
OPMERKING: Fluorescentiemicroscopie met behulp van een 40x luchtobjectief kan op dit punt worden gebruikt om de aanhechting en beweeglijkheid van microtubuli te bevestigen. Microtubuli verschijnen als fluorescerende filamenten (tientallen micron lang) die met ~0,5 μm/s over het oppervlak bewegen (glijden). - Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml streptavidinoplossing (bereid in stap 3.14) in de stroomcel met behulp van een laboratoriumveeg dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 10 min.
- Laat 30 μL 12x GUV-oplossing (bereid in stap 3.15) in de stroom stromen met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 30 min.
- Voeg 2 μL 100 mM AMP-PNP-oplossing (bereid in stap 3.7) toe om de beweeglijkheid te stoppen en sluit de kamer vervolgens af met kit.
5. LNT-netwerkkarakterisering
- Breng de stroomkamer over naar een omgekeerde microscoop voor beeldvorming.
- Kies de juiste filterset op basis van de golflengten van de gebruikte fluorescerende lipiden of tubuline. Gebruik bijvoorbeeld bij het gebruik van Texas Red-gelabelde lipiden een 560 nm / 25 nm excitatiefilter en een 607 nm / 36 nm emissiefilter.
- Gebruik een 100x olieobjectief om te focussen op het oppervlak van de coverslip.
- Breng de LNT-netwerken in beeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.
OPMERKING: LNT's zijn lineaire structuren die extruderen uit de grotere blaasjes. LNT's zijn veel kleiner dan GUVs en hebben zwakkere fluorescentiesignalen. De belichting en het contrast moeten dus worden aangepast aan de LNT's van afbeeldingen. Deze aanpassingen leiden ook tot overbelichting van de GUVs, en daarom wordt aanbevolen om de lamellriteit en fasescheiding in GUVs onafhankelijk te karakteriseren. - Richt de microscoop op een interessant netwerk en maak een standaard of betegelde afbeelding.
- Pas de belichtingstijd en neutrale dichtheidsfilters aan om de LNT's in beeld te brengen en de verzadigde belichting van de GUVs te minimaliseren. Verkrijg afbeeldingen in zowel rode als groene kanalen.
OPMERKING: Hier maakt het rode kanaal visualisatie van de Texas-Red lipiden mogelijk, terwijl het groene kanaal visualisatie van de microtubuli mogelijk maakt (bijv. Oregon Green lipiden en HiLyte488 kleurstoffen). - Maak een samengestelde afbeelding door de rode en groene kanalen te bedekken (afbeelding 1).
- Karakterisering van LNT-netwerken door LNT-lengte te meten
- Open de verkregen afbeeldingen met behulp van een beeldanalysesoftware zoals ImageJ.
- Kalibreer de schaal voor de microscoop met behulp van de functie Ingestelde schaal, vul de pixels in op de mm-conversiefactor en klik op OK.
OPMERKING: De conversiefactor is afhankelijk van de microscoop, objectieflens en camera en kan worden verkregen met behulp van een microscoopkalibratiedia. Het wordt over het algemeen uitgedrukt in pixels/mm. - Gebruik het gereedschap Meerpuntslijn om de lengte van de nanobuisjes te meten vanaf de bovenliggende GUV. Houd Ctrl +M ingedrukt om de lengte te meten.
- Ga door met het meten van de lengtes van afzonderlijke buizen volgens de bovenstaande stappen. De beeldverwerkingstool slaat elke nieuwe meting op in het resultatenvenster.
- Houd Ctrl + D ingedrukt na het tekenen van elke lijn om bij te houden welke buizen zijn gemeten.
- LNT-dikte meten (figuur 2)
- Open de afbeelding in ImageJ en selecteer de functie Drempel onder het tabblad Afbeelding .
- Klik op Toepassen om de drempel toe te passen.
- Teken een rechthoek van bekende lengte over de gewenste buis (zwarte pixels hebben een waarde van 0 en rode pixels hebben een waarde van 255).
- Meet de geïntegreerde dichtheid van het gebied.
- Deel de dichtheid door de lengte (in pixels) van de LNT om de dikte (in pixels) te verkrijgen.
OPMERKING: De diktemetingen mogen alleen worden vergeleken tussen afbeeldingen wanneer de beeldinstellingen en drempelwaarde identiek zijn ingesteld.
- Bepaling van de lipidepartitionering in knooppunten van LNT's (figuur 3)
- Open de afbeelding in ImageJ.
- Gebruik het gereedschap Lijn om een lijn over het gewenste knooppunt te tekenen.
- Meet de knooppuntintensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.
- Verplaats de lijn naar de LNT en meet de LNT-intensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LNT-netwerken (figuur 4) werden vervaardigd met behulp van het beschreven protocol, dat het werk gebruikt dat wordt uitgevoerd door kinesinetransport van microtubuli om LNT's uit GUVs te extruderen. In het kort werden GUVs bereid met behulp van agarose gel rehydratie met behulp van sucrose-oplossing, en microtubuli werden gepolymeriseerd in GPEM-oplossing en gestabiliseerd in BRB80T. Vervolgens werden kinesinemotoren in een stroomcel geïntroduceerd die een actieve laag motoren op het oppervlak van de coverslip vormde. Microtubuli werden vervolgens geïntroduceerd en een streptavidin-oplossing werd toegevoegd, die de binding tussen de gebiotinyleerde lipiden en GUVs (die vervolgens werden geïntroduceerd) vergemakkelijkte.
Met alle componenten die in de stroomcel aanwezig waren, mochten LNT's zich gedurende 30 minuten vormen, waarna AMP-PNP werd geïntroduceerd om de beweeglijkheid te stoppen. Vervolgens werden de LNT's in beeld gebracht onder een epifluorescentiemicroscoop met behulp van een 100x olieobjectief. LNT's kunnen vrij groot zijn; zo kan een lager aangedreven objectief ook worden gebruikt om grotere LNT's vast te leggen. De LNT-netwerken worden gekenmerkt door dunne, webachtige uitsteeksels die zich uitstrekken van en aansluiten op GUVs. Het aantal en de vertakking van de LNT's is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de dichtheid van microtubuli op het oppervlak, de streptavidinconcentratie en het aantal aanwezige GUVs.
Deze methode kan GUVs en LNT's genereren die zijn samengesteld uit vaste, vloeistof-ongeordende en vloeistofgeordende fasen, evenals fasegescheiden blaasjes die de coëxistentie van deze fasen vertonen over een breed scala van verschillende samenstellingen (figuur 4). Het synthetiseren van blaasjes met 45% verzadigd lipide en 55% onverzadigde lipide resulteert bijvoorbeeld in blaasjes die zich scheiden in naast elkaar bestaande vloeibare ongeordende en vaste fasen. Als cholesterol echter wordt opgenomen, kan de coëxistentie tussen vloeistof en vloeistof worden waargenomen. Een mengsel dat bijvoorbeeld bestaat uit 50% onverzadigde lipiden, 30% cholesterol en 20% verzadigde lipiden, zal GUVs creëren die zich scheiden in naast elkaar bestaande vloeistofgeordende (Lo) en vloeistof-ongeordende (LD) fasen. De opname van cholesterol in deze formulering fluidiseert de verzadigde lipiden, waardoor de vorming van een vloeibare fase mogelijk wordt.
Bovendien werden knooppunten (d.w.z. ronde bolvormige structuren groter dan de LNT's) waargenomen die zich vormden in de fasegescheiden mengsels (figuur 4). Partitionering van lipidetypen binnen nanobuizen en knooppunten kan worden gekarakteriseerd met behulp van de lijnprofieltool om de maximale op de achtergrond afgetrokken piekintensiteit van een knooppunt te vinden. De lijnprofielen van het knooppunt en de LNT werden bepaald en de achtergrondfluorescentie van deze profielen werd afgetrokken om de maximale waarde te bepalen. Partitionering wordt vervolgens berekend door de maximale waarde van de fluorescentie in het knooppunt te delen door de maximale fluorescentiewaarde van de LNT. Deze aanpak maakt de verdeling van lipiden in zowel de LNT als knooppunten die zich vormen in de grotere netwerken mogelijk.
Figuur 1: Samengesteld beeld van LNT's vervaardigd uit GUVs en microtubuli. LNT's worden geëxtrudeerd uit GUVs door beweeglijke microtubuli die bovenop kinesinemotoren glijden. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Drempelproces om dikte te verkrijgen. (A) Selecteer Drempel onder het tabblad Afbeelding | Aanpassen . (B) Pas de drempel toe. (C) Teken een rechthoek van bekende lengte over de gewenste buis. Zwarte pixels hebben een waarde van 0 en rode pixels hebben een waarde van 255. (D) Meet de geïntegreerde dichtheid van het gebied. Om de buisbreedte te berekenen, deelt u de geïntegreerde dichtheid door 255 en deelt u deze uitvoer vervolgens door de lengte van de rechthoek die in (B) is gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bepalen van de lipideverdeling in knooppunten. (A) Open de afbeelding in ImageJ en gebruik het lijngereedschap om een lijn over het gewenste knooppunt te tekenen. (B) Meet de knooppuntintensiteit in het Oregon Green-kanaal. (C) Verplaats de lijn naar de LNT en meet de intensiteit in het Oregon Green-kanaal. (D,E,F) Herhaal het proces voor het Texas Red-kanaal. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: LNT's vervaardigd uit verschillende GUV-lipideformuleringen. LNT's geëxtrudeerd uit de vloeibare ongeordende (LD) fase zijn dun en lang, terwijl LNT's geëxtrudeerd uit de vloeistof geordende (Lo) fase kort en dik zijn. LNT's van beide typen worden waargenomen wanneer Lo-L D fasegescheiden blaasjes worden gebruikt in de GMA. LNT's van vloeibaar-vaste fase-GUVs lijken op die geëxtrudeerd uit LD GUVs. Vloeistofgeordende formuleringen kunnen worden gemaakt met behulp van een combinatie van verzadigde lipiden en cholesterol, terwijl vloeistof-ongeordende formuleringen worden gemaakt met behulp van onverzadigde lipiden. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LNT-netwerken zijn een nuttig hulpmiddel voor in vitro studies naar membraaneigenschappen en het transport van biomoleculen zoals transmembraaneiwitten. Bovendien maakt het gebruik van complexe lipideformuleringen om LNT-netwerken te fabriceren meer biologisch relevante studies mogelijk. Andere fabricagestudies hebben 1) eenvoudige lipideformuleringen en multilamellaire blaasjes of 2) meer omslachtige motiliteitstechnieken gebruikt om netwerken te fabriceren van GUVs die bestaan uit complexe lipideformuleringen. De hier beschreven methode maakt de efficiënte fabricage van grootschalige LNT-netwerken mogelijk uit complexe lipideformuleringen en GUVs en met behulp van goedkope reagentia en apparatuur. Als zodanig biedt deze methodologie de mogelijkheid om een reeks biologische processen te bestuderen, waaronder fasescheiding en membraaneiwittransport. Het protocol maakt gebruik van een in vitro model waarin de samenstelling van de LNT's optimaal kan worden afgestemd om hun biologische analogen (bijv. Golgi-apparaat) te benaderen.
De vorming van LNT-netwerken in de hier beschreven methode heeft tal van voordelen. Microtubuli worden bijvoorbeeld gemakkelijk en snel gepolymeriseerd met behulp van gelyofiliseerde tubuline en ze blijven stabiel op RT gedurende ten minste 1-2 weken wanneer ze worden gestabiliseerd met paclitaxel16. Als zodanig zijn ze eenvoudig te implementeren om de extrusie van LNT's en de vorming van een grootschalig netwerkte stimuleren 1,2. Bovendien kunnen GUVs die zijn samengesteld uit meerdere lipidecomponenten (d.w.z. onverzadigde en verzadigde lipiden en cholesterol) snel worden gevormd op basis van een eerder protocol met kleine wijzigingen. Deze modificaties maken de synthese mogelijk van de GUVs die in staat zijn om het fysisch-chemische proces van membraanfasescheiding te ondergaan. Eenmaal voorbereid, kunnen GUVs weken tot maanden worden bewaard, afhankelijk van de opslagomstandigheden. Het wordt echter aanbevolen om GUVS maximaal 1 maand te gebruiken voordat u een nieuwe batch voorbereidt. Lipide-oplossingen kunnen enkele maanden bij -20 °C of -80 °C worden bewaard, evenals de agarosegel en gecoate coverslips, die maandenlang bij RT kunnen worden bewaard. De lipidefilms op de met agarose gecoate coverslips moeten onder vacuüm worden bewaard en binnen 48 uur worden gerehydrateerd.
Een uitdaging van het gebruik van deze techniek om LNT's van GUVs te vormen, is het balanceren van de concentratie van GUVs, streptavidin en microtubuli in de stroomcel. LNT-vorming zal bijvoorbeeld beperkt zijn als de verhouding tussen microtubuli en GUVs niet correct is. Als de concentratie van GUVs te laag is, zullen zich geen aggregaten vormen, wat de eerste stap is in LNT-vorming. Voor de concentraties van microtubuli en GUV die in dit protocol worden beschreven, resulteerde een 10x verdunning van microtubuli en 12x verdunning van GUV-voorraad over het algemeen in goede LNT-netwerken. Verdunningen van respectievelijk 5x en 6x hebben ook goede netwerken opgeleverd.
Een andere uitdaging is ervoor te zorgen dat de GUV-oplossing osmotisch in balans is met de microtubule-oplossing. Als het verschil in osmolariteit tussen de twee oplossingen te groot is, zullen de GUVs onstabiel worden en mogelijk barsten. Als de oplossingen niet osmotisch in evenwicht zijn (bijvoorbeeld een verschil van 10% tussen de gemeten osmolariteit tussen de twee oplossingen), moet een geconcentreerde (bijv. 2 M) sucrose-oplossing worden gebruikt om de osmolariteit van de oplossing met de lager gemeten osmolariteit te verhogen. Een andere beperking van dit systeem is de stabiliteit van de resulterende LNT-netwerken, die stabiel zijn in de orde van uren en sterk afhankelijk zijn van het continu hydrateren van de stroomkamer (of de kamer afdichten met afdichtmiddel). Zodra de oplossing uit de stroomkamer is verdampt, zullen de LNT's niet langer nuttig zijn, ondanks het feit dat de aanwezigheid van enkele resterende LNT's na verdamping kan aanhouden.
De LNT-netwerken die zijn gemaakt van deze glijdende microtubuli en GUVs kunnen nuttig zijn bij het begrijpen van lipide bilayer-dynamica en eiwitdiffusie (bijv. Transmembraaneiwitten) op membraanoppervlakken. Het hier beschreven protocol kan snel LNT-netwerken creëren die bestaan uit verschillende lipideformuleringen die gemakkelijker biologische LNT-achtige tunneling nanobuizen nabootsen, evenals nanobuizen die worden aangetroffen in membraangebonden organellen (d.w.z. endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat). Het vermogen om grootschalige LNT-netwerken te vormen is een belangrijke eerste stap in de richting van het bestuderen van celcommunicatie, het bestuderen van nanofluïdisch biomolecuultransport en het ontwikkelen van synthetische neuronale netwerken. Dit protocol opent de deur naar bredere studies naar de fysiochemische eigenschappen van LNT's met behulp van een minimaal, in vitro modelsysteem waarin de samenstelling van de LNT's gemakkelijk kan worden gewijzigd om natuurlijke cellulaire structuren na te bootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sandia National Laboratories is een multi-missie laboratorium beheerd en beheerd door National Technology &Engineering Solutions van Sandia, LLC., een volledige dochteronderneming van Honeywell International, Inc., voor de Amerikaanse DOE's National Nuclear Security Administration onder contract DE-NA-0003525. Dit artikel beschrijft objectieve technische resultaten en analyses. Alle subjectieve opvattingen of meningen die in de paper kunnen worden geuit, vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Energie of de regering van de Verenigde Staten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinesynthese en fluorescentiemicroscopie werden uitgevoerd via een gebruikersproject (ZIM) in het Center for Integrated Nanotechnologies, een Office of Science User Facility die wordt beheerd door het Office of Science van het Amerikaanse ministerie van Energie (DOE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
