Summary

Tillverkning av flerkomponent lipidnanorörsnätverk med glidande kinesinmotilitetsanalys

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver en process för tillverkning av lipidnanorörsnätverk med hjälp av glidande kinesinmotilitet i kombination med gigantiska unilamellar lipidblåsor.

Abstract

Lipidnanorörsnätverk (LNT) representerar ett in vitro-modellsystem för att studera molekylär transport och lipidbiofysik med relevans för de allestädes närvarande lipidrören som finns i eukaryota celler. In vivo LNTs är emellertid mycket icke-jämviktsstrukturer som kräver att kemiska energi- och molekylärmotorer monteras, underhålls och omorganiseras. Dessutom är sammansättningen av in vivo LNTs komplex, bestående av flera olika lipidarter. Typiska metoder för att extrudera LNTs är både tids- och arbetskrävande, och de kräver optisk pincett, mikrober och mikropipetter för att med våld dra nanorör från gigantiska lipidblåsor. Här presenteras ett protokoll för glidande motilitetsanalys (GMA), där storskaliga LNT-nätverk snabbt genereras från gigantiska unilamellarblåsor (GUV) med kinesindriven mikrotubulimotilitet. Med hjälp av denna metod bildas LNT-nätverk från ett brett spektrum av lipidformuleringar som efterliknar komplexiteten hos biologiska LNTs, vilket gör dem alltmer användbara för in vitro-studier av lipidbiofysik och membranassocierad transport. Dessutom kan denna metod på ett tillförlitligt sätt producera LNT-nätverk på kort tid (<30 min) med hjälp av vanligt förekommande laboratorieutrustning. LNT-nätverksegenskaper som längd, bredd och lipidpartitionering är också avstämbara genom att ändra lipidsammansättningen hos DE GUV: er som används för att tillverka nätverken.

Introduction

Tillverkningen av lipidnanorörsnätverk (LNT) är av ökande intresse för in vitro-undersökning av icke-jämviktslipidstrukturer 1,2,3. Celler använder lipidrör för diffusiv transport av proteiner4 och nukleinsyror5 samt cell-till-cell-kommunikation 6,7. Den endoplasmatiska retikulum- och Golgi-apparaten är särskilt intressanta, eftersom dessa membranbundna organeller är de primära platserna för lipid- och proteinsyntes samt transport av dessa integrerade biomolekyler inom cytoplasman i en cell 8,9. Membranen i dessa organeller består av flera lipidarter inklusive sfingolipider, kolesterol och fosfolipider10 som i slutändan hjälper till att definiera deras funktionalitet. För att närmare replikera och studera dessa organeller måste in vitro LNT tillverkas från vesiklar med alltmer komplexa lipidformuleringar11.

Jätte unilamellar vesiklar (GUVs) används genomgripande för att studera lipidmembranbeteende eftersom de kan syntetiseras på ett tillförlitligt sätt med komplexa formuleringar som inkluderar kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) och fosfatidylinositol (PI)12,13. Här beskrivs en metod för att tillverka LNTs från GUV med varierande lipidformuleringar med hjälp av glidmotilitetsanalysen (GMA), där LNTs extruderas baserat på det arbete som utförs av kinesinmotorer och mikrotubulifilament som verkar på GUV. I detta system driver kinesinmotorproteiner adsorberade till en yta biotinylerade mikrotubuli och omvandlar kemisk energi från hydrolysen av ATP till användbart arbete (specifikt extrudering av LNTs från biotinylerade vesiklar)11. Det resulterande LNT-nätverket tillhandahåller en modellplattform för att studera effekter av skillnaderna i lipidfaser på förändringar i LNT-morfologi.

Kortfattat införs kinesinmotorproteiner i en flödeskammare i en lösning innehållande kasein, vilket möjliggör adsorption av motorerna på kammarens glasyta. Därefter strömmar biotinylerade mikrotubuli i en lösning innehållande ATP genom kammaren och får binda till kinesinmotorerna och börja motilitet. En streptavidinlösning införs sedan i kammaren och får binda icke-kovalent till mikrotubuli. Slutligen införs GUV som innehåller en biotinylerad lipid i kammaren och binder till de streptavidinbelagda mikrotubuli, sedan extruderar LNTs för att bilda storskaliga nätverk under 15–30 min. Denna metod producerar stora, grenade LNT-nätverk med standard laboratorieutrustning och reagenser till en låg kostnad11.

Protocol

1. Beredning av stammikrotubulilösningar VARNING: Skyddsglasögon, handskar och en labbrock bör alltid bäras i hela protokollet. Förbered 5x BRB80-buffert: tillsätt 24,19 g PIPES (piperazin-N,N′-bis[2-etansulfonsyra]) och 0,38 g EGTA (etylenglykol-bis[β-aminoetyleter]-N,N,N′,N′-tetraättiksyra) till en 1 L glasflaska. Tillsätt 1 ml 1 M MgCl2 och justera pH till 6,9 med KOH. Tillsätt avjoniserat vatten för att få lösningen till en slutlig volym på 500 ml.<…

Representative Results

LNT-nätverk (figur 4) tillverkades med hjälp av det beskrivna protokollet, som använder det arbete som utförs av kinesintransport av mikrotubuli för att extrudera LNTs från GUV. Kortfattat framställdes GUV med användning av agarosgelrehydrering med användning av sackaroslösning, och mikrotubuli polymeriserades i GPEM-lösning och stabiliserades i BRB80T. Därefter infördes kinesinmotorer i en flödescell som bildade ett aktivt lager av motorer på ytan av täckglaset. Mikrotubuli …

Discussion

LNT-nätverk är ett användbart verktyg för in vitro-studier av membranegenskaper och transport av biomolekyler såsom transmembranproteiner. Dessutom möjliggör användning av komplexa lipidformuleringar för att tillverka LNT-nätverk mer biologiskt relevanta studier. Andra tillverkningsstudier har använt antingen 1) enkla lipidformuleringar och multilamellarblåsor eller 2) mer besvärliga rörlighetstekniker för att tillverka nätverk från GUVs som består av komplexa lipidformuleringar. Metoden som beskrivs h?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntes och fluorescensmikroskopi utfördes genom ett användarprojekt (ZIM) vid Center for Integrated Nanotechnologies, en Office of Science User Facility som drivs för U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.

Materials

100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Play Video

Cite This Article
Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

View Video