Summary
Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel staan oligodendrocyten bekend om hun rol in axonmyelinatie, die de voortplanting van actiemogelijkheden versnelt door middel van zoutotoergedrag. Bovendien, een toenemend aantal rapporten suggereren dat oligodendrocyten interageren met neuronen buiten myelinatie, met name door de afscheiding van oplosbare factoren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee zuivering van oligodendrogliale afstammingscellen uit gliacelculturen ook astrocyten en microgliale cellen bevat. De methode is gebaseerd op 's nachts schudden bij 37 °C, waardoor selectieve onthechting van de bovenliggende oligodendrogliale cellen en microgliacellen, en de eliminatie van microglia door differentiële hechting. Vervolgens beschrijven we de cultuur van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM). We bieden ook de kinetiek van OCM behandeling of oligodendrocyten naast gezuiverde hippocampal neuronen in co-cultuur experimenten, het bestuderen van oligodendrocyte-neuron interacties.
Introduction
Oligodendrocyten (OLs) zijn gliacellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die myeline wikkelen rond axonen genereren. OLs zijn afkomstig van oligodendrocyte precursorcellen (OPC's) die zich vermenigvuldigen binnen de ventriculaire zones van de embryonale CNS en vervolgens migreren en differentiëren tot volledig volwassen OLs (d.w.z. myelinevormende cellen)1. OPC's zijn overvloedig aanwezig tijdens de vroege ontwikkeling, maar ook blijven bestaan in de volwassen hersenen waar ze vertegenwoordigen de belangrijkste proliferative cel bevolking2. Een enkele OL ensheathes meerdere axonen in niet-prikkelbare secties (dat wil zeggen, internodes), en de rand van elke myeline lus hecht aan de axon vormen van het paranodale domein dat cruciaal is voor de isolerende eigenschappen van myeline1,3. Tussen de paranodes zijn kleine ongeelde gaten genaamd de knooppunten van Ranvier. Deze knooppunten zijn rijk aan voltage-gated natriumkanalen (Nav), waardoor de regeneratie en snelle verspreiding van actiemogelijkheden door middel van saltatory geleiding4. Deze nauwe interactie maakt ook axonale energieondersteuning mogelijk door middel van neuronale opname van lactaat van OLs5,6.
De rijping van oligodendrogliale lineagecellen en het myelinatieproces worden strak gereguleerd door hun interacties met neuronen7. Inderdaad, OLs en OPC's, ook wel NG2-cellen, uitdrukken een scala aan receptoren voor neurotransmitters, en kan input ontvangen van excitatory en remmende neuronen, waardoor ze neuronale activiteit die hun proliferatie en / of differentiatie kan leiden tot myeliniserende cellen2voelen. Op zijn beurt scheiden OPC's/OLs microvesicles en eiwitten af in de extracellulaire ruimte die alleen al neuromodulatieve en neuroprotectieve functies8,9,10,11,12bemiddelt. De moleculaire mechanismen die de verschillende vormen van interacties tussen oligodererogliale lineagecellen en neuronen regelen, moeten echter nog volledig worden ontcijferd.
Bovendien worden ols in verschillende CNS-pathologische omstandigheden voornamelijk beïnvloed, waardoor hun interactie met neuronen wordt verstoord. Bijvoorbeeld, bij Multiple Sclerose (MS), neurologische disfunctie wordt veroorzaakt door focale demyelinatie in de CNS, secundair aan OLs verlies dat kan leiden tot axonale schade en aanverwante invaliditeitaccumulatie. Remyelinatie kan plaatsvinden, zij het onvoldoende in de meeste gevallen13. Vooruitgang in het afgelopen decennium, als gevolg van de ontwikkeling van immunotherapieën, hebben het terugvalpercentage verminderd, maar het bevorderen van remyelinatie blijft tot op heden een onvervulde behoefte. Als zodanig is een beter begrip van ols-rol, functies en invloeden van bijzonder belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor een breed spectrum van CNS-aandoeningen.
Hier beschrijven we de methoden van OLs zuivering en cultuur. Dit maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk van intrinsieke mechanismen die hun ontwikkeling en biologie reguleren. Bovendien maken dergelijke hoogverrijkte OLs-culturen de productie mogelijk van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM), dat kan worden toegevoegd aan gezuiverde neuronculturen om inzicht te krijgen in de impact van OLs-geafscheideerde factoren op neuronale fysiologie en connectiviteit. Verder beschrijven we hoe we een in vitro co-cultuursysteem implementeren waarbij gezuiverde oligodendrocyten en neuronen worden gecombineerd, waardoor de mechanismen die (her)myelinatie reguleren, kunnen worden aangepakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De zorg en het gebruik van ratten in dit experiment is in overeenstemming met het institutionele beleid en de richtlijnen (UPMC, INSERM en Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschap). Het volgende protocol is ingesteld voor een standaard nest van 12 pups.
1. Bereiding van de kolven (~5 min)
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit de dag voor de dissectie in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Bestrijk de 150 cm2 kolven (T150) met filterdop (1 kolf voor 2 pups) met 5 mL polyethyleen (PEI, 100 mg/L, zie protocol in aanvullend dossier 1).
- Bewaar de kolven 's nachts op 4 °C.
- Spoel gecoate kolven 3 keer af met steriel gedestilleerd water op de dag van dedissectie.
2. Voorbereiding van de media (~ 10 min)
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Bereid 500 mL kweekmedium voor, bestaande uit Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en penicilline-streptomycine (100 IU/mL).
- Bereid 20,6 mL van het enzymverteringmedium voor in een 50 mL-buis, bestaande uit 20 mL DMEM, 200 μL DNase (50 μg/mL), 200 μL papaïne (30 U/mL) en 200 μL L-cysteïne (0,24 mg/mL).
- Filter de media steriliseren met behulp van een 0,22 μm-filter.
- Houd de media in de laminaire stroomkap op kamertemperatuur (RT) tot dissectie.
3. Voorbereiding op dissectie (~10 min)
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Bereid 100 mL fosfaatgebufferde zoutlijn voor zonder calcium en magnesium (PBS; 1x). Filtersteriliseren met behulp van een 0,22 μm filter.
- Bereid 50 mL ijskoude 1x PBS-oplossing voor, aangevuld met 750 μL glucose. Filtersteriliseren met behulp van een 0,22 μm filter.
- Vul een 100 mm petrischaal met 1x PBS voor reinigingsinstrumenten en drie 60 mm petrischaaltjes met ijskoude PBS-glucose voor weefseloogst. Zet de petrischaaltjes op ijs tot het ontleding.
4. Dissectie
OPMERKING: Dissectie wordt uitgevoerd van mannelijke en vrouwelijke Wistar rat pups op postnatale dag (P) 2.
- Om een steriele omgeving te bieden, zorg ervoor dat de bank schoon met 100% ethanol. Steriliseer alle chirurgische gereedschappen met 100% ethanol.
- Spuit voorzichtig de hals van de pup met 70% ethanol.
- Gebruik grote chirurgische schaar om het dier te onthoofden en plaats het hoofd in een 100 mm petrischaal met ijskoude PBS-glucose.
- Gebruik gebogen tangen om het hoofd van het dier op ooghoogte te houden. Gebruik kleine chirurgische schaar om een kleine incisie te maken aan de basis van de schedel en snijd de schedel na de middellijn van de hersenen.
- Gebruik tangen om de twee delen van de schedel voorzichtig van de middellijn af te pellen.
- Gebruik een kleine chirurgische lepel om de hersenen te verwijderen uit de hoofdholte. Doe de hersenen in een petrischaal van 60 mm met ijskoude PBS-glucose op ijs.
- Bekijken onder een steromicroscoop, gebruik fijne tangen om de cerebellum, de hersenstam en reukbollen te verwijderen uit hersenhelften.
- Gebruik fijne tangen om de twee hersenhelften te scheiden. Gebruik fijne tangen om de hersenvliezen af te pellen. Doe de cerebrale cortices in een 60 mm-petrischaaltje op ijs.
OPMERKING: IJskoude PBS is cruciaal voor het correct verwijderen van hersenvliezen.
5. Weefseldissociatie
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Gebruik een scherpe scalpel om de cerebrale cortices fijn te hakken. Breng het gehakte weefsel over in een buis van 50 mL die enzymverteringmedium bevat.
- Incubeer gedurende 30 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Gebruik een p1000 micropipet om het spijsverteringsmedium van het enzym voorzichtig te verwijderen en ervoor te zorgen dat het corticale weefsel aan de onderkant van de 50 mL-buis blijft.
- Gebruik een p1000 micropipetom om 1 mL DMEM-10% FCS toe te voegen en het weefsel voorzichtig te trituraleren.
- Gebruik een 70 μm filter en een zuiger van een 1 mL spuit om het corticale weefsel te filteren in een buis van 50 mL.
LET OP: Men kan restweefsel op de binnenbuiswand meerdere malen spoelen met DMEM-10% FCS. - Vul de 50 mL buis met DMEM-10%FCS. Centrifugeer bij 423 x g voor 5 min bij RT. Verwijder supernatant en breg de celpellet met 2 mL DMEM-10%FCS opnieuw op.
- Voorzichtig triturate celpellet met een p1000 micropipet en vervolgens met een p200 micropipette. Verdun de celvering met het juiste volume DMEM-10%FCS.
LET OP: Twee hersenen = een T150 = 5 mL DMEM-10%FCS. - Plaat 5 mL van de celvering op een T150 met een dichtheid van 1 x 105 cellen/cm2. Voeg 20 mL warme DMEM-10%FCS toe aan elke T150. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Vernieuw de helft van het kweekmedium na 6 dagen in vitro (DIV) met warme DMEM-10%FCS.
6. Schudden voorbereiding
- Voer schudden voorbereiding op de dag voor het schudden in een laminaire stroom kap onder steriele omstandigheden.
- Vernieuw de helft van het kweekmedium door vers warm kweekmedium in de kolf toe te voegen en uit te broeden bij 37 °C onder 5% CO2.
7. Schudden
- Bestrijk drie 100 mm petrischaaltjes met PEI. Bewaar ze 's nachts op 4 °C.
- Bedek de kolven met paraffinefolie en doe de kolven in een plastic zak. Schud kolven met gliacellen 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C.
OPMERKING: Eerste schudden wordt uitgevoerd op 8 DIV en men kan uitvoeren tot drie verschillende schudden (zie figuur 1 voor timing).
8. OL-lijncellen oogsten en cultuur
OPMERKING: Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Op de dag na het schudden, bereid Bottenstein-Sato (BS) medium volgens tabel 1.
- Spoel gecoate petrischaaltjes 3 keer af met steriel gedestilleerd water.
- Oogst de supernatant van de kolven met voornamelijk OL-lineagecellen, maar ook enkele microgliale cellen en plaat het op niet-gecoate 100 mm petrischaaltjes.
OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk microgliale cellen te verwijderen door middel van differentiële snelle hechting op het oppervlak van de schotel. - Bebroed de petrischaaltjes gedurende 15 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Vul elke T150-kolf met 25 mL warm vers bereid kweekmedium en incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2 tot de tweede shake.
- Breng de supernatant van de petrischaaltjes over in nieuwe niet-gecoate 100 mm petrischaaltjes om hechting van resterende microgliale cellen mogelijk te maken.
- Bebroed de petrischaaltjes gedurende 15 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Verwijder de supernatant, die niet-aanhangende OL-lineagecellen bevat, en breng deze over in 50 mL-buizen (supernatant uit 2 petrischaaltjes voor een buis van 50 mL). Gooi petrischaaltjes verguld met microglia.
- Centrifugeer de supernatant gedurende 5 min bij 423 x g. Verwijder supernatant en breg de celpellet met 1 mL BS medium voorzichtig. Bundel alle pellets in een gemeenschappelijke 50 mL buis en pas het volume aan tot 10 mL met BS medium.
- Bepaal celdichtheid tellencellen onder een microscoop.
OPMERKING: Er moet een celdichtheidtussen 3 x 10 5/mL en 5 x 105/mLworden verkregen. - Voeg 20 mL BS toe als de celdichtheid hogeris dan of gelijk is aan 4 x 10 5/mL om een eindvolume van 30 mL te verkrijgen, of voeg slechts 10 mL BS toe als de celdichtheid minder dan 4 x 105/mLis om een eindvolume van 20 mL te verkrijgen.
- Plaat twee of drie voorgecoate 100 mm petrischaaltjes met 10 mL celvering. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Ruim het puin van de petrischaaltjes door alle BS medium 2 uur later te vernieuwen.
OPMERKING: Onderzoek de cultuur onder de microscoop voor en na het opruimen om de celdichtheid en efficiëntie van het verwijderen van puin te verifiëren. - Incubeer gedurende 2 dagen in BS-medium in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
LET OP: Onderzoek de cultuur onder de microscoop. De samenvloeiing moet 70% tot 80% zijn.
9. OCM-productie
OPMERKING: Voer deze stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
- Bereid NB-B27low medium volgens tabel 2.
- Vernieuw kweekmedium met 10 mL warm NB-B27low medium. Incubeer gedurende 2 dagen in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Oogst de OCM, d.w.z. supernatant met OL uitgescheiden factoren. Filtersteriliseren OCM met behulp van een 0,22 μm filter.
LET OP: Bewaar OCM maximaal 2 maanden bij 4 °C.
10. OCM-toevoeging
OPMERKING: Stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden. OCM kan worden toegevoegd aan gezuiverde hippocampal neuron culturen bereid volgens het volgende protocol14, en verkregen door toe te voegen, 24 uur na isolatie, de anti-mitotische middelen uridine en 5- fluorodeoxyuridine (5 μM) voor 36 uur.
- Verwijder bij 3 DIV alle neuron kweekmedium met anti-mitotische middelen en voeg 500 μL verse warme OCM toe.
- Vernieuw de helft van het medium om de 3 dagen met vers gemaakte warme NB-B27.
LET OP: Dergelijke culturen kunnen tot 21 DIV worden gehandhaafd.
11. Toevoeging van OL aan gezuiverde hippocampal neuron cultuur
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden. OLs kunnen worden toegevoegd aan gezuiverde hippocampal culturen verkregen op dezelfde manier als hierboven beschreven.
- Bereid co-cultuur medium volgens tabel 3.
- Haal de OL-cultuur op 70% tot 80% samenvloeiing. Spoel af met 2 mL warme 1x PBS.
- Om de cellen los te maken, voegt u 2 mL van 0,25% trypsin toe aan een 100 mm petrischaal.
- Incubeer gedurende 5 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.
- Voeg 2 mL DMEM-10% FCS toe om de enzymatische reactie te blokkeren. Oogst het supernatant met OL-lineagecellen.
- Centrifugeer bij RT 423 x g voor 5 min. Verwijder supernatant zorgvuldig en brep de celpellet opnieuw op in warm co-kweekmedium om een concentratie van 1,25 x 105 cellen/mL te verkrijgen.
- Voeg OL toe aan de cultuur van gezuiverde hippocampalneuronen door 200 μL neuron kweekmedium te verwijderen en 200 μL celvering per put (2,5 x 104 cellen/put) van een 24-putplaat toe te voegen.
- Ververs de helft van co-cultuur medium om de 2-3 dagen.
LET OP: Co-culturen kunnen tot 24 DIV worden gehandhaafd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol worden OL-lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Zuiverheid en fenotypische onderzoek van OL-culturen kunnen worden beoordeeld door immunostaining met gliamarkers15. Analyse van de expressie van verschillende markers wees uit dat OL-culturen meestal pre-OLs waren met 90% ± 4% van De O4+ cellen, 85% ± 7% NG2+ cellen en 4,7% ± 2,1% plp+ cellen, terwijl 7,2% ± 2,5% van de cellen GFAP+ astrocyten waren (gemiddelde ± S.D., n = 3; Figuur 2). Bovendien was 4,6% ± 0,7% van de cellen CD11b+ microgliale cellen (gemiddelde ± S.D., niet weergegeven).
OCM geproduceerd uit dergelijke culturen kan worden toegevoegd op 3 DIV aan gezuiverde hippocampal neuron culturen. Deze behandeling bevordert de clustering van nodale eiwitten, bestaande uit Nav kanalen geassocieerd met Neurofascin 186 en Ankyrin G langs de axon van hippocampal GABAergic neuronen voor myelinatie, op 17 DIV (Figuur 3A,B). Van nota, elektrofysiologische opnames bleek dat deze clusters worden geassocieerd met een verhoogde geleiding van de actie potentieel14. Bovendien wordt de expressie van fosforyllated intermediate filament eiwit H gekleurd door Smi31 verhoogd in OCM-behandelde hippocampal neuronen(figuur 3A). Oligodendrogliale geafscheideerde factoren zijn daarom betrokken bij neuronale rijping en fysiologie.
Myelinatie van hippocampal neuronen kan worden bestudeerd door toevoeging van OL op 14 DIV. Van 20 DIV tot 24 DIV, immunostaining van myeline markers, zoals myeline basic protein (MBP) maakt visualisatie van myeline segmenten (figuur 4).
Figuur 1: Protocoltijdlijn van ol-lijncellenisolatie en OCM-productie. Na het ontleden van cerebrale cortices van P2 Wistar ratten (stap 4), uitvoeren weefseldissociatie naar cultuur gliacellen (stap 5). Bij 8, 12 en 15 DIV (d.w.z. dagen voor het schudden), vernieuw half medium met warme DMEM-10% FCS (stap 6). Schud de volgende dag glialculturen 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C (stap 7.2). Oogst supernatant met OL-lineagecellen en weinig microgliacellen en bekeer het gedurende 15 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2 (stappen 8,3 tot 8,7). Centrifugeer de supernatant gedurende 5 min bij 423 x g,schors de celpellet met BS en broed gedurende 2 dagen in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2 (stappen 8,8 tot 8,12). Om OCM te produceren, incubeer je 2 dagen in NB-B27low (stap 9). Als u OL's wilt isoleren voor co-cultuurexperimenten, ontkoppelt u cel met trypsine (stap 11.3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: OL-lijncellen fenotype in culturen. Beelden werden verkregen met behulp van een confocale microscoop. Maximale intensiteitsprojecties worden gepresenteerd. (A) OL-culturen bevatten meestal pre-OLs (d.w.z. het uitdrukken van alleen NG2 (rood), of zowel O4 (groen) als NG2 (rood); cellen die beide markers uitdrukken, zijn aangegeven met gele sterren), maar ook enkele onrijpe OL's (d.w.z. alleen O4 uitdrukken en niet NG2; witte sterren). (B) Weinig volwassen OLs (d.w.z. PLP+; groen) en weinig astrocyten (GFAP+ cellen; rood) zijn te vinden in OL lineage celculturen. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve aanvragen. (A,B) Hippocampal neuronen behandeld met OCM op 3 DIV en vastgesteld op 17 DIV express fosforyllated intermediairfilament eiwit H (Smi31; groen; paneel A). GABAergic neuronen, geïdentificeerd door glutamaat decarboxylase isoform van 67 kDa (GAD67) expressie (wit), display accumulatie van Ankyrin G en Nav natriumkanalen (rood; panelen A en B, respectievelijk) op de axon initiële segment en vormen Ankyrin G en Nav clusters langs hun axon (panelen A en B, respectievelijk). Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve aanvragen. OL lineage cellen toegevoegd aan hippocampal neuron cultuur op 14 DIV myelinte sommige hippocampal axonen, hier vastgesteld op 23 DIV (MBP als myeline marker; groen). Knooppunten van Ranvier (Nav; rood) worden waargenomen tussen myelinesegmenten. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Bottenstein-Sato (BS) media | Eindconcentratie |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicilline-Streptomycine | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin menselijk | 100 μg/mL |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 100 μg/mL |
| Insuline | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| Progesteron | 62 ng/mL |
| Putrescine dihydrochloride | 16 μg/mL |
| Natriumselenite | 40 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Thyroxine) | 40 ng/mL |
Tabel 1: Voorbereiding van Bottenstein-Sato (BS) media.
| NB-B27 lage media | Eindconcentratie |
| Neurobasaal | |
| B27 supplement | 0,5x |
| L-glutamine | 0,5 mM |
| Penicilline-Streptomycine | 100 IU/mL |
| NB-B27 media | Eindconcentratie |
| Neurobasaal | |
| B27 supplement | 1x |
| L-glutamine | 0,5 mM |
| Penicilline-Streptomycine | 100 IU/mL |
Tabel 2: Voorbereiding van NB-B27low en NB-B27 media.
| Co-cultuur media | Eindconcentratie |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | 1 vol |
| Neurobasaal | 1 vol |
| B27 supplement | 1x |
| Penicilline-Streptomycine | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin menselijk | 50 μg/mL |
| Biotine | 10 ng/mL |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 50 μg/mL |
| Ceruloplasmin Ceruloplasmin | 100 ng/mL |
| Hydrocortison | 0,05 μM |
| Insuline | 5 μg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteïne | 5 μg/mL |
| Progesteron | 6,2 ng/mL |
| Putrescin (Putrescin) | 16 μg/mL |
| Recombinant Human CNTF | 0,1 ng/mL |
| Natriumselenite | 5 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout) | 40 ng/mL |
| Vitamine B12 | 27,2 ng/mL |
Tabel 3: Voorbereiding van co-cultuurmedia.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van hoogverrijkte oligodendrogliale lijncelculturen uit gemengde gliaculturen, aangepast aan een eerder gepubliceerde methode16, en de daaropvolgende productie van OL-geconditioneerd medium. Deze schudtechniek is niet duur, kan drie keer worden herhaald en is optimaal om een hoge hoeveelheid gezuiverde OLs te verkrijgen, zoals cellen gekweekt in Bottenstein-Sato (BS) medium met PDGFα vermenigvuldigen. Gliacellen worden bereid met behulp van cerebrale cortices van Wistar ratten op P2, een tijdpunt waarop een overgrote meerderheid van de oligodendrogliale lineage cellen zijn pre-oligodendrocyten uitdrukken NG2 en O415. Van belang, OL-lineage rijping is vergelijkbaar op P2 bij muis en rat, en dit protocol kan ook worden gebruikt om de muis pre-oligodendrocyten17isoleren.
Na het schudden van de gemengde gliacelculturen bestaan vrijstaande cellen voornamelijk uit oligodendrogliale lineagecellen, maar ook enkele microgliale cellen en weinig astrocyten. Microgliale cellen worden verwijderd door differentiële hechting op ongecoate petrischaaltjes. Van belang, verwijdering efficiëntie kan worden verbeterd door het uitvoeren van een extra hechting stap. Echter, ongeveer 5% van de microgliale cellen zijn nog steeds te vinden in verrijkte oligodendroglialcelculturen, evenals 5% tot 9% van de astrocyten. Het is mogelijk om de besmetting van astrocyten tot minder dan 5% te verminderen door een extra immunopanningstap uit te voeren met o4 met antilichamen bedekte petrischalen; zie aanvullende informatie in Freeman et al.14voor een gedetailleerd protocol. Het verwijderen van puin 2 uur na het platen oligodendroglialcellen is een kritieke stap, die afhankelijk is van de sterkte van de stroom toegepast met de pipet. Bij deze stap is het belangrijk om de cultuur onder de microscoop te onderzoeken voor en na het opruimen om de efficiëntie te verifiëren, omdat de aanwezigheid van te veel puin de levensvatbaarheid en groei van de cellen kan schaden. Van belang, is het ook belangrijk om vers gemaakt BS medium te gebruiken, anders zou het oligodendrocyten overleving kunnen veranderen. Bovendien overleven gezuiverde cellen slechts tot 6 dagen na beplating. Inderdaad, het is bekend dat andere gliacellen en neuronen bevorderen OPC overleving en proliferatie of differentiatie door middel van uitgescheiden factoren of directe contacten2,18.
Andere methoden maken OLs-isolatie onmiddellijk na hersendissociatie mogelijk, met behulp van immunolabelling met O4-antilichaam, gevolgd door fluorescerende geactiveerde celsortering op stroomcytometrie (FACS) of magnetisch geactiveerde celsortering (MACS). Bovendien kunnen GFP-positieve OPC's of GFP-positieve oligodendrocyten worden gezuiverd door fluorescerende celsortering van PDGFαR:GFP of PLP:GFP-muizen, respectievelijk19,20. Deze sorteermethoden zijn relevanter voor het bestuderen van fysiologische toestand van oligodendrocyten in vergelijking met culturen behandeld met groeifactoren die hun fenotype kunnen veranderen. Met name fluorescerende celsortering is gebruikt voor genprofilering benaderingen in de normale fysiologische toestand en demyeliniserende omstandigheden21. Aangezien celoverleving kan worden gewijzigd door celsortering, is het beter om functionele testen onmiddellijk na het sorteren uit te voeren.
We hebben aangetoond dat OL culturen kunnen worden losgemaakt en toegevoegd aan gezuiverde hippocampal neuron culturen op 14 DIV. Dergelijke OL-neuron co-cultuur maakt de studie van de vroege stappen van myelinatie die begint tijdens de eerste week van de co-cultuur (Dubessy, ongepubliceerde resultaten). Andere modellen van OL-hippocampal neuron myelinating co-cultuur zijn bereikt door het toevoegen van oligodendrocyten onmiddellijk na het sorteren22,23. Bovendien produceerden we OCM om OL-neuron interacties verder te ontleden en de rol van OL-geafscheideerde factoren op neuronculturen aan te pakken. Door deze techniek te gebruiken, hebben we aangetoond dat hippocampal GABAergic neuron subtypes (d.w.z. parvalbumine+ en/of somatostatine+) clusters van nodale eiwitten langs hun axon kunnen vormen die door OCM worden geïnduceerd vóór myelinatie14,24. Massaspectrometrie analyse van OCM heeft ontrafeld verschillende gesecreteerde eiwitten en leidde tot oligodendroglial Contactin-1 dat in synergie met extracellulaire matrix eiwitten bemiddelt vroege stappen van nodale clustering24identificeren. Primaire culturen zijn nuttige modellen die de beoordeling van oligodendrogliale afstamming celdifferentiatie en interacties met neuronen mogelijk te maken. Er zijn echter ook andere benaderingen ontwikkeld om OL-functies en myelinatie, demyelinatie en remyelinatie te evalueren uit ex vivo cerebellar organotypic slice culturen25,26, en in vivo studies, met name met zebravissen en kikkervismodellen27 die nodig zijn in de laatste stappen van preklinische studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft concurrerende belangen of tegenstrijdige belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen Rémi Ronzano bedanken voor zijn wijze advies in de handschriftredactie. Dit werk werd gefinancierd door ICM, INSERM, ARSEP foundation grant aan NSF en Bouvet-Labruyère prijs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
