Summary
Denne protokollen beskriver en prosess for fremstilling av lipid nanorørnettverk ved hjelp av glidende kinesinmotilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesicles.
Abstract
Lipid nanorør (LNT) nettverk representerer et in vitro modellsystem for å studere molekylær transport og lipid biofysikk med relevans for allestedsnærværende lipid tubuli som finnes i eukaryote celler. In vivo LNTs er imidlertid svært likevektsstrukturer som krever at kjemisk energi og molekylære motorer monteres, vedlikeholdes og omorganiseres. Videre er sammensetningen av in vivo LNTs kompleks, bestående av flere forskjellige lipidarter. Typiske metoder for å ekstrudere LNTs er både tids- og arbeidskrevende, og de krever optiske pinsett, mikrober og mikropipetter for å tvinge nanorør fra gigantiske lipid vesikler. Presentert her er en protokoll for glidende motility analyse (GMA), der storskala LNT nettverk er raskt generert fra gigantiske unilamellar vesicles (GUVs) ved hjelp av kinesin-drevet mikrotubule motility. Ved hjelp av denne metoden dannes LNT-nettverk fra et bredt spekter av lipidformuleringer som etterligner kompleksiteten til biologiske LNTs, noe som gjør dem stadig mer nyttige for in vitro-studier av lipidbiofysikk og membranassosidig transport. I tillegg er denne metoden i stand til pålitelig produksjon av LNT-nettverk på kort tid (<30 min) ved hjelp av vanlig brukt laboratorieutstyr. LNT-nettverksegenskaper som lengde, bredde og lipidpartisjonering er også justerbare ved å endre lipidsammensetningen til GUVene som brukes til å fremstille nettverkene.
Introduction
Fabrikasjonen av lipid nanorør (LNT) nettverk er av økende interesse for in vitro undersøkelse av nonequilibrium lipid strukturer 1,2,3. Celler bruker lipid tubuli for diffusiv transport av proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle kommunikasjon 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparatet er spesielt interessant, da disse membranbundne organellene er de primære stedene for lipid- og proteinsyntese samt transport av disse integrerte biomolekylene i cytoplasma i en celle 8,9. Membranene i disse organellene består av flere lipidarter, inkludert sphingolipids, kolesterol og fosfolipider10 som til slutt bidrar til å definere deres funksjonalitet. For å gjenskape og studere disse organellene nærmere, må in vitro LNTs fremstilles fra vesikler med stadig mer komplekse lipidformuleringer11.
Giant unilamellar vesikler (GUVs) brukes gjennomgripende for å studere lipidmembranadferd fordi de på en pålitelig måte kan syntetiseres med komplekse formuleringer som inkluderer kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) og fosfafatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode for å fremstille LNTs fra GUVs med varierende lipidformuleringer ved hjelp av glidende motility analyse (GMA), der LNTs ekstruderes basert på arbeidet utført av kinesinmotorer og mikrotubule filamenter som virker på GUVs. I dette systemet adsorberte kinesinmotorproteiner til en overflate som driver biotinylerte mikrotubuler, og konverterer kjemisk energi fra hydrolysen av ATP til nyttig arbeid (spesielt ekstrudering av LNTs fra biotinylerte vesikler)11. Det resulterende LNT-nettverket gir en modellplattform for å studere effekter av forskjellene i lipidfaser på endringer i LNT-morfologi.
Kort sagt blir kinesinmotorproteiner introdusert i et strømningskammer i en løsning som inneholder kasein, noe som gjør det mulig å adsorpsjon av motorene på glassoverflaten av kammeret. Deretter biotinylerte mikrotubuler i en løsning som inneholder ATP-strømning gjennom kammeret og får lov til å binde seg til kinesinmotorene og begynne motilitet. En streptavidinløsning blir deretter introdusert i kammeret og tillatt å binde ikke-kovalent til mikrotubulene. Til slutt blir GUVer som inneholder en biotinylert lipid introdusert i kammeret og binder seg til de streptavidinbelagte mikrotubulene, og ekstruderer deretter LNTs for å danne store nettverk i løpet av 15-30 minutter. Denne metoden produserer store, forgrenede LNT-nettverk ved hjelp av standard laboratorieutstyr og reagenser til en lav pris11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av lagermikrotubulløsninger
FORSIKTIG: Vernebriller, hansker og labfrakk skal alltid brukes i hele protokollen.
- Forbered 5x BRB80 buffer: tilsett 24,19 g RØR (piperazine-N,N′-bis[2-etesulfonsyre]) og 0,38 g EGTA (etylenglykol-bis[β-aminoetyl eter]-N,N,N,N′-tetraacetic acid) til en 1 L glassflaske. Tilsett 1 ml 1 M MgCl2 og juster pH til 6,9 med KOH. Tilsett deionisert vann for å bringe løsningen til et 500 ml sluttvolum.
- Forbered 100 mM lager av GTP-løsning: vei 52 mg GTP og suspender i 1 ml destillert vann. Del 100 mM oppløsning i 20 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered GPEM-løsning: Bland 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-oppløsning, 100 μL 100% glyserol og 600 μL deionisert vann. Del GPEM-oppløsning i 100 μL aliquots og oppbevar i -20 °C.
- Forbered mikrotubulløsning ved å rekonstituere hetteglass med kommersielt tilgjengelige, lyofiliserte tubulin (ett hetteglass hver av biotinylerte, fluorescerende merkede og umerkede) i kald (4 °C) GPEM-oppløsning til en lagerkonsentrasjon på 5 mg/ml.
- Utfør mikrotubul polymerisering ved å blande 4 μL biotinylert tubulin, 4 μL fluorescerende merket tubulin og 24 μL umerket tubulin (alle ved 5 mg / ml konsentrasjoner) for å skape et forhold på 1: 1: 6 ved et sluttvolum på 32 ml. Hold den på is. Del tubulinblandingen i 2 μL aliquots og oppbevar ved -80 °C til det er nødvendig.
MERK: Effektiv polymerisering krever at konsentrasjonen av tubulin er lik eller over den kritiske konsentrasjonen (5 mg/ml)14. Her er valg av tubulinforholdet optimalisert for en tilstrekkelig konsentrasjon biotinylert tubulin for effektivt å binde streptavidin og GUVs, samt en tilstrekkelig konsentrasjon av fluorescerende tubulin for mikroskopisk karakterisering.
2. Forberedelse av gigantiske unilamellar vesicles (GUVs)
- Agarose film forberedelse
MERK: Denne protokollen er tilpasset greene et al.15.- Forbered en 1% m / v løsning ved å blande 1 g agarose i 100 ml deionisert vann i 250 ml Erlenmeyer kolbe. Bruk en standard mikrobølgeovn til å varme opp agaroseoppløsningen i 1–2 min.
MERK: Oppløsningen blir gjennomskinnelig når agarose er helt oppløst. La oppløsningen avkjøles til 65–75 °C før bruk. - Bruk en kuttet 1000 μL pipettespiss til å pipette 300-400 μL agaroseoppløsning på en 25 mm x 25 mm glassdekslerlip. Mens du holder kanten av dekslene med hanskede fingre, bruk en annen 1000 μL pipettespiss for å spre smeltet agarose jevnt over dekslene.
MERK: Vedlikehold av agarose ved 65–75 °C vil muliggjøre effektiv spredning på dekslene. - Tørk de agarosebelagte dekslene i en 37 °C inkubator i minst 2 timer, og da blir agarose gjennomsiktig. Oppbevar dekslene ved å plassere den agarosebelagte overflaten vendt oppover på en ren overflate, for eksempel lofritt papir eller voksbasert film ved romtemperatur (RT).
- Forbered en 1% m / v løsning ved å blande 1 g agarose i 100 ml deionisert vann i 250 ml Erlenmeyer kolbe. Bruk en standard mikrobølgeovn til å varme opp agaroseoppløsningen i 1–2 min.
- Lipidformulering
- Hent lipider oppløst i kloroform fra en -20 °C fryser og legg dem i en kjemisk avtrekkshette til de når RT.
- Beregn volumet av lipidlager for hver komponent lipid som trengs for formuleringen ved hjelp av følgende formel:
Hvor: Vlipid er volumet av lipid å bruke, mol % er molarprosenten av lipidkomponenten, n er det totale antall mol lipid som brukes i formuleringen, og M er konsentrasjonen av lipid i molarenheter.
MERK: For eksempel, hvis du bruker en formulering som inneholder 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfocholin (DOPC) med en lagerløsningskonsentrasjon på 12,72 mM, og 1 mikromole av totale lipider i formuleringen, vil volumet av DOPC-lager som brukes i formuleringen være:
- Bland lipidene sammen ved det beregnede forholdet i et hetteglass med glass i den kjemiske avtrekkshetten.
- Pipette 30 μL lipidoppløsning på de agarosebelagte dekslene på en forvarmet kokeplate som er satt over smeltepunktet til den mettede lipidkomponenten i formuleringen (f.eks. 50 °C kokeplate for en lipid med Tm på 40 °C).
- Spred løsningen over agarosefilmen i en sirkulær bevegelse ved hjelp av langkanten av en 18 G nål til til kloroformen har fordampet og et jevnt lag lipid har dannet seg. Hold kanten på dekslene med hanskede fingre mens du utfører dette trinnet.
MERK: Det må utvises forsiktighet for ikke å skade agaroselaget med kanylen. - Legg dekslene med agaroselag og lipidfilm i en aluminiumsfoliedekket Petri-tallerken, filmsiden vendt oppover, og legg Petri-parabolen i en vakuumdesiccator i minst 2 timer for å fjerne gjenværende løsningsmiddel.
- I mellomtiden, forberede 560 mM sukrose løsning ved å blande 1,92 g sukrose med 10 ml deionisert vann.
MERK: Konsentrasjonen av sukroseoppløsningen avhenger av osmolariteten til buffer-GUVene fortynnes i. Vanligvis bør osmolariteten til sukroseløsningen ikke være mer enn 10% større enn bufferen GUVene vil bli fortynnet i, spesielt motilitetsbufferen (se trinn 3.11). - GUV-formasjon
- Fest et klebekammer til dekslene som er belagt med lipidfilmen ved å trykke klebekammeret forsiktig på lipidbelagte deksler med lipidfilmen vendt oppover, og sørg for at det dannes en tett forsegling.
- Tilsett 400 μL 560 mM sukroseoppløsning (fremstilt i trinn 2.3) i kammeret.
- Plasser dekslene i fuktighetskammeret og lukk lokket.
- Plasser fuktighetskammeret på en forvarmet kokeplate som er satt over smeltepunktet til den mettede lipidkomponenten i formuleringen.
- Tillat vesicles å danne for ≥1 h før gjenoppretting.
MERK: Vesicleformasjonen kan kontrolleres med fluorescensmikroskopi med en 40x luftmållinse.
3. Utarbeidelse av motilitetsanalyselagre og reagenser
- Utarbeidelse av kasein lager
- Tilsett 3 g tørr kasein til et konisk sentrifugerør på 50 ml, tilsett deretter 30 ml 1x BRB80 og roter til oppløsningen blir viskøs. Sentrifuger røret på 15.000 x g i 30 min.
- Overfør supernatanten til et annet 50 ml konisk sentrifugerør og kast pelletsen. Filtrer løsningen gjennom et 1 μm sprøytefilter, samle løsningen i et 50 ml konisk hetteglass. Filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm filter, samle løsningen i et 50 ml konisk hetteglass.
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 280 nm ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer og kvartscuvette.
- Beregn kaseinkonsentrasjonen i mg/ml ved hjelp av følgende formel:
- Fortynn oppløsningen til 20 mg/ml i 1x BRB80, del i 100 μL aliquots, og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered glukoseoksidase (2 mg / ml) lagerløsning ved å blande 2 mg glukoseoksidase med 1 ml 1x BRB80. Del i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered katase (0,8 mg/ml) lageroppløsning ved å blande 0,8 mg katase med 1 ml 1x BRB80. Del i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered 2 M glukoseoppløsning ved å suspendere 0,3 g D-glukose i 1 ml deionisert vann. Del i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered 100 mM DTT-lager ved å suspendere 0,015 g DTT i 1 ml deionisert vann. Del i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered 100 mM Mg-ATP-lager ved å suspendere 0,055 g disodium ATP i 1 ml oppløsning på 100 mM MgCl2. Del i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered 100 mM Mg-AMP-PNP-oppløsning ved å suspendere ut 0,055 g AMP-PNP i en 1 ml oppløsning på 100 mM MgCl2, del deretter inn i 100 μL aliquots og lagre ved -20 °C.
- Forbered 100 mM Trolox-oppløsning ved å tilsette 25,03 mg Trolox til 1 ml metanol og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered 10 mg/ml streptavidinoppløsning ved å tilsette 1 mg streptavidin til 100 μL BRB80, del deretter inn i 2 μL aliquots og oppbevar ved -80ۛ °C.
- Forbered BRB90CAT ved å blande 200 μL 5x BRB80, 20 μL kaseinoppløsning, 10 μL MgATP-oppløsning, 10 μL Trolox, 5 μL paclitakselløsning og 765 μL DI-vann. Oppbevars ved 4 °C.
- Forbered motilitetsløsningen ved å blande 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glukoseoppløsning, 2 μL glukoseoksidaseoppløsning, 2 μL DTT-løsning og 2 μL katasaseoppløsning. Oppbevars ved 4 °C.
- Forbered en 1 μM kinesinløsning ved å fortynne lagerkinesinoppløsningen i BRB80CAT (f.eks. 2 μL 50 mM kinesinoppløsning i 98 μL BRB80CAT) og oppbevares ved 4 °C.
- Forbered en 10 μg/ml mikrotubulløsning ved å fortynne 10 μL stabiliserte mikrotubuler i 90 μL romtemperatur BRB80CAT. Lagre hos RT.
- Forbered en 10 μg/ml streptavidin-løsning ved å tilsette 0,1 μL 10 mg/ml streptavidinoppløsning i 99,9 μL motilitetsløsning. Oppbevars ved 4 °C.
- Forbered en 12x GUV-løsning ved å fortynne 5 μL GUV-lager i 55 μL motilitetsløsning. Oppbevars ved 4 °C.
- Polymerisering av tubulin i mikrotubuler
- Samle en tidligere tilberedt 2 μL aliquot tubulin fra -80 °C fryser (tilberedt i trinn 1,5) og legg den i et 37 °C vannbad i 30 minutter.
- Forbered en 2 mM paclitaxel-løsning ved å tilsette 1,71 mg paclitaksel i 1 ml vannfri DMSO, del i 10 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C.
- Forbered BRB80T på nytt ved å blande 99,5 μL 1x BRB80 med 0,5 μL 2 ml 2 mM-paklitaksel. Varm 100 μL BRB80T til 37 °C i vannbadet.
- Etter 30 min, legg til 100 μL BRB80T til tubulin aliquot for å stabilisere mikrotubulene. Lagre hos RT.
4. Glidende motilitetsanalyse (GMA)
- Forbered et strømningskammer ved å feste to strimler med dobbeltsidig tape atskilt med 5 mm på en glasssklie. Gjenta denne prosessen til tre lag med tape består av hver stripe.
- Plasser en deksleslip på toppen av båndet, og trykk deretter forsiktig ned på dekslene/tapegrensesnittet med en pinsett eller penn for å sikre tilstrekkelig vedheft.
MERK: Kanalen skal være 5 mm i bredde med 25 mm i lengde med 300 mm i høyden. - Pipette 30 μL 1 mm kinesinoppløsning (fremstilt i trinn 3.12) i strømningscellen og la den inkubere i 5 min.
MERK: Kaseinen danner en bilayer på overflaten av dekslene og letter festingen av kinesinhalen til overflaten. - Pipette 30 μL 10 μg/ml mikrotubulløsning (fremstilt i trinn 3.13) i strømningscellen, ved hjelp av en laboratorieserviett presset forsiktig mot motsatt ende av strømningskanalen for å lette løsningsutveksling. Inkuber i 5 min.
- Vask strømningscellen 1x–3x med 1x motilitetsløsning ved RT (fremstilt i trinn 3.11).
MERK: Fluorescensmikroskopi ved hjelp av et 40x luftmål kan brukes på dette tidspunktet for å bekrefte mikrotubulfeste og bevegelighet. Mikrotubuler vises som fluorescerende filamenter (titalls mikron i lengde) som beveger seg (glir) over overflaten ved ~ 0,5 μm/ s (figur 1). - Pipette 30 μL 10 μg/ml streptavidin-oppløsning (fremstilt i trinn 3.14) i strømningscellen ved hjelp av en laboratorieserviett presset forsiktig mot motsatt ende av strømningskanalen for å lette løsningsutvekslingen. Inkuber i 10 min.
- Strømning 30 μL 12x GUV-løsning (fremstilt i trinn 3.15) i strømmen ved hjelp av en laboratorieserviett presset forsiktig mot motsatt ende av strømningskanalen for å lette løsningsutvekslingen. Inkuber i 30 min.
- Tilsett 2 μL 100 mM AMP-PNP-løsning (fremstilt i trinn 3.7) for å stoppe bevegelighet, og forsegle deretter kammeret med tetningsmasse.
5. LNT-nettverkskarakterisering
- Overfør strømningskammeret til et invertert mikroskop for avbildning.
- Velg riktig filtersett basert på bølgelengdene til fluorescerende lipider eller tubulin som brukes. For eksempel, når du bruker Texas Red-merkede lipider, bruk et 560 nm / 25 nm eksitasjonsfilter og 607 nm / 36 nm utslippsfilter.
- Bruk et 100x oljemål for å fokusere på overflaten av dekslene.
- Bilde LNT-nettverkene ved hjelp av fluorescensmikroskopi.
MERK: LNTs er lineære strukturer som ekstruderer fra de større vesiklene. LNTs mye mindre enn GUVs og har svakere fluorescens signaler. Dermed må eksponeringen og kontrasten justeres tilsvarende bilde-LNTer. Disse justeringene fører også til overeksponering av GUVene, og det anbefales derfor at lamelliteten og faseseparasjonen i GUVer karakteriseres uavhengig. - Fokuser mikroskopet på et nettverk av interesse og ta et standard eller flislagt bilde.
- Juster eksponeringstiden og nøytrale tetthetsfiltre for å avbilde LNTene og minimere mettet eksponering av GUVene. Hent bilder både i røde og grønne kanaler.
MERK: Her tillater den røde kanalen visualisering av Texas-Red lipider, mens den grønne kanalen tillater visualisering av mikrotubulene (f.eks. Oregon Green lipider og HiLyte488 fargestoffer). - Opprett et sammensatt bilde ved å overlappe de røde og grønne kanalene (figur 1).
- Karakterisering av LNT-nettverk ved å måle LNT-lengde
- Åpne de oppkjøpte bildene ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare som ImageJ.
- Kalibrer skalaen for mikroskopet ved hjelp av funksjonen for innstilt skalering, fyll ut bildepunktene til mm-omregningsfaktoren, og klikk OK.
MERK: Omregningsfaktoren avhenger av mikroskopet, objektivlinsen og kameraet, og den kan oppnås ved hjelp av et mikroskopkalibreringssklie. Det uttrykkes vanligvis i piksler / mm. - Bruk multipunktlinjeverktøyet til å måle lengden på nanorørene fra foreldre-GUV. Hold nede CTRL +M for å måle lengden.
- Fortsett å måle lengdene på de enkelte rørene ved å følge trinnene ovenfor. Bildebehandlingsverktøyet lagrer hver nye måling i resultatvinduet.
- Hold nede Ctrl + D etter å ha tegnet hver linje for å holde oversikt over hvilke rør som er målt.
- Måling av LNT-tykkelse (figur 2)
- Åpne bildet i ImageJ, og velg Terskelverdi-funksjonen under Bilde-fanen .
- Klikk Bruk for å bruke terskelen.
- Tegn et rektangel med kjent lengde over ønsket rør (svarte piksler har en verdi på 0, og røde bildepunkter har en verdi på 255).
- Mål den integrerte tettheten i området.
- Del tettheten med lengden (i piksler) på LNT for å oppnå tykkelsen (i piksler).
MERK: Tykkelsesmålingene kan bare sammenlignes på tvers av bilder når bildeinnstillingene og terskelen er angitt identisk.
- Bestemme lipidpartisjoneringen i noder for LNTer (figur 3)
- Åpne bildet i ImageJ.
- Bruk linjeverktøyet til å tegne en linje over ønsket node.
- Mål nodeintensiteten i både Oregon Green- og Texas Red-kanalene.
- Flytt linjen til LNT og mål LNT-intensiteten i både Oregon Green- og Texas Red-kanalene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LNT-nettverk (figur 4) ble fremstilt ved hjelp av den beskrevne protokollen, som bruker arbeidet utført av kinesintransport av mikrotubuler for å ekstrudere LNTs fra GUVer. Kort sagt ble GUVs tilberedt ved hjelp av agarose gel rehydrering ved hjelp av sukroseoppløsning, og mikrotubuler ble polymerisert i GPEM-løsning og stabilisert i BRB80T. Deretter ble kinesinmotorer introdusert i en strømningscelle som danner et aktivt lag av motorer på overflaten av dekslene. Mikrotubuler ble deretter introdusert og en streptavidinløsning ble tilsatt, noe som forenklet bindingen mellom de biotinylerte lipidene og GUVene (som senere ble introdusert).
Med alle komponenter til stede i strømningscellen fikk LNTs lov til å danne i 30 minutter, og da ble AMP-PNP introdusert for å stoppe motilitet. Deretter ble LNT-ene avbildet under et epifluorescensmikroskop ved hjelp av et 100x oljemål. LNTs kan være ganske store; Dermed kan et lavere drevet mål også brukes til å fange større LNTs. LNT-nettverkene er preget av tynne, nettbaserte fremspring som strekker seg fra og kobler til GUVer. Antallet og forgreningen av LNT-ene er avhengig av flere faktorer, inkludert tettheten av mikrotubuler på overflaten, streptavidinkonsentrasjon og antall GUVer til stede.
Denne metoden kan generere GUVer og LNT-er som består av faste, væskeforstyrrelser og væskebestilte faser, samt fasedelte vesikler som viser sameksistensen i disse fasene over et bredt spekter av forskjellige komposisjoner (figur 4). For eksempel resulterer syntetiserende vesikler med 45% mettet lipid og 55% umettet lipid i vesikler som skiller seg inn i sameksistenserende væskeforstyrrelser og faste faser. Hvis kolesterol er inkludert, kan imidlertid væske-flytende sameksistens observeres. For eksempel vil en blanding bestående av 50% umettede lipider, 30% kolesterol og 20% mettede lipider skape GUVer som skiller seg ut i sameksisterende væskebestilte (Lo) og væskeforstyrrelser (LD) faser. Inkorporering av kolesterol i denne formuleringen fluidiserer de mettede lipidene, noe som muliggjør dannelsen av en flytende fase.
Videre ble noder (dvs. runde sfæriske strukturer større enn LNTene) observert for å danne seg i fasedelte blandinger (figur 4). Partisjonering av lipidtyper i nanorør og noder kan karakteriseres ved hjelp av linjeprofilverktøyet var å finne maksimal bakgrunnstrukket toppintensitet for en node. Linjeprofilene til noden og LNT ble bestemt, og bakgrunnsfluorescensen til disse profilene ble trukket fra for å bestemme maksimumsverdien. Partisjonering beregnes deretter ved å dele maksimumsverdien av fluorescensen i noden med den maksimale fluorescensverdien til LNT. Denne tilnærmingen muliggjør partisjonering av lipider i både LNT og noder som dannes i de større nettverkene.
Figur 1: Sammensatt bilde av LNT-er fremstilt av GUVer og mikrotubuler. LNT-er ekstruderes fra GUVer ved at motile mikrotubuler glir på toppen av kinesinmotorer. Skalalinje = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Terskelprosess for å oppnå tykkelse. (A) Velg Terskel under kategorien Bilde | juster . (B) Bruk terskelen. (C) Tegn et rektangel med kjent lengde over ønsket rør. Svarte bildepunkter har en verdi på 0 og røde bildepunkter har en verdi på 255. (D) Måle den integrerte tettheten i området. For å beregne rørbredden, del den integrerte tettheten med 255, og del deretter denne utgangen med lengden på rektanglet som er opprettet i (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemme lipidpartisjoneringen i noder. (A) Åpne bildet i ImageJ og bruk linjeverktøyet til å tegne en linje over ønsket node. (B) Mål nodeintensiteten i Oregon Green-kanalen. (C) Flytt linjen til LNT og mål intensiteten i Oregon Green-kanalen. (D,E,F) Gjenta prosessen for Texas Red-kanalen. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: LNT-er fremstilt fra forskjellige GUV lipidformuleringer. LNTs ekstrudert fra væskeforstyrrelser (LD) fasen er tynn og lang, mens LNTs ekstrudert fra væske bestilt (Lo) fasen er kort og tykk. LNTer av begge typer observeres når Lo-L D fasedelte vesicles brukes i GMA. LNTs fra flytende fastfase GUVs ligner de som ekstruderes fra LD GUVs. Væskebestilte formuleringer kan opprettes ved hjelp av en kombinasjon av mettede lipider og kolesterol, mens væskeforstyrrelser dannes ved hjelp av umettede lipider. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LNT-nettverk er et nyttig verktøy for in vitro-studier til membranegenskaper og transport av biomolekyler som transmembranproteiner. Videre muliggjør bruk av komplekse lipidformuleringer for å fremstille LNT-nettverk mer biologisk relevante studier. Andre fabrikasjonsstudier har brukt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellar vesicles eller 2) mer tungvinte motilitetsteknikker for å fremstille nettverk fra GUVer som består av komplekse lipidformuleringer. Metoden som er beskrevet her muliggjør effektiv fabrikasjon av store LNT-nettverk fra komplekse lipidformuleringer og GUVer og bruk av billige reagenser og utstyr. Som sådan tilbyr denne metodikken muligheten til å studere en rekke biologiske prosesser, inkludert faseseparasjon og membranproteintransport. Protokollen bruker en in vitro-modell der sammensetningen av LNT-ene kan justeres optimalt for å tilnærme seg deres biologiske analoger (f.eks. Golgi-apparatet).
Dannelsen av LNT-nettverk i metoden beskrevet her har mange fordeler. For eksempel polymeriseres mikrotubuler enkelt og raskt ved hjelp av lyofilisert tubulin, og de forblir stabile ved RT i minst 1-2 uker når de stabiliseres med paclitaxel16. Som sådan er de lett implementert for å drive ekstrudering av LNTs og dannelse av et stort nettverk 1,2. I tillegg kan GUVer som består av flere lipidkomponenter (dvs. umettede og mettede lipider og kolesterol) raskt dannes basert på en tidligere protokoll med små modifikasjoner. Disse modifikasjonene muliggjør syntesen av GUVene som er i stand til å gjennomgå den fysiske kjemiske prosessen med membranfaseseparasjon. Når de er forberedt, kan GUVer lagres i uker til måneder, avhengig av lagringsforholdene. Det anbefales imidlertid å bruke GUVS i opptil 1 måned før du forbereder en ny batch. Lipidløsninger kan lagres ved -20 °C eller -80 °C i flere måneder, samt agarosegelen og belagte deksler, som kan lagres hos RT i flere måneder. Lipidfilmene på de agarosebelagte dekslene må lagres under et vakuum og rehydreres innen 48 timer.
En utfordring ved å bruke denne teknikken til å danne LNTs fra GUVs er å balansere konsentrasjonen av GUVer, streptavidin og mikrotubuler i strømningscellen. For eksempel vil LNT-formasjonen være begrenset hvis forholdet mellom mikrotubuler og GUVer ikke er riktig. Hvis konsentrasjonen av GUVer er for lav, vil det ikke dannes aggregater, som er det første trinnet i LNT-formasjon. For konsentrasjonene av mikrotubul og GUV beskrevet i denne protokollen, resulterte en 10x fortynning av mikrotubulbestanden og 12x fortynning av GUV-lager generelt i gode LNT-nettverk. Fortynning av henholdsvis 5x og 6x har gitt gode nettverk.
En annen utfordring er å sikre at GUV-løsningen er osmotisk balansert med mikrotubulløsningen. Hvis forskjellen i osmolaritet mellom de to løsningene er for stor, vil GUVene bli ustabile og potensielt briste. Hvis løsningene ikke er osmotisk balansert (f.eks. en 10% forskjell mellom den målte osmolariteten mellom de to løsningene), bør en konsentrert (f.eks. 2 M) sukroseløsning brukes til å øke osmolariteten til løsningen med lavere målt osmolaritet. En annen begrensning i dette systemet er stabiliteten til de resulterende LNT-nettverkene, som er stabile på timerekkefølgen og svært avhengig av at strømningskammeret kontinuerlig blir hydrert (eller forseglet kammeret med tetningsmasse). Når løsningen har fordampet fra strømningskammeret, vil LNTene ikke lenger være nyttige, til tross for at tilstedeværelsen av noen få gjenværende LNTs kan vedvare etter fordampning.
LNT-nettverkene som er opprettet fra disse glidende mikrotubulene og GUVene, kan være nyttige for å forstå lipidbilayerdynamikk samt protein (f.eks. transmembranproteiner) diffusjon på membranoverflater. Protokollen beskrevet her kan raskt lage LNT-nettverk bestående av ulike lipidformuleringer som lettere etterligner biologiske LNT-lignende tunnelerende nanorør samt nanorør som finnes i membranbundne organeller (dvs. endoplasmisk retikulum og Golgi-apparat). Evnen til å danne store LNT-nettverk er et viktig første skritt mot å studere cellekommunikasjon, studere nanofluid biomolekylær transport og utvikle syntetiske nevronnettverk. Denne protokollen åpner døren til bredere studier på de fysiokjemiske egenskapene til LNTs ved hjelp av et minimalt in vitro-modellsystem der sammensetningen av LNT-ene lett kan modifiseres for å etterligne naturlige cellulære strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sandia National Laboratories er et multi-mission laboratorium administrert og drevet av National Technology &Engineering Solutions of Sandia, LLC., et heleid datterselskap av Honeywell International, Inc., for U.S. DOE's National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-NA-0003525. Dette dokumentet beskriver objektive tekniske resultater og analyser. Eventuelle subjektive synspunkter eller meninger som kan uttrykkes i avisen, representerer ikke nødvendigvis synspunktene til det amerikanske energidepartementet eller usAs regjering.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesin syntese og fluorescensmikroskopi ble utført gjennom et brukerprosjekt (ZIM) ved Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility som drives for U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A.
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
