Fabrikasjon av Lipid Nanotube-nettverk med flere komponenter ved hjelp av Gliding Kinesin Motility Assay
Summary
Denne protokollen beskriver en prosess for fremstilling av lipid nanorørnettverk ved hjelp av glidende kinesinmotilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesicles.
Abstract
Lipid nanorør (LNT) nettverk representerer et in vitro modellsystem for å studere molekylær transport og lipid biofysikk med relevans for allestedsnærværende lipid tubuli som finnes i eukaryote celler. In vivo LNTs er imidlertid svært likevektsstrukturer som krever at kjemisk energi og molekylære motorer monteres, vedlikeholdes og omorganiseres. Videre er sammensetningen av in vivo LNTs kompleks, bestående av flere forskjellige lipidarter. Typiske metoder for å ekstrudere LNTs er både tids- og arbeidskrevende, og de krever optiske pinsett, mikrober og mikropipetter for å tvinge nanorør fra gigantiske lipid vesikler. Presentert her er en protokoll for glidende motility analyse (GMA), der storskala LNT nettverk er raskt generert fra gigantiske unilamellar vesicles (GUVs) ved hjelp av kinesin-drevet mikrotubule motility. Ved hjelp av denne metoden dannes LNT-nettverk fra et bredt spekter av lipidformuleringer som etterligner kompleksiteten til biologiske LNTs, noe som gjør dem stadig mer nyttige for in vitro-studier av lipidbiofysikk og membranassosidig transport. I tillegg er denne metoden i stand til pålitelig produksjon av LNT-nettverk på kort tid (<30 min) ved hjelp av vanlig brukt laboratorieutstyr. LNT-nettverksegenskaper som lengde, bredde og lipidpartisjonering er også justerbare ved å endre lipidsammensetningen til GUVene som brukes til å fremstille nettverkene.
Introduction
Fabrikasjonen av lipid nanorør (LNT) nettverk er av økende interesse for in vitro undersøkelse av nonequilibrium lipid strukturer 1,2,3. Celler bruker lipid tubuli for diffusiv transport av proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle kommunikasjon 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparatet er spesielt interessant, da disse membranbundne organellene er de primære stedene for lipid- og proteinsyntese samt transport av disse integrerte biomolekylene i cytoplasma i en celle 8,9. Membranene i disse organellene består av flere lipidarter, inkludert sphingolipids, kolesterol og fosfolipider10 som til slutt bidrar til å definere deres funksjonalitet. For å gjenskape og studere disse organellene nærmere, må in vitro LNTs fremstilles fra vesikler med stadig mer komplekse lipidformuleringer11.
Giant unilamellar vesikler (GUVs) brukes gjennomgripende for å studere lipidmembranadferd fordi de på en pålitelig måte kan syntetiseres med komplekse formuleringer som inkluderer kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) og fosfafatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode for å fremstille LNTs fra GUVs med varierende lipidformuleringer ved hjelp av glidende motility analyse (GMA), der LNTs ekstruderes basert på arbeidet utført av kinesinmotorer og mikrotubule filamenter som virker på GUVs. I dette systemet adsorberte kinesinmotorproteiner til en overflate som driver biotinylerte mikrotubuler, og konverterer kjemisk energi fra hydrolysen av ATP til nyttig arbeid (spesielt ekstrudering av LNTs fra biotinylerte vesikler)11. Det resulterende LNT-nettverket gir en modellplattform for å studere effekter av forskjellene i lipidfaser på endringer i LNT-morfologi.
Kort sagt blir kinesinmotorproteiner introdusert i et strømningskammer i en løsning som inneholder kasein, noe som gjør det mulig å adsorpsjon av motorene på glassoverflaten av kammeret. Deretter biotinylerte mikrotubuler i en løsning som inneholder ATP-strømning gjennom kammeret og får lov til å binde seg til kinesinmotorene og begynne motilitet. En streptavidinløsning blir deretter introdusert i kammeret og tillatt å binde ikke-kovalent til mikrotubulene. Til slutt blir GUVer som inneholder en biotinylert lipid introdusert i kammeret og binder seg til de streptavidinbelagte mikrotubulene, og ekstruderer deretter LNTs for å danne store nettverk i løpet av 15-30 minutter. Denne metoden produserer store, forgrenede LNT-nettverk ved hjelp av standard laboratorieutstyr og reagenser til en lav pris11.
Protocol
Representative Results
Discussion
LNT-nettverk er et nyttig verktøy for in vitro-studier til membranegenskaper og transport av biomolekyler som transmembranproteiner. Videre muliggjør bruk av komplekse lipidformuleringer for å fremstille LNT-nettverk mer biologisk relevante studier. Andre fabrikasjonsstudier har brukt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellar vesicles eller 2) mer tungvinte motilitetsteknikker for å fremstille nettverk fra GUVer som består av komplekse lipidformuleringer. Metoden som er beskrevet her muliggjør effektiv fab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesin syntese og fluorescensmikroskopi ble utført gjennom et brukerprosjekt (ZIM) ved Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility som drives for U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
