Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности
Summary
Этот протокол описывает процесс изготовления липидных сетей нанотрубок с использованием скользящей подвижности кинезина в сочетании с гигантскими одноламеллярными липидными везикулами.
Abstract
Сети липидных нанотрубок (LNT) представляют собой модельную систему in vitro для изучения молекулярного транспорта и биофизики липидов с отношением к вездесущим липидным канальцам, обнаруженным в эукариотических клетках. Тем не менее, in vivo LNT являются высоко неравновесными структурами, которые требуют химической энергии и молекулярных двигателей для сборки, обслуживания и реорганизации. Кроме того, состав in vivo LNT является сложным, состоящим из нескольких различных видов липидов. Типичные методы экструзии ЛНТ являются трудоемкими и трудоемкими, и они требуют оптического пинцета, микрошариков и микропипеток для принудительного извлечения нанотрубок из гигантских липидных пузырьков. Здесь представлен протокол для анализа подвижности скольжения (GMA), в котором крупномасштабные сети LNT быстро генерируются из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием подвижности микротрубочек на основе кинезина. Используя этот метод, сети LNT формируются из широкого спектра липидных составов, которые имитируют сложность биологических LNT, что делает их все более полезными для исследований in vitro липидной биофизики и мембранно-ассоциированного транспорта. Кроме того, этот метод способен надежно производить сети LNT за короткое время (<30 мин) с использованием широко используемого лабораторного оборудования. Характеристики сети LNT, такие как длина, ширина и липидное разделение, также настраиваются путем изменения липидного состава ГУВ, используемых для изготовления сетей.
Introduction
Изготовление липидных нанотрубочных сетей (ЛНТ) представляет все больший интерес для исследования in vitro неравновесных липидных структур 1,2,3. Клетки используют липидные канальцы для диффузного транспорта белков4 и нуклеиновых кислот5, а также межклеточной связи 6,7. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи особенно интересны, так как эти мембранно-связанные органеллы являются основными местами синтеза липидов и белков, а также транспорта этих интегральных биомолекул в цитоплазме клетки 8,9. Мембраны этих органелл состоят из нескольких видов липидов, включая сфинголипиды, холестерин и фосфолипиды10, которые в конечном итоге помогают определить их функциональность. Таким образом, чтобы более точно воспроизвести и изучить эти органеллы, LLNT in vitro должны быть изготовлены из везикул со все более сложными липидными составами11.
Гигантские одноламельные везикулы (ГУВ) широко используются для изучения поведения липидных мембран, поскольку они могут быть надежно синтезированы с помощью сложных составов, которые включают холестерин, фосфатидилхолин (ПК), фосфатидилэтаноламин (ПЭ), фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилинозитол (PI)12,13. Здесь описан способ изготовления LNT из ГУВ с различными липидными составами с использованием скользящего анализа подвижности (GMA), в котором LNT экструдируются на основе работы, выполняемой кинезиновыми двигателями и микротрубочками, действующими на ГУВ. В этой системе кинезин-моторные белки, адсорбированные на поверхности, продвигают биотинилированные микротрубочки, превращая химическую энергию от гидролиза АТФ в полезную работу (в частности, экструзию ЛНТ из биотинилированных везикул)11. Полученная сеть LNT предоставляет модельную платформу для изучения влияния различий в липидных фазах на изменения морфологии LNT.
Вкратце, кинезиновые моторные белки вводят в проточную камеру в растворе, содержащем казеин, что позволяет адсорбцию двигателей на стеклянную поверхность камеры. Далее биотинилированные микротрубочки в растворе, содержащем АТФ, протекают через камеру и позволяют связываться с кинезиновыми двигателями и начинать подвижность. Затем раствор стрептавидина вводят в камеру и дают связываться нековалентно с микротрубочками. Наконец, ГУВ, содержащие биотинилированный липид, вводят в камеру и связывают с микротрубочками, покрытыми стрептавидином, а затем экструдируют ЛНТ с образованием крупномасштабных сетей в течение 15-30 мин. Этот метод позволяет получить большие разветвленные сети LNT с использованием стандартного лабораторного оборудования и реагентов по низкой стоимости11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сети LNT являются полезным инструментом для исследований in vitro свойств мембран и транспорта биомолекул, таких как трансмембранные белки. Кроме того, использование сложных липидных составов для изготовления сетей LNT позволяет проводить более биологически значимые исследования. В других…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством энергетики США, Управлением фундаментальных энергетических наук, Отделом материаловедения и инженерии (BES-MSE). Синтез кинезина и флуоресцентная микроскопия были выполнены в рамках пользовательского проекта (ZIM) в Центре интегрированных нанотехнологий, пользовательском объекте Управления науки, управляемом для Управления науки Министерства энергетики США (DOE).
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
