Tillverkning av flerkomponent lipidnanorörsnätverk med glidande kinesinmotilitetsanalys
Summary
Detta protokoll beskriver en process för tillverkning av lipidnanorörsnätverk med hjälp av glidande kinesinmotilitet i kombination med gigantiska unilamellar lipidblåsor.
Abstract
Lipidnanorörsnätverk (LNT) representerar ett in vitro-modellsystem för att studera molekylär transport och lipidbiofysik med relevans för de allestädes närvarande lipidrören som finns i eukaryota celler. In vivo LNTs är emellertid mycket icke-jämviktsstrukturer som kräver att kemiska energi- och molekylärmotorer monteras, underhålls och omorganiseras. Dessutom är sammansättningen av in vivo LNTs komplex, bestående av flera olika lipidarter. Typiska metoder för att extrudera LNTs är både tids- och arbetskrävande, och de kräver optisk pincett, mikrober och mikropipetter för att med våld dra nanorör från gigantiska lipidblåsor. Här presenteras ett protokoll för glidande motilitetsanalys (GMA), där storskaliga LNT-nätverk snabbt genereras från gigantiska unilamellarblåsor (GUV) med kinesindriven mikrotubulimotilitet. Med hjälp av denna metod bildas LNT-nätverk från ett brett spektrum av lipidformuleringar som efterliknar komplexiteten hos biologiska LNTs, vilket gör dem alltmer användbara för in vitro-studier av lipidbiofysik och membranassocierad transport. Dessutom kan denna metod på ett tillförlitligt sätt producera LNT-nätverk på kort tid (<30 min) med hjälp av vanligt förekommande laboratorieutrustning. LNT-nätverksegenskaper som längd, bredd och lipidpartitionering är också avstämbara genom att ändra lipidsammansättningen hos DE GUV: er som används för att tillverka nätverken.
Introduction
Tillverkningen av lipidnanorörsnätverk (LNT) är av ökande intresse för in vitro-undersökning av icke-jämviktslipidstrukturer 1,2,3. Celler använder lipidrör för diffusiv transport av proteiner4 och nukleinsyror5 samt cell-till-cell-kommunikation 6,7. Den endoplasmatiska retikulum- och Golgi-apparaten är särskilt intressanta, eftersom dessa membranbundna organeller är de primära platserna för lipid- och proteinsyntes samt transport av dessa integrerade biomolekyler inom cytoplasman i en cell 8,9. Membranen i dessa organeller består av flera lipidarter inklusive sfingolipider, kolesterol och fosfolipider10 som i slutändan hjälper till att definiera deras funktionalitet. För att närmare replikera och studera dessa organeller måste in vitro LNT tillverkas från vesiklar med alltmer komplexa lipidformuleringar11.
Jätte unilamellar vesiklar (GUVs) används genomgripande för att studera lipidmembranbeteende eftersom de kan syntetiseras på ett tillförlitligt sätt med komplexa formuleringar som inkluderar kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) och fosfatidylinositol (PI)12,13. Här beskrivs en metod för att tillverka LNTs från GUV med varierande lipidformuleringar med hjälp av glidmotilitetsanalysen (GMA), där LNTs extruderas baserat på det arbete som utförs av kinesinmotorer och mikrotubulifilament som verkar på GUV. I detta system driver kinesinmotorproteiner adsorberade till en yta biotinylerade mikrotubuli och omvandlar kemisk energi från hydrolysen av ATP till användbart arbete (specifikt extrudering av LNTs från biotinylerade vesiklar)11. Det resulterande LNT-nätverket tillhandahåller en modellplattform för att studera effekter av skillnaderna i lipidfaser på förändringar i LNT-morfologi.
Kortfattat införs kinesinmotorproteiner i en flödeskammare i en lösning innehållande kasein, vilket möjliggör adsorption av motorerna på kammarens glasyta. Därefter strömmar biotinylerade mikrotubuli i en lösning innehållande ATP genom kammaren och får binda till kinesinmotorerna och börja motilitet. En streptavidinlösning införs sedan i kammaren och får binda icke-kovalent till mikrotubuli. Slutligen införs GUV som innehåller en biotinylerad lipid i kammaren och binder till de streptavidinbelagda mikrotubuli, sedan extruderar LNTs för att bilda storskaliga nätverk under 15–30 min. Denna metod producerar stora, grenade LNT-nätverk med standard laboratorieutrustning och reagenser till en låg kostnad11.
Protocol
Representative Results
Discussion
LNT-nätverk är ett användbart verktyg för in vitro-studier av membranegenskaper och transport av biomolekyler såsom transmembranproteiner. Dessutom möjliggör användning av komplexa lipidformuleringar för att tillverka LNT-nätverk mer biologiskt relevanta studier. Andra tillverkningsstudier har använt antingen 1) enkla lipidformuleringar och multilamellarblåsor eller 2) mer besvärliga rörlighetstekniker för att tillverka nätverk från GUVs som består av komplexa lipidformuleringar. Metoden som beskrivs h?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntes och fluorescensmikroskopi utfördes genom ett användarprojekt (ZIM) vid Center for Integrated Nanotechnologies, en Office of Science User Facility som drivs för U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.
Materials
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles – a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
