Summary
본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.
Abstract
중추 신경계에서 올리고엔드로시트는 축삭 수초화에서 자신의 역할로 잘 알려져 있으며, 이는 염전을 통해 행동 잠재력의 전파를 가속화합니다. 더욱이, 보고의 증가 수는 oligodendrocytes가 특히 가용성 요인의 분비를 통해, myelination를 넘어 뉴런과 상호 작용한다는 것을 건의합니다. 여기에서, 우리는 또한 성상 세포 및 microglial 세포를 포함하는 신경교 세포 배양에서 oligodendroglial 계보 세포의 정제를 허용하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 37 °C에서 하룻밤 흔들림에 의존, 이는 오버 리올리고겐드로글리알 세포와 미세 교만 세포의 선택적 분리를 허용, 차등 접착에 의해 미세 글리아의 제거. 그런 다음 올리고엔드로시트의 문화와 올리고엔드로시테(oligodendrocyte) 조절 배지(OCM)의 생산을 설명합니다. 우리는 또한 공동 문화 실험에서 정제 된 해마 뉴런에 추가 된 OCM 치료 또는 올리고 덴 드 로시테의 역학을 제공, 올리고 덴 드 로시테 - 뉴런 상호 작용을 연구.
Introduction
올리고엔드로시트(OLs)는 축삭 주위의 미엘린을 생성하는 중추신경계(CNS)의 신경교 세포이다. 올Ls는 배아 CNS의 심실 영역 내에서 증식한 후 완전히 성숙한 올(즉, 미엘린 형성 세포)로 이동하고 분화하는 올리고엔드로시테 전구체 세포(OPCs)에서 유래합니다1. OPCs는 초기 발달 도중 풍부합니다, 그러나 또한 중요한 증식 세포 인구를 대표하는 성인 두뇌에서 지속합니다2. 하나의 OL은 흥분되지 않는 단면(즉, 인터노드)에서 다중 축삭을 ensheathes하고, 각 myelin 루프의 가장자리는 미엘린1,3의절연 특성에 중요한 편집증 도메인을 형성하는 축삭에 부착된다. 파라노드 사이에는 Ranvier의 노드라고 불리는 작은 미수화 된 간격이 있습니다. 이러한 노드는 전압 게이트 나트륨 채널 (Nav)이 풍부하여 염전도4를통해 작용 전위를 재생하고 신속하게 전파 할 수 있습니다. 이 단단한 상호 작용은 또한 OLs5,6에서젖산의 신경 관내 섭취를 통해 축축한 에너지 지원을 가능하게 합니다.
올리고드로글리알 혈통 세포와 수레화 과정의 성숙은 뉴런과의 상호 작용에 의해 엄격하게 조절된다7. 실제로, NG2 세포라고도 불리는 OPC와 OPCs는 신경 전달 물질에 대한 수용체의 배열을 발현하고, 흥분성 및 억제 뉴런으로부터 입력을 수신할 수 있어, 이들의 증식 및/또는 분화 세포를 분화시킬 수 있는 뉴런 활동을 감지할 수 있도록2. 차례로, OPCs/OLs는 마이크로소포스와 단백질을 세포외 공간으로 분비하며 이는 단독으로 또는 상승적으로 신경조절 및 신경보호 기능을8,9,10,11,12. 그러나, oligodendroglial 혈통 세포와 뉴런 사이 상호 작용의 다중 모드를 통제하는 분자 기계장치는 아직 완전히 해독될 수 있습니다.
더욱이, 몇몇 CNS 병리학 적인 조건에서, 올은 주로 영향을 받습니다, 따라서 뉴런과의 상호 작용을 방해하. 예를 들면, 다발성 경화증에서 (MS), 신경 기능 장애는 축삭 손상 및 관련 무력 축적으로 이끌어 낼 수 있는 CNC에 있는 초점 탈수아비, 이차 적인 OLs 손실에 기인합니다. 레미엘리네이션은 대부분의 경우13. 면역 요법의 발달로 인해 지난 10 년 동안의 진전은 재발률을 감소시키지만 재수elination을 촉진하는 것은 충족되지 않은 필요성으로 남아 있습니다. 이와 같이, OLs 역할, 기능 및 영향의 더 나은 이해는 CNS 조건의 넓은 스펙트럼을 위한 새로운 치료의 발달에 특히 관심있습니다.
여기서, 우리는 올스 정제 및 배양의 방법을 설명합니다. 이를 통해 개발 및 생물학을 규제하는 본질적인 메커니즘을 정밀하게 검사할 수 있습니다. 또한, 이러한 고농축 된 올스 배양은 뉴런 생리학 및 연결에 대한 OLs 분비 요인의 영향에 대한 통찰력을 얻기 위해 정제 된 뉴런 문화에 추가 할 수있는 oligodendrocyte 컨디셔닝 배지 (OCM)의 생산을 허용합니다. 또한, 우리는 정제 된 올리고 엔드 로시테와 뉴런이 함께 결합되어 조절 되는 메커니즘을 해결할 수있는 체외 공동 배양 시스템을 구현하는 방법을 설명합니다 (재)myelination.
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Protocol
이 실험에서 쥐의 관리 및 사용은 기관 정책 및 지침 (UPMC, INSERM 및 유럽 공동체 위원회 지침 86/609/EEC)을 준수합니다. 다음 프로토콜은 12 개의 새끼의 표준 쓰레기에 대해 설정됩니다.
1. 플라스크 준비 (~5 분)
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 해부 전날 다음 단계를 수행하십시오.
- 폴리에틸렌민 5 mL(PEI, 100 mg/L, 보충 파일 1의프로토콜 참조)을 사용하여 필터 캡(2개 새끼용 플라스크 1개)으로 150 cm2 플라스크(T150)를 코팅합니다.
- 플라스크를 밤새 4°C에서 보관합니다.
- 해부 당일 멸균 증류수로 플라스크를 3회 헹구어 줍니다.
2. 미디어 준비 (~10분)
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
- 500 mL의 배양 배지를 준비, DULbecco의 수정 된 독수리 매체로 구성 (DMEM) 보충 10% 태아 송아지 혈 청의 (FCS) 그리고 페니실린-스트렙토 마이신 (100 IU/mL).
- DMEM 20 mL, DNase 200 μL (50 μg/mL), 파페인 200 μL (30 U/mL) 및 L-시스테인 200 μL (0.24 mg/mL)으로 구성된 50 mL 튜브에서 효소 소화 배지 20.6 mL을 준비하십시오.
- 0.22 μm 필터를 사용하여 매체를 필터 살균합니다.
- 해부 될 때까지 상층 부류 후드에 매체를 실온 (RT)에서 유지합니다.
3. 해부 준비 (~10 분)
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
- 칼슘과 마그네슘 (PBS; 1x)없이 인산염 완충 식염수 100 mL를 준비하십시오. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.
- 45% 포도당의 750 μL로 보충된 얼음-차가운 1x PBS 용액 50 mL을 준비합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균.
- 100mm 페트리 접시에 청소 용 1x PBS와 3 개의 60mm 페트리 접시와 얼음차가운 PBS-포도당을 채취하십시오. 해부될 때까지 페트리 접시를 얼음위에 올려 놓습니다.
4. 해부
참고 : 해부는 출생 후 날 (P) 2에서 남성과 여성의 위스타 쥐 새끼에서 수행됩니다.
- 멸균 환경을 제공하기 위해 100 % 에탄올로 벤치를 청소하십시오. 100 % 에탄올로 모든 수술 도구를 살균하십시오.
- 70% 에탄올로 강아지의 목을 부드럽게 스프레이하세요.
- 큰 수술 용 가위를 사용하여 동물을 참수하고 얼음 차가운 PBS -포도당이 들어있는 100mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 동물의 머리를 눈 높이에서 유지합니다. 작은 수술 가위를 사용하여 두개골 의 기지에서 작은 절개를하고 뇌 중간선을 따라 두개골을 잘라냅니다.
- 집게를 사용하여 중간선에서 두개골의 두 부분을 부드럽게 벗깁니다.
- 작은 수술 용 숟가락을 사용하여 머리 구멍에서 뇌를 제거하십시오. 얼음에 얼음 차가운 PBS-포도당을 포함하는 60mm 페트리 접시에 뇌를 넣습니다.
- 스테로 현미경의 밑에 보기, 뇌반구에서 소뇌, 뇌간 및 후각 전구를 제거하기 위하여 정밀한 집게를 이용하십시오.
- 미세 한 집게를 사용 하 여 두 대뇌 반구를 분리 합니다. 수막껍질을 벗기기 위해 미세한 포셉을 사용하십시오. 대뇌 피질 을 얼음에 60mm 페트리 접시에 넣습니다.
참고: 얼음으로 차가운 PBS는 올바른 수막 제거에 매우 중요합니다.
5. 조직 해리
참고: 멸균 조건에서 층류 후드에서 단계를 수행합니다.
- 날카로운 메스를 사용하여 대뇌 피신도를 잘게 자릅니다. 다진 조직을 효소 소화 배지를 함유하는 50 mL 튜브로 옮김.
- 37°C에서 5%CO2미만에서 가습된 인큐베이터에서 30분 동안 배양한다.
- p1000 마이크로파이펫을 사용하여 피질 조직이 50 mL 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인하면서 효소 소화 매체를 부드럽게 제거하십시오.
- p1000 마이크로파이펫을 사용하여 DMEM-10% FCS 1mL를 추가하고 조직을 부드럽게 삼분화하십시오.
- 70 μm 필터와 1 mL 주사기의 피스톤을 사용하여 피질 조직을 50 mL 튜브로 필터링하십시오.
참고 : 하나는 DMEM-10 % FCS로 내부 튜브 벽에 잔류 조직을 여러 번 헹구을 수 있습니다. - DMEM-10% FCS로 50 mL 튜브를 채웁니다. RT에서 5분 동안 423 x g의 원심분리기를 조심스럽게 제거하고 DMEM-10% FCS 2 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
- p1000 마이크로파이펫으로 세포 펠릿을 부드럽게 삼각측량한 다음 p200 마이크로파이펫을 사용하십시오. DMEM-10% FCS의 적절한 부피로 셀 현탁액을 희석합니다.
참고: 두 개의 뇌 = 하나의 T150 = DMEM-10% FCS의 5mL. - 1 x 105 셀 /cm2의밀도에서 T150에 셀 현탁액의 플레이트 5 mL. 각 T150에 따뜻한 DMEM-10% FCS 20mL를 추가합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.
- 따뜻한 DMEM-10% FCS로 6일 간 체외(DIV) 후 배양 배지의 절반을 갱신한다.
6. 떨기 준비
- 멸균 조건하에서 층류 후드에서 흔들기 전에 하루에 흔들리는 준비를 수행하십시오.
- 신선한 따뜻한 배양 배지를 플라스크에 첨가하여 배양 배지의 절반을 갱신하고 5%CO2미만에서 37°C에서 배양한다.
7. 흔들림
- PEI와 세 100mm 페트리 접시를 코트. 밤새 4°C에서 보관하십시오.
- 플라스크 캡을 파라핀 필름으로 덮고 플라스크를 비닐 봉지에 넣습니다. 37°C에서 250 rpm에서 밤새 신경교 세포를 함유한 플라스크를 흔들어 주세요.
참고: 첫 번째 흔들림은 8 DIV에서 수행되며, 하나는 최대 세 개의 서로 다른 흔들림을 수행할 수 있습니다(타이밍은 그림 1 참조).
8. OL 혈통 세포 수확 및 배양
참고: 이러한 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다.
- 흔들은 다음 날, 표 1에따라 보텐슈타인-사토(BS) 배지를 준비한다.
- 멸균 증류수로 페트리 접시를 3회 헹구어 줍니다.
- 수확 플라스크의 상급은 주로 OL 혈통 세포뿐만 아니라 일부 미세 교세포를 함유하고 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시에 접시.
참고 : 이 단계는 접시 표면에 차동 빠른 접착을 통해 미세 교세포의 제거를 할 수 있습니다. - 5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.
- 각 T150 플라스크를 25 mL의 따뜻한 신선하게 제조된 배양 배지로 채우고 2차 흔들림까지 5%CO2 미만의 37°C에서 가습된 인큐베이터에 인큐베이터를 배양한다.
- 페트리 접시에서 상류감을 새로운 코팅되지 않은 100mm 페트리 접시로 옮겨 잔류 미세 교만 세포의 부착을 허용합니다.
- 5%CO2하에서 37°C에서 가습 된 인큐베이터에서 15 분 동안 페트리 접시를 배양한다.
- 부착되지 않은 OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 제거하고 50 mL 튜브로 옮김 (50 mL 튜브의 경우 2 페트리 접시에서 상판)으로 옮니다. 마이크로글리아로 도금된 페트리 접시를 버리십시오.
- 423 x g에서5 분 동안 상급을 원심 분리기 . 조심스럽게 상류를 제거하고 BS 배지 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 일반적인 50 mL 튜브에 모든 펠릿을 풀하고 BS 배지로 볼륨을 10 mL로 조정합니다.
- 현미경으로 세포 밀도 계수 세포를 결정합니다.
참고: 3 x 105/mL과 5 x 105/mL사이의 셀 밀도를 얻어야 합니다. - 셀 밀도가 4 x 10 5/mL보다 높거나30 mL의 최종 부피를 얻으려면 BS의 20 mL를 추가하거나 셀 밀도가 4 x 105/mL 미만인 경우 BS의 10 mL만 추가하여 최종 부피를 20 mL로 얻습니다.
- 10 mL의 셀 서스펜션으로 미리 코팅 된 100mm 페트리 접시 2 개 또는 3 개 접시. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 인큐베이터에서 배양한다.
- 나중에 BS 매체 2 시간 모두 를 상쾌하게하여 페트리 요리의 파편을 지웁히.
참고 : 세포 밀도와 파편 제거의 효율성을 확인하기 위해 클리어 전후 현미경으로 배양을 검사하십시오. - BS 배지에서 37°C에서 5%CO2미만에서 2일 동안 배양한다.
참고 : 현미경으로 배양을 검사하십시오. 합류는 70 %에서 80 %여야합니다.
9. OCM 생산
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 이러한 단계를 수행합니다.
- 표 2에따라 NB-B27low 배지를 준비합니다.
- 따뜻한 NB-B27low 배지 10 mL로 배양 배지를 리뉴얼합니다. 37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 2 일 동안 배양하십시오.
- OCM, 즉 OL 분비 인자를 포함하는 상급자를 수확합니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 OCM을 필터 살균합니다.
참고: OCM을 4°C에서 최대 2개월 동안 보관하십시오.
10. OCM 추가
참고: 단계는 멸균 조건하에서 층류 후드에서 수행해야 합니다. OCM은 다음프로토콜(14)에따라 제조된 정제된 해마 뉴런 배양물을 첨가할 수 있으며, 격리 후 24시간, 항-미소토액제 uridine 및 5-플루오로데옥시우리딘(5 μM)을 36시간 동안 첨가하여 수득하였다.
- 3 DIV에서, 항 유사분열제를 함유하는 모든 뉴런 배양 배지를 제거하고 신선한 따뜻한 OCM 500 μL을 첨가한다.
- 3일마다 중간 크기의 절반을 신선하게 만든 따뜻한 NB-B27로 리뉴얼합니다.
참고: 이러한 문화권은 최대 21DIV까지 유지할 수 있습니다.
11. 정제된 해마 뉴런 배양에 OL 첨가
참고: 멸균 조건하에서 층류 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 올Ls는 전술한 바와 같은 방식으로 수득된 정제된 해마 배양물을 첨가할 수 있다.
- 표 3에따라 공동 배양 배지를 준비한다.
- 70% ~ 80% 합류에서 OL 배양을 검색합니다. 따뜻한 1x PBS 2 mL로 헹굽니다.
- 세포를 분리하려면 0.25% 트립신 2mL를 100mm 페트리 접시에 넣습니다.
- 37°C에서 5%CO2미만의 가습 된 인큐베이터에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 효소 반응을 차단하기 위해 DMEM-10% FCS 2mL를 추가합니다. OL 혈통 세포를 포함하는 상급체를 수확합니다.
- RT에서 5 분 동안 423 x g의 원심 분리기를 조심스럽게 상류를 제거하고 따뜻한 공동 배양 배지에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하여 1.25 x 105 세포 / mL의 농도를 얻습니다.
- 24웰 플레이트의 200 μL의 뉴런 배양 배지를 제거하고 웰당 200 μL의 세포 현탁액(2.5 x 104 세포/웰)을 추가하여 정제된 해마 뉴런 배양에 OL을 첨가하였다.
- 2-3일마다 공동 배양 배지의 절반을 새로 고칩니다.
참고: 공동 문화권은 최대 24DIV까지 유지할 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜에서, OL 혈통 세포는 성상 세포 및 마이크로 글리아를 흔들어 신경교 배양물로부터 정제된다. OL 배양물의 순도 및 자형질 검사는 신경교 마커15로면역 염색함으로써 평가될 수 있다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, OL 배양액은O4+세포의 90% ±4%, 85% ±7%NG2+ 세포, 4.7% ±2.1%PLP+ 세포의 경우, 7.2% ±2.5%의 세포가GFAP+ 성상세포(평균 ±S.D., n;3;3)를 가진 것으로 나타났다. 그림 2). 또한, 4.6% ±0.7% 세포의 CD11b+ 미세교세포(평균±S.D., 도시되지 않음)를 하였다.
이러한 배양물로부터 생성된 OCM은 정제된 해마 뉴런 배양에 3 DIV에서 첨가될 수 있다. 이 치료는 절제된 단백질의 군집을 촉진, Neurofascin와 관련 된 Nav 채널으로 구성 186 그리고 Ankyrin G 해 마 gabaergic 뉴런의 축삭을 따라, 에서 17 DIV(그림 3A,B). 참고로, 전기생리학적 기록은 이들 군집이 작용 전위증가전도(14)와연관되어 있음을 밝혔다. 또한, Smi31에 의해 염색된 인산화된 중간 필라멘트 단백질 H의 발현은 OCM 처리된 해마 뉴런에서 증가된다(도3A). Oligodendroglial 분 비 요인은 따라서 신경 성숙 및 생리학에 연루.
해마 뉴런의 수레네이션은 14 DIV에서 OL의 첨가를 통해 연구될 수 있다. 20 DIV에서 24 DIV까지, 미엘린 기본 단백질(MBP)과 같은 미엘린 마커의 면역 염색은 미엘린 분절의 시각화를 허용한다(그림4).
그림 1: OL 계보 셀 격리 및 OCM 생산의 프로토콜 타임라인. P2 Wistar 쥐로부터 대뇌 피질 을 해부 한 후 (단계 4), 배양 신경교 세포에 조직 해리를 수행 (단계 5). 8, 12 및 15 DIV (즉, 흔들기 전 일)에서 따뜻한 DMEM-10 % FCS (6 단계)로 반 중간을 갱신하십시오. 다음날, 37°C(단계 7.2)에서 250 rpm에서 밤새 신경교 배양액을 흔들어. OL 혈통 세포와 몇 개의 마이크로글리아 세포를 함유하는 상판을 수확하고 5%CO2 미만에서 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 15분 동안 플레이트하였다(단계 8.3 내지 8.7). 원심분리기는 423 x g에서5분 동안 상류를, BS로 세포 펠릿을 재중단하고 37°C에서 5%CO2(단계 8.8 내지 8.12단계)에서 가습된 인큐베이터에서 2일 동안 배양한다. OCM을 생성하려면, NB-B27low에서 2일 동안 배양한다(단계 9). 공동 배양 실험을 위해 올을 분리하려면 트립신을 사용하여 세포를 분리합니다(단계 11.3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 배양에서 OL 혈통 세포 표현형. 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 획득되었다. 최대 강도 투영이 표시됩니다. (A)OL 배양체는 대부분 사전 OL(즉, NG2(적색) 또는 O4(녹색) 및 NG2(적색)만 발현하는 것)을 포함하며, 두 마커를 모두 발현하는 세포는 노란색 별으로 표시되지만, 일부 미성숙한 OL(즉, O4만 발현하고 NG2가 아닌 백색 별)을 함유한다. (B)몇몇 성숙한 OLS (즉, PLP+; 녹색) 및 몇몇 성상 세포 (GFAP+ 세포; 적색)는 OL 계보 세포 배양물에서 발견된다. 배율 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표 응용 프로그램. (A, B) 3 DIV에서 OCM으로 처리된 해마 뉴런은 17 DIV에서 고정되어 인산화된 중간 필라멘트 단백질 H(Smi31; 녹색; 패널 A)를 발현한다. GABAergic 뉴런, 조미료 decarboxylase 이소폼에 의해 확인 67 kDa (GAD67) 발현 (흰색), 안키린 G와 Nav 나트륨 채널의 디스플레이 축적 (빨간색; 패널 A와 B, 각각) 축삭을 따라 Ankyrin G와 Nav 클러스터를 형성 (패널 A 및 B). 배율 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표 응용 프로그램. OL 계보 세포는 14 DIV에서 해마 뉴런 배양에 첨가되어 일부 해마 축을 myelinate, 여기에 23 DIV (미엘린 마커로서 MBP; 녹색)에 고정된다. Ranvier의 노드 (Nav; 빨간색)는 미엘린 세그먼트 사이에서 관찰됩니다. 배율 표시줄 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 보텐슈타인 사토 (BS) 미디어 | 최종 농도 |
| 덜베코의 수정된 독수리 매체 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 100 IU/mL |
| 아포-트랜스퍼린 휴먼 | 100 μg/mL |
| BSA (소 세럼 알부민) | 100 μg/mL |
| 인슐린 | 5 μg/mL |
| PDGF | 10 ng/mL |
| Progesterone | 62 ng/mL |
| 푸레신 디하이드로클로라이드 | 16 μg/mL |
| 셀레네 나트륨 | 40 ng/mL |
| T3 (3,3', 5-트리오도-L-티로닌 나트륨 소금) | 30 ng/mL |
| T4 (L-티록신) | 40 ng/mL |
표 1: 보텐슈타인-사토(BS) 미디어의 준비.
| NB-B27 로우 미디어 | 최종 농도 |
| 신경 분비 | |
| B27 보충제 | 0.5배 |
| L-글루타민 | 0.5 mM |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 100 IU/mL |
| NB-B27 미디어 | 최종 농도 |
| 신경 분비 | |
| B27 보충제 | 1x |
| L-글루타민 | 0.5 mM |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 100 IU/mL |
표 2: NB-B27low 및 NB-B27 용지의 제조.
| 공동 문화 미디어 | 최종 농도 |
| 덜베코의 수정된 독수리 매체 | 1 vol |
| 신경 분비 | 1 vol |
| B27 보충제 | 1x |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 100 IU/mL |
| 아포-트랜스퍼린 휴먼 | 50 μg/mL |
| 비오 틴 | 10 ng/mL |
| BSA (소 세럼 알부민) | 50 μg/mL |
| 세룰로플라스민 | 100 ng/mL |
| 하이드로코르티손 | 0.05 μM |
| 인슐린 | 5 μg/mL |
| N-아세틸-L-시스테인 | 5 μg/mL |
| Progesterone | 6.2 ng/mL |
| 퍼트르신 | 16 μg/mL |
| 재조합 인간 CNTF | 0.1 ng/mL |
| 셀레네 나트륨 | 5 ng/mL |
| T3 (3,3', 5-트리오도-L-티로닌 나트륨 소금) | 40 ng/mL |
| 비타민 B12 | 27.2 ng/mL |
표 3: 공동 문화 매체의 준비.
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Discussion
여기서, 우리는 혼합 신경교 배양으로부터 고도로 농축된 올리고덴드로글리알 계보 세포 배양체를 얻기 위한 상세한 프로토콜을 제공하며, 이전에 발표된 방법16으로부터적응하고, OL-컨디셔닝 배지의 후속 생산을 제공한다. 이러한 흔들림 기술은 비용이 많이 들이지 않고, 3회 반복될 수 있으며, PDGFα를 함유하는 보텐슈타인-사토(BS) 배지에서 배양된 세포로서 다량의 정제된 올을 얻는 것이 최적이다. 신경교 세포는 P2에서 위스타 래트의 대뇌 피질 로 제조되며, 이는 올리고덴드로글리알 혈통 세포의 대다수가 NG2 및 O415를발현하는 프리올리고덴드로시트인 시점이다. 참고로, OL 혈통 성숙은 마우스 및 래트에서 P2에서 유사하며, 이 프로토콜은 또한 마우스 프리-올리고벤드로시트(17)를 분리하는데 사용될 수 있다.
혼합 된 신경교 세포 배양을 흔들어 후, 분리 된 세포는 주로 oligodendroglial 혈통 세포로 구성, 뿐만 아니라 일부 미세 교세포 세포와 몇 점성술. 미세 교세포는 코팅되지 않은 페트리 접시에 차동 접착을 통해 제거됩니다. 참고로, 추가적인 접착 단계를 수행함으로써 제거 효율을 향상시킬 수 있다. 그러나, microglial 세포의 대략 5%는 성상 세포의 5% 에서 9%뿐만 아니라 농축된 oligodendroglial 세포 배양에서 아직도 있습니다. O4 항체 코팅 페트리 접시를 사용하여 추가적인 면역 패닝 단계를 수행함으로써 성상 세포로부터의 오염을 5% 미만으로 감소시킬 수 있습니다. 자세한 프로토콜에 대한 프리먼 외14에서보충 정보를 참조하십시오 . 올리고덴드로글리알 세포를 도금한 후 2시간 동안 파편을 제거하는 것은 파이펫에 가해지는 유량의 강도에 의존하는 중요한 단계이다. 이 단계에서, 너무 많은 파편의 존재가 세포 생존및 성장을 손상시킬 수 있기 때문에 효율성을 확인하기 위해 클리어 전후현미경하에서 배양을 검사하는 것이 중요하다. 참고, 그것은 또한 갓 만든 BS 매체를 사용 하는 것이 중요 하다, 그렇지 않으면 oligodendrocytes 생존을 변경할 수 있습니다. 또한, 정제 된 세포는 도금 후 6 일까지만 생존합니다. 실제로, 다른 신경교 세포 및 뉴런은 분비 인자 또는 직접 접촉을 통해 OPC 생존 및 증식 또는 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다2,18.
다른 방법은 O4 항체로 면역 라벨링을 한 다음 유세포 분석 (FACS) 또는 자기 활성화 세포 선별 (MACS)에 의한 형광 활성화 세포 선별을 사용하여 뇌 해리 직후에 OLs 격리를 허용합니다. 또한, GFP 양성 OPCs 또는 GFP 양성 올리고드로시트는 PDGFαR:GFP 또는 PLP:GFP 마우스로부터형광 활성화 세포 선별에 의해 각각19,20으로정제될 수 있다. 이 분류 방법은 그들의 표현형을 바꿀 수 있는 성장 인자로 취급된 문화에 비교된 oligodendrocytes의 생리적인 상태를 공부를 위해 더 관련이 있습니다. 특히, 형광 활성화 세포 선별은 정상 생리적 상태 및 탈수초화조건(21)에서유전자 프로파일링 접근법에 사용되어 왔다. 세포 생존은 세포 분류에 의해 변경될 수 있기 때문에, 분류 후에 기능적인 검사를 즉시 능력을 발휘하는 것이 좋습니다.
우리는 OL 배양물이 14 DIV에서 정제 된 해마 뉴런 배양에 분리되고 추가 될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 OL-뉴런 공동 배양은 공동 배양의 첫 주 동안 시작되는 myelination의 초기 단계의 연구를 허용합니다 (Dubessy, 미공개 결과). OL-해마 뉴런의 다른 모델은22,23을분류한 직후 올리고엔드로시트를 첨가함으로써 공동 배양에 달성되었다. 게다가, 우리는 OL-뉴런 상호 작용을 더 해부하고 신경 문화에 OL 분비 인자의 역할을 해결하기 위해 OCM을 생산했습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 해마 GABAergic 뉴런 아류형 (즉, parvalbumin+ 및 / 또는 소마토스타틴+)균질화 이전에 OCM에 의해 유도되는 축세포를 따라 결절 단백질의 클러스터를 형성 할 수 있음을 입증14,24. OCM의 질량 분광 분석은 몇몇 분비된 단백질을 해명하고 세포외 매트릭스 단백질과의 시너지 효과에서 결절 클러스터링24의초기 단계를 중재하는 올리고겐드로글리알 Contactin-1을 식별하도록 이끌었다. 1차 배양은 올리고드로글리알 계보 세포 분화 및 뉴런과의 상호작용을 평가할 수 있는 유용한 모델이다. 그러나, 다른 접근법은 또한 전임상 연구의 최종 단계에서 필요한 제브라피시 및 올챙이모델(27)과 함께, 생체내 소뇌 자뇌 자수, 탈수레 및 레미노이션을 평가하기 위해 개발되었다.
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Disclosures
저자 들 중 어느 누구도 경쟁적인 이해관계나 상충하는 이해관계가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 원고 편집에 대한 그의 현명한 조언에 대한 레미 론자노에게 감사드립니다. 이 작품은 ICM, INSERM, NSF에 ARSEP 재단 보조금, 부베 라브루예르 가격에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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