Summary
Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.
Abstract
Merkezi sinir sisteminde, oligodendrocytes iyi akson miyelinasyon rolleriyle bilinir, bu tuzlu iletim yoluyla eylem potansiyellerinin yayılmasını hızlandırır. Ayrıca, raporların giderek artan sayıda oligodendrocytes myelination ötesinde nöronlar ile etkileşim öneririz, özellikle çözünür faktörlerin salgılayan yoluyla. Burada, glial hücre kültürlerinden de astrositler ve mikroglial hücreler içeren oligodendroglial soy hücrelerinin saflaştırılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol saklıyız. Yöntem, 37 °C'de gece boyunca sallamaya dayanır, bu da üstteki oligodendrogial hücrelerin ve mikroglial hücrelerin seçici ayrılmasına ve mikroglianın diferansiyel adezyon la ortadan kaldırılmasını sağlar. Daha sonra oligodendrocytes kültürünü ve oligodendrocyte-conditioned orta (OCM) üretimi açıklar. Biz de co-kültür deneylerde saflaştırılmış hipokampal nöronlar için OCM tedavi veya oligodendrocytes ek kinetik sağlamak, oligodendrocyte-nöron etkileşimleri çalışma.
Introduction
Oligodendrocytes (OL) merkezi sinir sisteminin glial hücreleridir (CNS) aksonlar etrafında miyelin sarma oluşturmak. OL'ler, embriyonik CNS'nin ventriküler bölgeleri içinde çoğalan ve daha sonra tamamen olgun OL'lere (yani miyelin oluşturanhücrelere)göç eden ve farklılaşan oligodendrocyte öncül hücrelerinden (OPCs) kaynaklanır. OPCs erken gelişim sırasında bol, ama aynı zamanda büyük proliferatif hücre popülasyonu temsil yetişkin beyinde devam2. Tek bir OL, çıkarılabilir olmayan bölümlerde birden fazla aksonları (yani, internodes) ensheathes ve her miyelin döngü kenarı miyelin yalıtım özellikleri için çok önemli olan paranodal etki alanı oluşturan akson bağlanır1,3. Paranodlar arasında Ranvier düğümleri denilen küçük myelinated boşluklar vardır. Bu düğümler voltaj kapılı sodyum kanalları (Nav) açısından zengindir ve tuzatory iletkenlik4ile etki potansiyellerinin yenilenmesine ve hızlı yayılmasına olanak sağlar. Bu sıkı etkileşim aynı zamanda OLs 5 laktat nöronal alımıyoluyla aksonal enerji desteği sağlar5 ,6.
Oligodendroglial soy hücrelerinin olgunlaşması ve miyelinasyon süreci sıkı nöronlar ile etkileşimleri tarafından düzenlenir7. Nitekim, OLs ve OPCs, ayrıca NG2 hücreleri olarak adlandırılan, nörotransmitterler için reseptörlerin bir dizi ifade, ve uyarıcı ve inhibitör nöronlar giriş alabilirsiniz, onları miyelinating hücrelere onların çoğalma ve / veya farklılaşma tetikleyebilir nöronal aktivite algılamak için izin2. Buna karşılık, OPCs / OLs tek başına veya sinerjik nöromodülatif ve nöroprotektif fonksiyonlar8,9,10,11,12aracılık ekstrasellüler uzaya mikroveziküller ve proteinler salgılar . Ancak, oligodendroglial soy hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerin birden fazla modları kontrol moleküler mekanizmalar henüz tam olarak deşifre olmak.
Ayrıca, çeşitli CNS patolojik koşullarda, OLs öncelikle etkilenir, böylece nöronlar ile etkileşimi rahatsız. Örneğin, Multipl Skleroz (MS), nörolojik disfonksiyon CNS fokal demiyelinasyon neden olur, aksonal hasar ve buna bağlı sakatlık birikimine yol açabilir OLs kaybı ikincil. Remiyelinasyon, çoğu durumda yetersiz olsa da13gerçekleşebilir. Son on yılda kaydedilen ilerleme, immünoterapilerin gelişmesi nedeniyle nüks etme oranını azaltmış, ancak remiyelinasyonu teşvik etmek bugüne kadar karşılanmamış bir ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, OL'lerin rolünün, işlevlerinin ve etkilerinin daha iyi anlaşılması, cns koşullarının geniş bir yelpazesi için yeni tedavilerin geliştirilmesiaçısından özellikle ilgi çekicidir.
Burada, OSB'lerin arınma ve kültür yöntemlerini açıklıyoruz. Bu, gelişimlerini ve biyolojilerini düzenleyen içsel mekanizmaların hassas bir şekilde incelenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu tür son derece zenginleştirilmiş OL kültürleri oligodendrocyte klimalı orta üretimine izin (OCM), hangi saflaştırılmış nöron kültürleri eklenebilir nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerinde OLS gizli faktörlerin etkisi hakkında fikir edinmek için. Ayrıca, saflaştırılmış oligodendrositler ve nöronların bir araya gelerek miyelinasyonu düzenleyen mekanizmaların ele alınmasına olanak tanıyan bir in vitro co-kültür sisteminin nasıl uygulanacağını anlatıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneyde farelerin bakımı ve kullanımı kurumsal politika ve yönergelere (UPMC, INSERM ve Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi 86/609/EEC) uygundur. Standart 12 yavru için aşağıdaki protokol oluşturulmuştur.
1. Şişelerin hazırlanması (~5 dk)
NOT: Steril koşullarda laminar akış kaputunda diseksiyondan bir gün önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Coat 150 cm2 şişe (T150) filtre kapağı ile (2 yavru için 1 şişe) polietilenin 5 mL kullanarak (PEI, 100 mg / L, Ek Dosya 1protokolüne bakın).
- Şişeleri gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- Diseksiyon gününde steril distile su ile 3 kez durulayın kaplı şişeler.
2. Ortamın hazırlanması (~10 dk)
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
- Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamından (DMEM) oluşan ve fetal baldır serumunun (FCS) %10'u ve penisilin-streptomisinin (100 IU/mL) %10'u ile desteklenen 500 mL kültür ortamı hazırlayın.
- 20 mL DMEM, 200 μL DNase (50 g/mL), 200 μL papain (30 U/mL) ve 200 μL L-sistein (0,24 mg/mL) içeren 50 mL'lik bir tüpte enzim sindirim ortamının 20,6 mL'sini hazırlayın.
- 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak ortamı filtreleyin.
- Medyayı, diseksiyona kadar ortam sıcaklığında (RT) laminar akış kaputunda tutun.
3. Diseksiyon için hazırlık (~10 dk)
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
- Kalsiyum ve magnezyum olmadan 100 mL fosfat tamponlu salin hazırlayın (PBS; 1x). 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.
- 50 mL buz gibi 1x PBS çözeltisi ve %45 glikoz 750 μL hazırlayın. 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.
- 100 mm'lik Petri kabını temizleme aletleri için 1x PBS ve doku hasadı için buz gibi PBS-glikoz içeren üç 60 mm Petri kabını doldurun. Petri tabaklarını diseksiyona kadar buza koyun.
4. Diseksiyon
NOT: Diseksiyon doğum sonrası (P) 2'de erkek ve dişi Wistar sıçan yavrularından yapılır.
- Steril bir ortam sağlamak için, % 100 etanol ile tezgah temizlemek için emin olun. Tüm cerrahi aletleri %100 etanol ile sterilize edin.
- Yavaşça% 70 etanol ile yavrunun boyun sprey.
- Hayvanın kafasını kesmek ve başı buz gibi PBS-glikoz içeren 100 mm'lik Petri kabına yerleştirmek için büyük cerrahi makas kullanın.
- Göz seviyesinde hayvanın başını korumak için kavisli forceps kullanın. Kafatasının tabanında küçük bir kesi yapmak ve beyin orta hattı aşağıdaki kafatası kesmek için küçük cerrahi makas kullanın.
- Kafatasının iki parçasını orta hattan yavaşça soymak için forceps kullanın.
- Baş boşluğundan beyin kaldırmak için küçük bir cerrahi kaşık kullanın. Beyni buz üzerinde buz gibi PBS-glikoz içeren 60 mm'lik petri kabına koyun.
- Bir steromicroscope altında görüntüleme, beyincik kaldırmak için ince çifenler kullanın, beyin sapı ve koku ampulleri serebral hemisfer.
- İki serebral hemisferi ayırmak için ince pratisyen ler kullanın. Menenjitleri soymak için ince forceps kullanın. Serebral kortikülleri buzüzerinde 60 mm'lik bir kabın içine koyun.
NOT: Buz gibi PBS doğru menenjlerin çıkarılması için çok önemlidir.
5. Doku dissociasyonu
NOT: Adımları steril koşullarda laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
- Ince serebral korteksleri doğramak için keskin bir neşter kullanın. Kıymalı dokuyu enzim sindirim ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 30 dakika kuluçka .
- Kortikal dokunun 50 mL tüpün altında kalmasını sağlarken enzim sindirim ortamını nazikçe çıkarmak için p1000 mikropipet kullanın.
- 1 mL DMEM-10% FCS eklemek ve dokuyu hafifçe triturate etmek için p1000 mikropipet kullanın.
- Kortikal dokuyu 50 mL'lik bir tüpe filtrelemek için 70 m filtre ve 1 mL şırınganın pistonu kullanın.
NOT: DMEM-10% FCS ile iç tüp duvarında birkaç kez artık doku durulayabilir. - 50 mL'lik tüpü DMEM-%10 FCS ile doldurun. SENTRIFUGE 423 x g 5 dk RT. Dikkatle supernatant kaldırmak ve DMEM-10% FCS 2 mL ile hücre pelet resuspend.
- P1000 mikropipet li ve p200 mikropipetli hücre peletini hafifçe triturate. DMEM-10%FCS uygun hacmi ile hücre süspansiyon seyreltmek.
NOT: İki beyin = bir T150 = 5 mL DMEM-10%FCS. - T150'de 1 x 105 hücre/cm2yoğunlukta hücre süspansiyonunun 5 mL plakası. Her T150'ye 20 mL sıcak DMEM-%10 FCS ekleyin. 37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Sıcak DMEM-10% FCS ile 6 gün in vitro (DIV) sonra kültür ortamının yarısını yenileyin.
6. Sallayarak hazırlık
- Steril koşullar altında bir laminar akış kaputsal sallayarak önce gün sallayarak hazırlık gerçekleştirin.
- Şişeye taze sıcak kültür ortamı ekleyerek kültür ortamının yarısını yenileyin ve %5 CO2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
7. Sallayarak
- Pei ile coat üç 100 mm Petri yemekleri. Bir gecede 4 °C'de saklayın.
- Parafin film ile şişe kapağı kapağı ve plastik bir torbaya şişeleri koymak. 37 °C'de 250 rpm'de glial hücreleri içeren şişeleri bir gecede çalkalayın.
NOT: İlk sallayarak 8 DIV yapılır ve bir üç farklı sallayarak kadar gerçekleştirebilirsiniz (zamanlama için Şekil 1'e bakın).
8. OL soy hücreleri hasat ve kültür
NOT: Bu adımlar steril koşullar altında laminar akış kaputunda yapılmalıdır.
- Sallayarak sonra gün, Tablo 1göre Bottenstein-Sato (BS) orta hazırlamak.
- Steril distile su ile 3 kez durulayın Petri yemekleri.
- Hasat şişeleri 'supernatant ağırlıklı OL soy hücreleri içeren değil, aynı zamanda bazı mikroglial hücreler ve kaplamasız 100 mm Petri yemekleri üzerine plaka.
NOT: Bu adım, mikroglial hücrelerin çanak yüzeyindediral hızlı yapışma yoluyla uzaklaştırılmasına olanak sağlar. - Petri yemeklerini %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her T150 şişesini 25 mL sıcak taze hazırlanmış kültür ortamı ile doldurun ve 37 °C'de %5 CO2'nin altında nemli bir kuluçka makinesinde ikinci titrene kadar kuluçkaya yatırın.
- Petri kaplarından süpernatantı, artık mikroglial hücrelerin yapışmasını sağlamak için kaplamasız yeni 100 mm Petri kaplarına aktarın.
- Petri yemeklerini %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Yapışmaz OL soy hücreleri içeren supernatant'ı çıkarın ve 50 mL tüplere aktarın (50 mL tüp için 2 Petri kabından süpernatant). Mikroglia ile kaplanmış Petri tabaklarını atın.
- 423 x g5 dk için supernatant santrifüj . 1 mL BS orta ile supernatant ve resuspend hücre peletini dikkatlice çıkarın. Tüm peletleri ortak bir 50 mL tüpte birleştirin ve bs orta ile sesi 10 mL'ye ayarlayın.
- Hücre yoğunluğu nu mikroskop altında sayma hücrelerini belirleyin.
NOT: 3 x 105/mL ile 5 x 105/mL arasında bir hücre yoğunluğu elde edilmelidir. - Hücre yoğunluğu 30 mL'den daha yüksek veya 4 x10 5/mL'den yüksekse 20 mL BS ekleyin veya hücre yoğunluğu 4 x 10 5/mL'den azsa sadece 10 mL BS ekleyin ve 20 mL'lik son bir hacim elde edin.
- 10 mL hücre süspansiyonlu iki veya üç önceden kaplanmış 100 mm Petri kabını kaplayın. 37 °C'de %5 CO2'ninaltında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- Tüm BS orta 2 saat sonra ferahlatıcı tarafından Petri yemekleri enkaz temizleyin.
NOT: Hücre yoğunluğunu ve enkaz kaldırma etkinliğini doğrulamak için temizlemeden önce ve sonra mikroskop altında kültürü inceleyin. - %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 gün BS ortamda kuluçkaya yatırın.
NOT: Kültürü mikroskop altında inceleyin. Kesişme %70 ila %80 arasında olmalıdır.
9. OCM üretimi
NOT: Bu adımları steril koşullar altında laminar akış kaputunda gerçekleştirin.
- Tablo 2'yegöre NB-B27low ortamını hazırlayın.
- 10 mL sıcak NB-B27low ortam ile kültür ortamını yenileyin. %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 gün kuluçkaya yatırın.
- Hasat OCM, yani, SUPERnatant OL salgılanan faktörler içeren. 0,22 μm filtre kullanarak OCM'yi filtreleyin.
NOT: OCM'yi 4 °C'de en fazla 2 ay saklayın.
10. OCM ilavesi
NOT: Adımlar steril koşullar altında laminar akış kaputunda yapılmalıdır. OCM aşağıdaki protokol14uyarınca hazırlanan saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri eklenebilir , ve ekleyerek elde, 24 saat izolasyon sonra, anti-mitotik ajanlar uridine ve 5- fluorodeoxyuridine (5 μM) için 36 h.
- 3 DIV'de, anti-mitotik ajanlar içeren tüm nöron kültür ortamını çıkarın ve 500 μL taze sıcak OCM ekleyin.
- Taze yapılmış sıcak NB-B27 ile her 3 günde bir orta ortamın yarısını yenileyin.
NOT: Bu tür kültürler 21 DIV'ye kadar korunabilir.
11. Saflaştırılmış hipokampal nöron kültürüne OL eklenmesi
NOT: Steril koşullarda laminar akış kaputunda aşağıdaki adımları gerçekleştirin. OL'ler yukarıda açıklandığı gibi elde edilen saflaştırılmış hipokampal kültürlere eklenebilir.
- Tablo 3'egöre ortak kültür ortamı hazırlayın.
- OL kültürünü %70 ile %80 oranında bir araya getirmekle alın. 2 mL ılık 1x PBS ile durula.
- Hücreleri ayırmak için, 100 mm Petri kabına %0,25 tripsin 2 mL ekleyin.
- %5 CO2'ninaltında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 5 dakika kuluçka .
- Enzimatik reaksiyonu engellemek için 2 mL DMEM-10% FCS ekleyin. OL soy hücrelerini içeren süpernatanthas hasat.
- Sentrifüj 423 x g 5 dk RT. Dikkatle supernatant kaldırmak ve 1.25 x 105 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için sıcak co-kültür orta hücre pelet resuspend.
- 200 μL nöron kültür ortamını çıkararak ve 24 kuyulu bir plakanın her kuyubaşına 200 μL hücre süspansiyonu (2.5 x 104 hücre/kuyu) ekleyerek saflaştırılmış hipokampal nöron kültürüne OL ekleyin.
- Her 2-3 günde bir ortak kültür ortamının yarısını yenileyin.
NOT: Ortak kültürler 24 DIV'ye kadar korunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, OL soy hücreleri göksitler ve mikroglia kapalı sallayarak glial kültürlerden saflaştırılır. OL kültürlerinin saflık ve fenotipik muayenesi glial belirteçleri ile immünboyama ile değerlendirilebilir15. Farklı belirteçlerin ekspresyonunun analizi, OL kültürlerinin çoğunlukla %90 ± %4'ü O4+ hücre, %85 ± %7 NG2+ hücre ve %4,7 ± % 2,1 PLP+ hücre, %7,2 ± % 2,5'i GFAP+ astrosit (ortalama ± S.D., n = 3; Şekil 2). Buna ek olarak, hücrelerin %4.6 ± 0.7'si CD11b+ mikroglial hücrelerdi (ortalama ± S.D., gösterilmemiştir).
Bu tür kültürlerden üretilen OCM saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri için 3 DIV eklenebilir. Bu tedavi nodal proteinlerin kümelenme teşvik, Nörofascin ile ilişkili Nav kanalları oluşan 186 ve Ankyrin G hipokampal GABAerjik nöronların akson boyunca miyelinönce, at 17 DIV(Şekil 3A,B). Dikkat, elektrofizyolojik kayıtlar bu kümeleri eylem potansiyelleri14artan iletim ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Buna ek olarak, Smi31 ile boyanmış fosforlu ara filament proteini H'nin ekspresyonu OCM ile tedavi edilen hipokampal nöronlarda artmaktadır (Şekil 3A). Oligodendroglial salgılanan faktörler bu nedenle nöronal olgunlaşma ve fizyoloji karıştığı.
Hipokampal nöronların miyelinasyonu 14 DIV'de OL ilavesi ile incelenebilir. 20 DIV'den 24 DIV'ye kadar miyelin temel protein (MBP) gibi miyelin belirteçlerinin immünboyizasyonu miyelin segmentlerinin görüntülenmesine olanak sağlar (Şekil 4).
Şekil 1: OL soy hücrelerinin izolasyonve OCM üretiminin protokol zaman çizelgesi. P2 Wistar sıçanlardan serebral korteksler kesildikten sonra (adım 4), kültür glial hücrelere doku dissociation gerçekleştirmek (adım 5). 8, 12 ve 15 DIV (yani, sallayarak gün önce), sıcak DMEM-10% FCS (adım 6) ile yarım orta yenilemek. Ertesi gün, 37 °C'de (adım 7.2) 250 rpm gecede glial kültürleri sallamak. OL soy hücreleri ve birkaç mikroglia hücresi içeren hasat supernatant ve 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 15 dakika boyunca %5 CO2 (8,3 ila 8,7 adım) altında plaka. 423 x g'de5 dakika boyunca süpernatantı santrifüj edin, BS ile hücre peletini yeniden askıya alın ve %5 CO2'nin altında 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 2 gün kuluçkaya yatırın (8,8 ila 8,12 adım). OCM üretmek için, NB-B27low (adım 9) 2 gün boyunca kuluçka. ORTAK kültür deneyleri için OL'leri yalıtmak için, trypsin kullanarak hücreyi ayırın (adım 11.3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: OL çizgi hücreleri kültürlerde fenotip. Görüntüler konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Maksimum yoğunluklu projeksiyonlar sunulmaktadır. (A) OL kültürleri çoğunlukla pre-OLs içerir (yani, sadece NG2 ifade (kırmızı), ya da her iki O4 (yeşil) ve NG2 (kırmızı); her iki belirteçleri ifade hücreleri sarı yıldız ile gösterilir), ama aynı zamanda bazı olgunlaşmamış OLs (yani, sadece O4 ifade değil NG2; beyaz yıldızlar). (B) Birkaç olgun OL (yani, PLP+; yeşil) ve birkaç astrosit (GFAP+ hücreleri; kırmızı) OL soy hücre kültürlerinde bulunur. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili uygulamalar. (A,B) Hipokampal nöronlar 3 DIV'de OCM ile tedavi edilir ve 17 DIV ekspres fosforilasyonlu ara filament proteinH (Smi31; yeşil; panel A) sabitlenir. GABAerjik nöronlar, 67 kDa glutamat dekarboksilaz izoform tarafından tanımlanan 67 kDa (GAD67) ekspresyonu (beyaz), ankyrin G ve Nav sodyum kanallarının görüntü birikimi (kırmızı; paneller A ve B, sırasıyla) akson ilk segmentinde ve akson boyunca Ankyrin G ve Nav kümeleri formu (paneller A ve B, sırasıyla). Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili uygulamalar. OL soy hücreleri hipokampal nöron kültürüne eklendi 14 DIV bazı hipokampal aksonlar miyelin, burada sabit 23 DIV (MBP bir miyelin belirteç olarak; yeşil). Ranvier düğümleri (Nav; kırmızı) miyelin segmentleri arasında görülür. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bottenstein-Sato (BS) medya | Son konsantrasyon |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta | |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin insan | 100 μg/mL |
| BSA (Büyükbaş Serum Albumin) | 100 μg/mL |
| Insülin | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| Progesteron | 62 ng/mL |
| Putrescine dihidroklorür | 16 μg/mL |
| Sodyum selenit | 40 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironin sodyum tuzu) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Tiroksin) | 40 ng/mL |
Tablo 1: Bottenstein-Sato (BS) ortamının hazırlanması.
| NB-B27 düşük ortam | Son konsantrasyon |
| Nörobazal | |
| B27 eki | 0.5x |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
| NB-B27 ortam | Son konsantrasyon |
| Nörobazal | |
| B27 eki | 1 x |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
Tablo 2: NB-B27low ve NB-B27 ortamlarının hazırlanması.
| Ortak kültür medyası | Son konsantrasyon |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta | 1 cilt |
| Nörobazal | 1 cilt |
| B27 eki | 1 x |
| Penisilin-Streptomisin | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin insan | 50 μg/mL |
| Biotin | 10 ng/mL |
| BSA (Büyükbaş Serum Albumin) | 50 μg/mL |
| Ceruloplasmin | 100 ng/mL |
| Hidrokortizon | 0,05 μM |
| Insülin | 5 μg/mL |
| N-Asetil-L-sistein | 5 μg/mL |
| Progesteron | 6.2 ng/mL |
| Putrescin | 16 μg/mL |
| Rekombinant İnsan CNTF | 0.1 ng/mL |
| Sodyum selenit | 5 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironin sodyum tuzu) | 40 ng/mL |
| B12 Vitamini | 27.2 ng/mL |
Tablo 3: Ortak kültür medyasının hazırlanması.
Ek Dosya 1. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, daha önce yayınlanmış bir yöntem 16 uyarlanmış karışık glial kültürlerden son derece zenginleştirilmiş oligodendroglial soy hücre kültürleri elde etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak16, ve OL-klimalı orta sonraki üretim. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir, üç kez tekrarlanabilir ve saflaştırılmış OL'lerin yüksek miktarda elde etmek için en uygun, Bottenstein-Sato kültürlü hücreler olarak (BS) ortamda PDGFα çoğalır. Glial hücreler P2 Wistar sıçanların serebral kortiküller kullanılarak hazırlanır, hangi oligodendroglial soy hücrelerinin büyük bir çoğunluğu ng2 ve O415ifade pre-oligodendrocytes olduğu bir zaman noktası . Not, OL soy olgunlaşma fare ve sıçan P2 benzer, ve bu protokol de fare öncesi oligodendrocytes17izole etmek için kullanılabilir.
Karışık glial hücre kültürleri sallayarak sonra, müstakil hücreler oligodendroglial soy hücreleri ağırlıklı olarak oluşur, ama aynı zamanda bazı mikroglial hücreler ve birkaç astrositler. Mikroglial hücreler kaplamasız Petri kaplanmamış petri kaplarında diferansiyel yapışma ile kaldırılır. Dikkat, kaldırma verimliliği ek bir yapışma adımı gerçekleştirerek artırılabilir. Ancak, mikroglial hücrelerin yaklaşık% 5 hala zenginleştirilmiş oligodendroglial hücre kültürlerinde bulunur, yanı sıra% 5-9 astrositlerin. O4 antikor kaplı Petri kapları kullanılarak ek bir immüno panning adımı atarak astrositlerden kaynaklanan kontaminasyonu %5'in altında azaltmak mümkündür; ayrıntılı bir protokol için Freeman ve ark.14'tekiek bilgilere bakın. Kaplama oligodendroglial hücrelerden sonra enkaz kaldırılması 2 saat boru ile uygulanan akış gücüne dayanan kritik bir adımdır. Bu adımda, çok fazla enkaz varlığı hücre canlılığı ve büyüme bozabilir gibi verimliliği doğrulamak için temizleme öncesi ve sonrası mikroskop altında kültürü incelemek önemlidir. Not, aynı zamanda taze bs orta kullanmak önemlidir, aksi takdirde oligodendrocytes hayatta kalma değiştirebilir. Buna ek olarak, saflaştırılmış hücreler kaplama dan sonra sadece 6 gün kadar hayatta. Nitekim, diğer glial hücreleri ve nöronlar opc sağkalım ve çoğalma veya gizlifaktörlerveya doğrudan temaslar 2 ,18yoluyla farklılaşma teşvik bilinmektedir.
Diğer yöntemler, beyin ayrıştırma hemen sonra, O4 antikor ile immünetiketleme kullanarak ve akış sitometri (FACS) veya manyetik aktive hücre sıralama (MACS) tarafından floresan aktive hücre sıralama kullanarak OLs izolasyon sağlar. Buna ek olarak, GFP-pozitif OPCs veya GFP-pozitif oligodendrositler PDGFαR floresan aktif hücre sıralama ile saflaştırılmış olabilir:GFP veya PLP:GFP fareler, sırasıyla19,20. Bu sıralama yöntemleri, fenotiplerini değiştirebilecek büyüme faktörleri ile tedavi edilen kültürlere kıyasla oligodendrositlerin fizyolojik durumunu incelemek için daha önemlidir. Özellikle, floresan aktive hücre sıralama normal fizyolojik devlet ve demiyelinating koşulları21gen profilleme yaklaşımları için kullanılmıştır. Hücre sağkalım hücre sıralama ile değiştirilebilir gibi, hemen sıralama dan sonra fonksiyonel tahliller gerçekleştirmek için daha iyidir.
Biz OL kültürleri müstakil ve 14 DIV saflaştırılmış hipokampal nöron kültürleri eklenebilir göstermiştir. Bu tür OL-nöron co-kültür co-kültür (Dubessy, yayınlanmamış sonuçlar) ilk haftasında başlayan miyelinerken erken adımları çalışma sağlar. OL-hipokampal nöron miyelinating co-kültür diğer modeller hemen sıralama sonra oligodendrocytes ekleyerek elde edilmiştir22,23. Ayrıca, OL-nöron etkileşimlerini daha fazla incelemek ve OL-salgılanan faktörlerin nöron kültürleri üzerindeki rolünü ele almak için OCM ürettik. Bu tekniği kullanarak, hipokampal GABAerjik nöron alt tiplerinin (yani, parvalbumin+ ve/veya somatostatin+) miyelinasyon dan önce OCM tarafından indüklenen akson boyunca nodal protein kümeleri oluşturabileceğinigösterdik. OCM kütle spektrometresi analizi birkaç salgılanan proteinleri çözdü ve oligodendroglial Contactin-1 tanımlamak için yol açtı ki ekstrasellüler matris proteinler ile sinerji nodal kümelenme erken adımlar aracılık24. Birincil kültürler oligodendroglial soy hücresi farklılaşması ve nöronlar ile etkileşimlerin değerlendirilmesi sağlayan yararlı modellerdir. Ancak, diğer yaklaşımlar da OL fonksiyonları ve miyelinasyon değerlendirmek için geliştirilmiştir, demiyelinasyon ve ex vivo serebellar organotypic dilim kültürlerden remyelination25,26, ve in vivo çalışmalarda, özellikle zebra balığı ve iribaş modelleriile 27 hangi pre-klinik çalışmaların son adımlarında gerekli olan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin rakip çıkarları veya çelişen çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar Rémi Ronzano'ya el yazması düzenlemedeki bilge tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma ICM, INSERM, NSF'ye ARSEP vakfı hibesi ve Bouvet-Labruyère fiyatı ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
