Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности

Published: July 26, 2021 doi: 10.3791/60899
Automatic Translation
1, 1
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

Summary

Этот протокол описывает процесс изготовления липидных сетей нанотрубок с использованием скользящей подвижности кинезина в сочетании с гигантскими одноламеллярными липидными везикулами.

Abstract

Сети липидных нанотрубок (LNT) представляют собой модельную систему in vitro для изучения молекулярного транспорта и биофизики липидов с отношением к вездесущим липидным канальцам, обнаруженным в эукариотических клетках. Тем не менее, in vivo LNT являются высоко неравновесными структурами, которые требуют химической энергии и молекулярных двигателей для сборки, обслуживания и реорганизации. Кроме того, состав in vivo LNT является сложным, состоящим из нескольких различных видов липидов. Типичные методы экструзии ЛНТ являются трудоемкими и трудоемкими, и они требуют оптического пинцета, микрошариков и микропипеток для принудительного извлечения нанотрубок из гигантских липидных пузырьков. Здесь представлен протокол для анализа подвижности скольжения (GMA), в котором крупномасштабные сети LNT быстро генерируются из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием подвижности микротрубочек на основе кинезина. Используя этот метод, сети LNT формируются из широкого спектра липидных составов, которые имитируют сложность биологических LNT, что делает их все более полезными для исследований in vitro липидной биофизики и мембранно-ассоциированного транспорта. Кроме того, этот метод способен надежно производить сети LNT за короткое время (<30 мин) с использованием широко используемого лабораторного оборудования. Характеристики сети LNT, такие как длина, ширина и липидное разделение, также настраиваются путем изменения липидного состава ГУВ, используемых для изготовления сетей.

Introduction

Изготовление липидных нанотрубочных сетей (ЛНТ) представляет все больший интерес для исследования in vitro неравновесных липидных структур 1,2,3. Клетки используют липидные канальцы для диффузного транспорта белков4 и нуклеиновых кислот5, а также межклеточной связи 6,7. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи особенно интересны, так как эти мембранно-связанные органеллы являются основными местами синтеза липидов и белков, а также транспорта этих интегральных биомолекул в цитоплазме клетки 8,9. Мембраны этих органелл состоят из нескольких видов липидов, включая сфинголипиды, холестерин и фосфолипиды10, которые в конечном итоге помогают определить их функциональность. Таким образом, чтобы более точно воспроизвести и изучить эти органеллы, LLNT in vitro должны быть изготовлены из везикул со все более сложными липидными составами11.

Гигантские одноламельные везикулы (ГУВ) широко используются для изучения поведения липидных мембран, поскольку они могут быть надежно синтезированы с помощью сложных составов, которые включают холестерин, фосфатидилхолин (ПК), фосфатидилэтаноламин (ПЭ), фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилинозитол (PI)12,13. Здесь описан способ изготовления LNT из ГУВ с различными липидными составами с использованием скользящего анализа подвижности (GMA), в котором LNT экструдируются на основе работы, выполняемой кинезиновыми двигателями и микротрубочками, действующими на ГУВ. В этой системе кинезин-моторные белки, адсорбированные на поверхности, продвигают биотинилированные микротрубочки, превращая химическую энергию от гидролиза АТФ в полезную работу (в частности, экструзию ЛНТ из биотинилированных везикул)11. Полученная сеть LNT предоставляет модельную платформу для изучения влияния различий в липидных фазах на изменения морфологии LNT.

Вкратце, кинезиновые моторные белки вводят в проточную камеру в растворе, содержащем казеин, что позволяет адсорбцию двигателей на стеклянную поверхность камеры. Далее биотинилированные микротрубочки в растворе, содержащем АТФ, протекают через камеру и позволяют связываться с кинезиновыми двигателями и начинать подвижность. Затем раствор стрептавидина вводят в камеру и дают связываться нековалентно с микротрубочками. Наконец, ГУВ, содержащие биотинилированный липид, вводят в камеру и связывают с микротрубочками, покрытыми стрептавидином, а затем экструдируют ЛНТ с образованием крупномасштабных сетей в течение 15-30 мин. Этот метод позволяет получить большие разветвленные сети LNT с использованием стандартного лабораторного оборудования и реагентов по низкой стоимости11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление стоковых растворов микротрубочек

ВНИМАНИЕ: Защитные очки, перчатки и лабораторное пальто должны всегда носиться на протяжении всего протокола.

  1. Приготовьте 5x буфер BRB80: добавьте 24,19 г PIPES (пиперазин-N,N'-бис[2-этанесульфоновая кислота]) и 0,38 г EGTA (этиленгликоль-бис[β-аминоэтиловый эфир]-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту) в стеклянную бутылку объемом 1 л. Добавьте 1 мл 1 MMgCl2 и отрегулируйте рН до 6,9 с KOH. Добавьте деионизированную воду, чтобы довести раствор до конечного объема 500 мл.
  2. Приготовьте 100 мМ запаса раствора ГТФ: взвесьте 52 мг ГТФ и суспендируйте в 1 мл дистиллированной воды. Разделить 100 мМ раствора на 20 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  3. Приготовить раствор GPEM: смешать 200 мкл 5x BRB80, 10 мкл 100 мМ раствора GTP, 100 мкл 100% глицерина и 600 мкл деионизированной воды. Разделить раствор ГПЕМ на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  4. Готовят раствор микротрубочек путем восстановления флаконов коммерчески доступного, лиофилизированного тубулина (по одному флакону биотинилированного, флуоресцентно меченого и немаркированного) в холодном (4 °C) растворе GPEM с концентрацией запаса 5 мг/мл.
  5. Выполнить полимеризацию микротрубочек путем смешивания 4 мкл биотинилированного тубулина, 4 мкл флуоресцентно меченого тубулина и 24 мкл немаркированного тубулина (все в концентрациях 5 мг/мл) для создания соотношения 1:1:6 при конечном объеме 32 мл. Держите его на льду. Разделить тубулиновую смесь на 2 мкл аликвоты и хранить при -80 °C до тех пор, пока это не понадобится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная полимеризация требует, чтобы концентрация тубулина была равна или выше критической концентрации (5 мг/мл)14. Здесь выбор соотношения тубулинов оптимизирован для достаточной концентрации биотинилированного тубулина для эффективного связывания стрептавидина и ГУВ, а также достаточной концентрации флуоресцентного тубулина для микроскопической характеристики.

2. Подготовка гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ)

  1. Подготовка пленки «Агароза»
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из Greene et al.15.
    1. Готовят 1% мас./об.раствор, смешивая 1 г агарозы в 100 мл деионизированной воды в колбе Эрленмейера по 250 мл. Используйте стандартную микроволновую печь для нагрева раствора агарозы в течение 1–2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор станет полупрозрачным, как только агароза будет полностью растворена. Дайте раствору остыть до 65–75 °C перед использованием.
    2. Используйте нарезанный наконечник пипетки объемом 1000 мкл для пипетки 300–400 мкл раствора агарозы на стеклянной крышке размером 25 мм x 25 мм. Удерживая край чехла пальцами в перчатках, используйте еще один кончик пипетки объемом 1000 мкл, чтобы равномерно распределить расплавленную агарозу по чехлу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание агарозы при температуре 65–75 °C позволит эффективно распределяться по поверхности крышки.
    3. Высушите покрытые агарозой покровные листы в инкубаторе с температурой 37 °C в течение не менее 2 ч, после чего агароза станет прозрачной. Храните крышки, помещая поверхность с агарозным покрытием вверх на чистую поверхность, такую как безворсовая бумага или пленка на основе воска при комнатной температуре (RT).
  2. Липидная формула
    1. Извлеките липиды, растворенные в хлороформе, из морозильной камеры с температурой -20 °C и поместите их в химический вытяжной шкаф, пока они не достигнут RT.
    2. Рассчитать объем липидного запаса каждого компонента липида, необходимого для рецептуры, используя следующую формулу:
      Equation 1
      Где: Vлипид - объем липида для использования, моль % - молярный процент липидного компонента, n - общее количество молей липида, используемого в составе, и M - концентрация липида в молярных единицах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании состава, содержащего 45 моль% 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДОПК) с концентрацией исходного раствора 12,72 мМ и 1 микромоли общих липидов в составе, объем запаса DOPC, используемого в рецептуре, будет составлять:
      Equation 2
    3. Смешайте липиды вместе в расчетном соотношении в стеклянном флаконе в химической вытяжке.
    4. Пипетка 30 мкл липидного раствора на покрытые агарозой покровные листы на предварительно нагретой горячей плите, которая устанавливается выше температуры плавления насыщенного липидного компонента состава (например, конфорка при 50 °C для липида с Tm 40 °C).
    5. Распределите раствор по пленке агарозы круговыми движениями, используя длинный край иглы 18 Г, до тех пор, пока хлороформ не испарится и не образуется однородный слой липидов. Удерживайте край чехла пальцами в перчатках во время выполнения этого шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить слой агарозы иглой.
    6. Поместите крышку с агарозным слоем и липидной пленкой в покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри, пленочную сторону вверх, и поместите чашку Петри в вакуумный осушитель на срок не менее 2 ч для удаления остаточного растворителя.
  3. Тем временем готовят 560 мМ раствора сахарозы, смешивая 1,92 г сахарозы с 10 мл деионизированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация раствора сахарозы зависит от осмолярности буферных ГУВ, в которых разбавляются. Как правило, осмолярность раствора сахарозы должна быть не более чем на 10% больше, чем буфер, в котором будут разбавляться ГУВ, в частности буфер подвижности (см. этап 3.11).
  4. Формирование ГУВ
    1. Прикрепите адгезивную камеру к крышке, покрытой липидной пленкой, осторожно надавливая адгезивную камеру на крышку с липидным покрытием липидной пленкой, обращенной вверх, обеспечивая формирование плотного уплотнения.
    2. Добавьте в камеру 400 мкл раствора сахарозы 560 мМ (приготовленного на стадии 2.3).
    3. Поместите крышку в камеру влажности и закройте крышку.
    4. Поместите камеру влажности на предварительно нагретую конфорку, установленную выше температуры плавления насыщенного липидного компонента состава.
    5. Дайте везикулам сформироваться в течение ≥1 ч до выздоровления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образование везикул может быть проверено с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратной линзой воздушного объектива.

3. Подготовка запасов и реагентов для анализа подвижности

  1. Подготовка казеинового запаса
    1. Добавьте 3 г сухого казеина в коническую центрифужную трубку объемом 50 мл, затем добавьте 30 мл 1x BRB80 и вращайте до тех пор, пока раствор не станет вязким. Центрифугируйте трубку при 15 000 х г в течение 30 мин.
    2. Переложите супернатант в другую коническую центрифужную трубку объемом 50 мл и выбросьте гранулу. Процедите раствор через шприцевой фильтр емкостью 1 мкм, собрав раствор в конический флакон объемом 50 мл. Процедите раствор через фильтр 0,2 мкм, собрав раствор в конический флакон объемом 50 мл.
    3. Определить концентрацию белка путем измерения поглощения при 280 нм с помощью спектрофотометра UV-Vis и кварцевой кюветы.
    4. Рассчитать концентрацию казеина в мг/мл по следующей формуле:
      Equation 3
    5. Раствор развести до 20 мг/мл в 1x BRB80, разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  2. Готовят раствор глюкозооксидазы (2 мг/мл), смешивая 2 мг глюкозооксидазы с 1 мл 1x BRB80. Разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  3. Готовят каталазу (0,8 мг/мл) стоковым раствором, смешивая 0,8 мг каталазы с 1 мл 1x BRB80. Разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  4. Готовят 2 М раствора глюкозы, суспендируя 0,3 г D-глюкозы в 1 мл деионизированной воды. Разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  5. Подготовьте 100 мМ запаса DTT, суспендировав 0,015 г DTT в 1 мл деионизированной воды. Разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  6. Готовят 100 мМ мг-АТФ, суспендируя 0,055 г динатрия АТФ в 1 мл раствора 100 мМMgCl2. Разделить на 100 мкл аликвот и хранить при -20 °C.
  7. Готовят 100 мМ раствора Mg-AMP-PNP, суспендируя 0,055 г AMP-PNP в 1 мл растворе 100 мМ MgCl2, затем делят на 100 мкл аликвот и хранят при -20 °C.
  8. Готовят 100 мМ раствора Тролокса, добавляя 25,03 мг Тролокса в 1 мл метанола и хранят при -20 °C.
  9. Готовят 10 мг/мл раствора стрептавидина, добавляя 1 мг стрептавидина к 100 мкл BRB80, затем делят на 2 мкл аликвоты и хранят при -80ۛ °C.
  10. Готовят BRB90CAT путем смешивания 200 мкл 5x BRB80, 20 мкл раствора казеина, 10 мкл раствора MgATP, 10 мкл Тролокса, 5 мкл раствора паклитаксела и 765 мкл воды DI. Хранить при температуре 4 °C.
  11. Готовят раствор для подвижности, смешивая 192 мкл BRB80CAT, 2 мкл раствора D-глюкозы, 2 мкл раствора глюкозооксидазы, 2 мкл раствора DTT и 2 мкл раствора каталазы. Хранить при температуре 4 °C.
  12. Готовят раствор кинезина 1 мкМ, разбавляя исходный раствор кинезина в BRB80CAT (например, 2 мкл раствора кинезина 50 мМ в 98 мкл BRB80CAT) и хранят при 4 °C.
  13. Готовят раствор микротрубочек 10 мкг/мл путем разбавления 10 мкл стабилизированных микротрубочек в 90 мкл комнатной температуры BRB80CAT. Магазин на RT.
  14. Готовят раствор стрептавидина 10 мкг/мл, добавляя 0,1 мкл раствора стрептавидина 10 мг/мл в 99,9 мкл раствора для подвижности. Хранить при температуре 4 °C.
  15. Готовят 12-кратный раствор ГУВ, разбавляя 5 мкл запаса ГУВ в 55 мкл раствора для подвижности. Хранить при температуре 4 °C.
  16. Полимеризация тубулина в микротрубочки
    1. Собрать предварительно приготовленную 2 мкл аликвоту тубулина из морозильной камеры с температурой -80 °C (приготовленную на стадии 1,5) и поместить на водяную баню с температурой 37 °C на 30 мин.
    2. Готовят раствор паклитаксела 2 мМ, добавляя 1,71 мг паклитаксела в 1 мл безводного ДМСО, делят на 10 мкл аликвот и хранят при -20 °C.
    3. Свежеприготовьте BRB80T, смешав 99,5 мкл 1x BRB80 с 0,5 мкл 2 мМ паклитаксела.  Нагревайте 100 мкл BRB80T до 37 °C на водяной бане.
    4. Через 30 мин добавьте 100 мкл BRB80T в тубулиновую аликвоту для стабилизации микротрубочек. Магазин на RT.

4. Скользящий анализ подвижности (GMA)

  1. Подготовьте проточную камеру, прикрепив две полоски двусторонней ленты, разделенные 5 мм, на стеклянную горку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока три слоя ленты не составят каждую полоску.
  2. Поместите крышку поверх ленты, затем осторожно надавите на интерфейс крышки/ленты пинцетом или ручкой, чтобы обеспечить достаточную адгезию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Канал должен быть 5 мм в ширину, 25 мм в длину и 300 мм в высоту.
  3. Пипетка 30 мкл 1 мм раствора кинезина (приготовленного на стадии 3.12) в проточную клетку и дайте ей инкубироваться в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Казеин образует бислой на поверхности затвора/стеклянного затвора и облегчает прикрепление кинезинового хвоста к поверхности.
  4. Пипетка 30 мкл раствора микротрубочек 10 мкг/мл (приготовленная на стадии 3.13) в проточную ячейку, используя лабораторную салфетку, мягко прижатую к противоположному концу проточного канала для облегчения обмена раствором. Инкубировать в течение 5 мин.
  5. Промыть проточную ячейку 1x–3x 1x раствором подвижности на RT (приготовлено на этапе 3.11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная микроскопия с использованием 40-кратного воздушного объектива может быть использована на этом этапе для подтверждения прикрепления и подвижности микротрубочек. Микротрубочки выглядят как флуоресцентные нити (длиной в десятки микрон), движущиеся (скользящие) по поверхности со скоростью ~ 0,5 мкм / с (рисунок 1).
  6. Пипетка 30 мкл раствора стрептавидина 10 мкг/мл (приготовленного на стадии 3.14) в проточную ячейку с помощью лабораторной салфетки, мягко прижатой к противоположному концу проточного канала для облегчения обмена раствором. Инкубировать в течение 10 мин.
  7. Влить 30 мкл 12-кратного раствора ГУВ (приготовленного на стадии 3.15) в поток с помощью лабораторной салфетки, мягко прижатой к противоположному концу проточного канала для облегчения обмена раствором. Инкубировать в течение 30 мин.
  8. Добавьте 2 мкл 100 мМ раствора AMP-PNP (приготовленного на стадии 3.7), чтобы остановить подвижность, затем запечатайте камеру герметиком.

5. Характеристика сети LNT

  1. Перенесите проточную камеру в инвертированный микроскоп для визуализации.
  2. Выберите соответствующий набор фильтров на основе длин волн используемых флуоресцентных липидов или тубулина. Например, при использовании липидов с маркировкой Texas Red используйте фильтр возбуждения 560 нм/25 нм и эмиссионный фильтр 607 нм/36 нм.
  3. Используйте 100-кратный масляный объектив, чтобы сфокусироваться на поверхности крышки.
  4. Изобразите сети LNT с помощью флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЛНТ представляют собой линейные структуры, выдавливающиеся из более крупных пузырьков. LNT намного меньше, чем GUV, и имеют более слабые флуоресцентные сигналы. Таким образом, экспозиция и контрастность должны быть отрегулированы в соответствии с LNT изображения. Эти корректировки также приводят к передержке ГУВ, и поэтому рекомендуется, чтобы ламеллярность и разделение фаз в ГУВ были охарактеризованы независимо.
  5. Сфокусируйте микроскоп на интересующей сети и сделайте стандартное или мозаичное изображение.
  6. Отрегулируйте время экспозиции и фильтры нейтральной плотности для изображения LNT и сведите к минимуму насыщенную экспозицию GUV. Получайте изображения как в красном, так и в зеленом каналах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь красный канал позволяет визуализировать липиды Texas-Red, в то время как зеленый канал позволяет визуализировать микротрубочки (например, липиды Oregon Green и красители HiLyte488).
  7. Создайте составное изображение, наложив красный и зеленый каналы (рисунок 1).
  8. Характеристика сетей LNT путем измерения длины LNT
    1. Откройте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений, такого как ImageJ.
    2. Откалибруйте шкалу для микроскопа с помощью заданного показателя масштабирования, заполните пикселы до коэффициента преобразования мм и нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент преобразования зависит от микроскопа, объектива и камеры, и его можно получить с помощью калибровочного слайда микроскопа. Обычно он выражается в пикселях/мм.
    3. Используйте инструмент «Многоточечная линия» для измерения длины нанотрубок, начиная с родительского GUV. Удерживайте клавиши CTRL+M , чтобы измерить длину.
    4. Продолжайте измерять длину отдельных трубок, следуя описанным выше шагам. Инструмент обработки изображений будет сохранять каждое новое измерение в окне результатов.
    5. Удерживайте Ctrl + D после рисования каждой линии, чтобы отслеживать, какие трубы были измерены.
  9. Измерение толщины LNT (рисунок 2)
    1. Откройте изображение в ImageJ и выберите функцию «Порог» на вкладке «Изображение ».
    2. Нажмите кнопку Применить , чтобы применить пороговое значение.
    3. Нарисуйте прямоугольник известной длины над нужной трубкой (черные пиксели имеют значение 0, а красные пиксели имеют значение 255).
    4. Измерьте интегральную плотность площади.
    5. Разделите плотность на длину (в пикселях) LNT, чтобы получить толщину (в пикселях).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения толщины могут быть сопоставлены между изображениями только в том случае, если настройки изображения и порог установлены одинаково.
  10. Определение липидного разделения в узлах ЛНТ (рисунок 3)
    1. Откройте изображение в ImageJ.
    2. Используйте инструмент «Линия », чтобы провести линию над нужным узлом.
    3. Измерьте интенсивность узлов как в Орегонском зеленом, так и в Техасском красном каналах.
    4. Переместите линию к LNT и измерьте интенсивность LNT как в Орегонском зеленом, так и в Техасском красном каналах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сети LNT (рисунок 4) были изготовлены с использованием описанного протокола, в котором используется работа, выполняемая кинезин-транспортом микротрубочек для экструзии ЛНТ из ГУВ. Вкратце, ГУВ готовили с использованием регидратации агарозного геля с использованием раствора сахарозы, а микротрубочки полимеризовали в растворе GPEM и стабилизировали в BRB80T. Затем кинезиновые двигатели вводили в проточную ячейку, образуя активный слой двигателей на поверхности покровного листа. Затем вводили микротрубочки и добавляли раствор стрептавидина, который облегчал связывание между биотинилированными липидами и ГУВ (которые впоследствии были введены).

Со всеми компонентами, присутствующими в проточной ячейке, ЛНТ давали сформироваться в течение 30 мин, после чего вводили AMP-PNP, чтобы остановить подвижность. Затем LNT были сфотографированы под эпифлуоресцентным микроскопом с использованием 100-кратного масляного объектива. ЛНТ могут быть довольно большими; таким образом, менее мощный объектив может также использоваться для захвата более крупных ЛНТ. Сети LNT характеризуются тонкими, похожими на паутину выступами, простирающимися от и соединяющими ГУВ. Количество и ветвление ЛНТ зависит от нескольких факторов, включая плотность микротрубочек на поверхности, концентрацию стрептавидина и количество присутствующих ГУВ.

Этот метод может генерировать ГУВ и ЛНТ, состоящие из твердых, жидко-неупорядоченных и жидко-упорядоченных фаз, а также фазовых везикул, которые демонстрируют сосуществование этих фаз в широком диапазоне различных композиций (рисунок 4). Например, синтез везикул с 45% насыщенными липидами и 55% ненасыщенными липидами приводит к везикулам, которые разделяются на сосуществующие жидкие неупорядоченные и твердые фазы. Однако, если включить холестерин, можно наблюдать сосуществование жидкости и жидкости. Например, смесь, состоящая из 50% ненасыщенных липидов, 30% холестерина и 20% насыщенных липидов, будет создавать ГУВ, которые разделяются на сосуществующие фазы жидкого порядка (Lo) и жидко-неупорядоченные (LD). Включение холестерина в эту формулу псевдоожифицирует насыщенные липиды, позволяя образовывать жидкую фазу.

Кроме того, наблюдалось, что узлы (т.е. круглые сферические структуры, превышающие LNT) образуются в фазовых разделенных смесях (рисунок 4). Разбиение липидных типов в нанотрубках и узлах может быть охарактеризовано с помощью инструмента линейного профиля, чтобы найти максимальную фоновую вычитаемую пиковую интенсивность узла. Были определены линейные профили узла и LNT и вычтена фоновая флуоресценция этих профилей для определения максимального значения. Затем секционирование вычисляется путем деления максимального значения флуоресценции в узле на максимальное значение флуоресценции LNT. Этот подход позволяет разделять липиды как в LNT, так и в узлах, которые образуются в более крупных сетях.

Figure 1
Рисунок 1: Составное изображение ЛНЦ, изготовленных из ГУВ и микротрубочек. ЛНТ выдавливаются из ГУВ подвижными микротрубочками, скользящими поверх кинезиновых двигателей. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Пороговый процесс для получения толщины. (A) Выберите «Пороговое значение» на вкладке «Настройка | изображений». (Б) Примените пороговое значение. (C) Нарисуйте прямоугольник известной длины над нужной трубкой. Черные пиксели имеют значение 0, а красные пиксели имеют значение 255. D) измерение интегральной плотности площади. Чтобы вычислить ширину трубки, разделите интегральную плотность на 255, а затем разделите этот выход на длину прямоугольника, созданного в (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Определение липидного разделения в узлах. (A) Откройте изображение в ImageJ и используйте инструмент «Линия», чтобы провести линию над нужным узлом. (B) Измерение интенсивности узла в орегонском зеленом канале. (C) Переместите линию к LNT и измерьте интенсивность в канале Oregon Green. (Д,Е,Ф) Повторите процесс для канала Texas Red. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: ЛНТ, изготовленные из различных липидных составов GUV. LNT, экструдированные из жидкой неупорядоченной (LD) фазы, тонкие и длинные, в то время как LNT, экструдированные из жидкой упорядоченной (Lo) фазы, короткие и толстые. LNT обоих типов наблюдаются, когда lo-L D фазоразделенные везикулы используются в GMA. ЛНТ из жидко-твердофазных ГУВ напоминают экструдированные из ГУВ LD . Жидкие составы могут быть созданы с использованием комбинации насыщенных липидов и холестерина, в то время как жидко-неупорядоченные составы создаются с использованием ненасыщенных липидов. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сети LNT являются полезным инструментом для исследований in vitro свойств мембран и транспорта биомолекул, таких как трансмембранные белки. Кроме того, использование сложных липидных составов для изготовления сетей LNT позволяет проводить более биологически значимые исследования. В других исследованиях по изготовлению использовались либо 1) простые липидные составы и многоламеллярные везикулы, либо 2) более громоздкие методы подвижности для изготовления сетей из ГУВ, состоящих из сложных липидных составов. Метод, описанный здесь, позволяет эффективно изготавливать крупномасштабные сети LNT из сложных липидных составов и ГУВ и с использованием недорогих реагентов и оборудования. Таким образом, эта методология предлагает возможность изучения ряда биологических процессов, включая разделение фаз и перенос мембранного белка. Протокол использует модель in vitro, в которой состав LNT может быть оптимально настроен для аппроксимации их биологических аналогов (например, аппарата Гольджи).

Формирование сетей LNT описанным здесь способом имеет множество преимуществ. Например, микротрубочки легко и быстро полимеризуются с использованием лиофилизированного тубулина, и они остаются стабильными при РТ в течение по меньшей мере 1-2 недель при стабилизации паклитакселом16. Как таковые, они легко реализуются для управления экструзией ЛНТ и формирования крупномасштабных сетей 1,2. Кроме того, ГУВ, состоящие из нескольких липидных компонентов (то есть ненасыщенных и насыщенных липидов и холестерина), могут быть быстро сформированы на основе предыдущего протокола с небольшими изменениями. Эти модификации позволяют синтезировать ГУВ, способные проходить физико-химический процесс разделения мембранных фаз. После подготовки ГУВ могут храниться от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от условий хранения. Однако рекомендуется использовать ГУВС до 1 месяца перед приготовлением новой партии. Липидные растворы могут храниться при -20 °C или -80 °C в течение нескольких месяцев, а также агарозный гель и покрытые покрытием покровные листы, которые могут храниться при RT в течение нескольких месяцев. Липидные пленки на покрытых агарозой покровных листах должны храниться в вакууме и регидратироваться в течение 48 ч.

Одной из проблем использования этого метода для формирования ЛНТ из ГУВ является балансировка концентрации ГУВ, стрептавидина и микротрубочек в проточной ячейке. Например, образование LNT будет ограничено, если соотношение между микротрубочками и ГУВ не является правильным. Если концентрация ГУВ слишком низкая, агрегаты не образуются, что является первым шагом в формировании LNT. Для концентраций микротрубочек и ГУВ, описанных в настоящем протоколе, 10-кратное разбавление запаса микротрубочек и 12-кратное разбавление запаса ГУВ обычно приводили к созданию хороших сетей ЛНТ. Разбавления 5x и 6x, соответственно, также дали хорошие сети.

Другой проблемой является обеспечение того, чтобы раствор GUV был осмотически сбалансирован с раствором микротрубочек. Если разница в осмолярности между двумя решениями слишком велика, ГУВ станут нестабильными и потенциально лопнутыми. Если растворы не осмотически сбалансированы (например, 10% разница между измеренной осмолярностью между двумя растворами), то концентрированный (например, 2 М) раствор сахарозы следует использовать для увеличения осмолярности раствора с более низкой измеренной осмолярностью. Другим ограничением этой системы является стабильность полученных сетей LNT, которые стабильны порядка часов и сильно зависят от непрерывной гидратации (или герметизации камеры герметиком). Как только раствор испарится из проточной камеры, ЛНТ больше не будут полезны, несмотря на то, что присутствие нескольких остаточных ЛНТ может сохраняться после испарения.

Сети LNT, созданные из этих скользящих микротрубочек и ГУВ, могут быть полезны для понимания динамики липидных бислоев, а также диффузии белка (например, трансмембранных белков) на поверхностях мембран. Протокол, описанный здесь, может быстро создавать сети LNT, состоящие из различных липидных составов, которые с большей готовностью имитируют биологические LNT-подобные туннельные нанотрубки, а также нанотрубки, обнаруженные в мембранно-связанных органеллах (то есть эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи). Способность формировать крупномасштабные сети LNT является ключевым первым шагом на пути к изучению клеточной коммуникации, изучению нанофлюидного транспорта биомолекул и разработке синтетических нейронных сетей. Этот протокол открывает двери для более широких исследований физико-химических свойств LNT с использованием минимальной модельной системы in vitro, в которой состав LNT может быть легко изменен для имитации естественных клеточных структур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sandia National Laboratories - это многоцелевая лаборатория, управляемая и управляемая National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC., дочерней компанией Honeywell International, Inc., для Национального управления по ядерной безопасности Министерства энергетики США по контракту DE-NA-0003525. В данной работе описываются объективные технические результаты и анализ. Любые субъективные взгляды или мнения, которые могут быть выражены в документе, не обязательно отражают взгляды Министерства энергетики США или правительства Соединенных Штатов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Министерством энергетики США, Управлением фундаментальных энергетических наук, Отделом материаловедения и инженерии (BES-MSE). Синтез кинезина и флуоресцентная микроскопия были выполнены в рамках пользовательского проекта (ZIM) в Центре интегрированных нанотехнологий, пользовательском объекте Управления науки, управляемом для Управления науки Министерства энергетики США (DOE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Tags

Биоинженерия выпуск 173 биоинженерия липидные нанотрубки кинезин микротрубочки подвижность скольжения разделение фаз
Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imam, Z. I., Bachand, G. D.… More

Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter