Summary
להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.
Abstract
במערכת העצבים המרכזית, oligodendrocytes הפוך ידועים בתפקידם ב אקסון מיאלונציה, האיצה את התפשטות הפוטנציאל של הפעולה באמצעות הולכה מוכרת. יתר על כן, מספר גדל והולך של דיווחים מראים כי oligodendrocytes הפוך אינטראקציה עם נוירונים מעבר מיאלואידית, בעיקר באמצעות הפרשה של גורמים מסיסים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר טיהור של תאים oligodendroglial היוחסין מתרבויות התאים גליה גם מכיל האסטרוציטים ותאי microglial. השיטה מסתמכת על לילה רועד ב 37 ° c, אשר מאפשר התנתקות סלקטיבית של תאים oligodendroglial ותאי microglial, ואת חיסול של מיקרוגלייה על ידי הדבקה דיפרנציאלית. לאחר מכן נתאר את התרבות של oligodendrocytes הפוך וייצור מדיום ממוזג (OCM). כמו כן, אנו מספקים את קינטיקה של טיפול OCM או oligodendrocytes הפוך נוסף על נוירונים מטוהרים היפוקמאל בניסויים שיתוף תרבות, לימוד אינטראקציות אוליגודנדרוציטים-נוירונים.
Introduction
Oligodendrocytes הפוך (OLs) הם תאים גליאל של מערכת העצבים המרכזית (CN) היוצרים גלישת מיאלין סביב axons. OLs מקורם אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (OPCs) אשר מתרבים בתוך האזורים החדרית של ה-CN העובריים ולאחר מכן להעביר ולהבדיל ל-OLs בוגרת לחלוטין (כלומר, מיאלין ויוצרים תאים)1. OPCs הם שופע במהלך התפתחות מוקדמת, אבל גם להתמיד במוח המבוגר שבו הם מייצגים את האוכלוסייה הגדולה מתרבים תאים2. אחד משני מספר אקסונים בחלקים שאינם להתרגש (כלומר, internodes), ואת הקצה של כל לולאה מיאלין מתחבר אקסונים להרכיב את מתחם פרבודאל אשר חיוני עבור תכונות בידוד של מיאלין1,3. בין הפרפרדות ישנם פערים קטנים ללא מיאלואידית המכונים הצמתים של רנייה. צמתים אלה עשירים בערוצי נתרן מגודרת מתח (ניווט), המאפשר התחדשות והתפשטות מהירה של פוטנציאל הפעולה באמצעות הולכה המלח4. זה אינטראקציה הדוקה גם מאפשר לתמיכה באנרגיה סיבי באמצעות ספיגה עצבית של לקטט מ-OLs5,6.
ההבשלה של תאים oligodendroglial השושלת ואת תהליך מיאלונציה מוסדר בחוזקה על ידי האינטראקציות שלהם עם נוירונים7. אכן, OLs ו-OPCs, בשם גם NG2 תאים, לבטא מערך של קולטנים עצביים, והוא יכול לקבל קלט מפני הנוירונים והדיכוי הדיכוי, המאפשר להם לחוש פעילות עצבית שיכולה לעורר את התפשטות שלהם ו/או בידול לתאים מיאלואידית2. בתורו, opcs/OLs להפריש מיקרושלפוחיות וחלבונים לתוך החלל מתוך מסחטות אשר בלבד או סינגיסיסטי מתווך neuromodulative ופונקציות נוירוגינים8,9,10,11,12. עם זאת, מנגנונים מולקולריים שליטה על מצבים מרובים של אינטראקציות בין תאי השושלת oligodendroglial ונוירונים עדיין להיות מפוענח לחלוטין.
כמו-כן, במספר מצבים פתולוגיים, מושפעות בעיקר, ובכך מטרידים את האינטראקציה שלהם עם נוירונים. למשל, טרשת נפוצה (MS), תפקוד נוירולוגי נגרמת על ידי deמיקוד מוקד ב-cn, משני לאובדן OLs שיכול להוביל לנזק סיבי הצטברות נכות קשורה. מחדש יכול להתרחש, אם כי לא מספיק ברוב המקרים13. התקדמות בעשור האחרון, בשל התפתחות של טיפולים חיסוני, יש להפחית את שיעור הנסיגה אבל לקדם את השרידים מיאלונציה כדי לצאת הצורך בלתי מתקיים. ככזה, הבנה טובה יותר של התפקידים, פונקציות והשפעות הוא עניין מיוחד לפיתוח של טיפולים חדשים לספקטרום רחב של תנאי ה-CN.
כאן, אנו מתארים את שיטות הטיהור והתרבות של הולים. הדבר מאפשר בדיקה מדויקת של מנגנונים פנימיים המסדירים את התפתחותם ואת הביולוגיה. בנוסף, מאוד מועשר בתרבויות מסוג OLs מאפשרים ייצור של בינוני ממוזג (OCM), אשר ניתן להוסיף לתרבויות נוירונים מטוהרים כדי לקבל תובנה לתוך ההשפעה של גורמים מופרשים על פיזיולוגיה נוירואליות וקישוריות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד ליישם במערכת תרבות שיתוף מחוץ לגוף החברה שבו מטוהרים oligodendrocytes הפוך ונוירונים משולבים יחד, המאפשר לטפל במנגנון הוויסות (re) מיאלונציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול והשימוש בחולדות בניסוי זה תואמים למדיניות ולהנחיות המוסדיים (UPMC, INSERM, והוראת מועצת הקהילה האירופית 86/609/EEC). הפרוטוקול הבא מבוסס על המלטה הסטנדרטית של 12 גורים.
1. הכנת מבחנות (~ 5 דקות)
הערה: בצע את השלבים הבאים ביום שלפני הניתוח בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- מעיל 150 ס"מ2 מבחנות (T150) עם כובע מסנן (1 בקבוקון עבור 2 גורים) באמצעות 5 מ ל פוליאתילן (פיי, 100 Mg/L, ראה פרוטוקול בקובץ משלים 1).
- לאחסן את מבחנות ב 4 ° c בלילה.
- לשטוף צלוחיות מצופה 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי ביום של ניתוח.
2. הכנת מדיה (~ 10 דקות)
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- להכין 500 mL של בינוני התרבות, המורכב של מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו פניצילין-סטרפטומיצין (100 IU/mL).
- להכין 20.6 ml של העיכול האנזים בינוני בצינור 50 ml, המורכב 20 מ ל של dmem, 200 μl של dnase (50 μg/ml), 200 μl של פפאין (30 U/ml) ו-200 μl של l-cysteine (0.24 mg/ml).
- סינון-לחטא את המדיה באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
- השאר את המדיה במכסה הזרימה הלבינארי בטמפרטורת החדר (RT) עד לחיתוך.
3. הכנה לחיתוך (~ 10 דקות)
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- הכינו 100 מ"ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS; 1x). סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
- להכין 50 mL של הקרח קר 1x PBS הפתרון שיושלם עם 750 μL של 45% גלוקוז. סינון מסננים באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
- ממלאים צלחת פטרי 100 מ"מ עם PBS 1 x עבור כלי ניקוי ו 3 60 מ"מ מנות פטרי עם הקרח קר PBS-גלוקוז לקצירת רקמות. שימי את צלחות הפטרי. על הקרח עד לניתוח
4. חיתוך והרכבה
הערה: הניתוח מבוצע מפני כלבלבים של גברים ונשים ביום אחרי הלידה (P) 2.
- על מנת לספק סביבה סטרילית, ודא לנקות את הספסל עם 100% אתנול. לחטא את כל כלי הניתוח עם 100% אתנול.
- בעדינות לרסס את הצוואר של הגור עם 70% אתנול.
- השתמש במספריים כירורגיים גדולים כדי לערוף את ראשו של בעל החיים ולהניח את הראש בצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ, המכילה קרח קר-מסוכר-PBS.
- השתמש מלקחיים מעוקל כדי לשמור על ראש החיה בגובה העיניים. השתמש במספריים כירורגי קטן כדי ליצור חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת בעקבות המוח באמצע הקו.
- השתמש מלקחיים כדי לקלף בעדינות את שני חלקי הגולגולת מאמצע הקו.
- השתמשו בכפית כירורגית קטנה כדי להסיר את המוח מחלל הראש. הכניסו את המוח לצלחת פטרי ב60 מילימטר המכילה את הקרח הקר-גלוקוז על הקרח.
- הצגת תחת steromicroscope, השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את המוח העורקי, את המוח ואת נורות הריח מהמיאונות מוחין.
- השתמש מלקחיים עדינים כדי להפריד בין שתי אונות המוח. השתמש בלקחיים עדינים. כדי לקלף את הקרום שימו את מערבולות המוח. בצלחת 60 מ"מ בקרח
הערה: הקרח הקר PBS הוא קריטי להסרת הקרומי הקרום הנכון.
5. הדיסוציאציה מרקמת
הערה: בצע את השלבים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- השתמש באזמל חד כדי לקצוץ. את מסדר המוח להעביר את הרקמה הטחון לתוך צינור 50 mL המכיל מדיום העיכול האנזים.
- דגירה של 30 דקות בתוך מחולל לחות בחממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
- השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להסיר בעדינות את המדיום עיכול האנזים תוך כדי לוודא כי רקמת קליפת העור נשאר בתחתית הצינור 50 mL.
- השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להוסיף 1 מ ל של dmem-10% fcs ובעדינות קצוצות את הרקמה.
- השתמש מסנן 70 יקרומטר ובוכנה של מזרק 1 mL כדי לסנן את רקמת הקליפת העור לתוך צינור 50 mL.
הערה: ניתן לשטוף שרידי רקמות על קיר הצינור הפנימי מספר פעמים עם DMEM-10% FCS. - מלאו את צינור 50 mL עם DMEM-10% FCS. צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant והשהה מחדש את הגלולה תא עם 2 מ ל-10% fcs.
- בעדינות הטריטורטה עם כp1000 מיקרופיפטה ולאחר מכן עם מיקרופיפטה p200. דלל את ההשעיה של התא בנפח המתאים של DMEM-10% FCS.
הערה: שני מוחות = 1 T150 = 5 מ ל של DMEM-10% FCS. - צלחת 5 מ ל של השעיה התא על T150 בצפיפות של 1 x 105 תאים/ס"מ2. הוסף 20 מ ל של DMEM חם-10% FCS לכל T150. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
- לחדש את המחצית של מדיום התרבות לאחר 6 ימים ב-"מתורבת" (DIV) עם DMEM חם 10% FCS.
6. הכנה לטלטול
- לבצע הכנה לרעוד ביום לפני לרעוד בתוך מכסה זרם למינארי בתנאים סטרילי.
- לחדש מחצית מדיום התרבות על-ידי הוספת מדיום חדש לתרבות חם לתוך הבקבוקון ואת הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
7. טלטול
- מעיל 3 100 מ"מ מנות פטרי עם פיי. אחסן אותם ב -4 ° c בלילה.
- לכסות את כובע מבחנות עם סרט פרפין ולשים את צלוחיות לתוך שקית ניילון. לנער מבחנות המכילות תאים גליה לילה ב 250 rpm ב 37 ° c.
הערה: הטלטול הראשון מבוצע ב-8 DIV ואחד יכול לבצע עד שלושה מלכים שונים (ראה איור 1 לתזמון).
8. OL תאים השושלת קצירת ותרבות
הערה: יש לבצע צעדים אלה בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- ביום שלאחר הטלטול, הכינו את המדיום בונשטיין-סאטו (BS) לפי שולחן 1.
- שוטפים מנות פטרי מצופות 3 פעמים עם מים מזוקקים סטרילי.
- מבחנות הקציר ' supernatant המכיל בעיקר OL השושלת תאים אבל גם כמה תאים microglial ולוחית אותו על שאינם מצופים 100 mm מנות פטרי.
הערה: שלב זה מאפשר הסרה של תאים microglial דרך הדבקה מהירה דיפרנציאלית על משטח המנה. - מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.
- למלא כל T150 בקבוקון עם 25 מ ל של מדיום התרבות חם טרי מוכן מודטה בחממה מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2 עד הרעד השני.
- העבירו את הסופרנטאנט מצלחות פטרי לתוך מנות פטרי חדשות שאינן מצופות 100 מ"מ כדי לאפשר הדבקה של תאי microglial שיורית.
- מכבית את מנות פטרי במשך 15 דקות באינקובטור מחולל ב37 ° c תחת 5% CO2.
- הסר את הסופרנטאנט, המכיל תאי שושלת היוחסין של OL שאינו חסיד, והעבר אותו לצינורות 50 mL (סופרנטאנט מ -2 מנות פטרי לצינור 50 mL). התעלם מצלחות פטרי מצופה microglia.
- צנטריפוגה את הסופרנטאנט במשך 5 דקות ב 423 x g. הסר בזהירות את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה עם 1 mL של BS בינונית. הבריכה כל כדורי בצינור 50 mL משותף ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 mL עם BS בינונית.
- קביעת צפיפות התא לספירת תאים תחת מיקרוסקופ.
הערה: יש להשיג צפיפות תא בין 3 x 105/ml ו-5 x 105/ml. - הוסף 20 מ ל BS אם צפיפות התא גבוהה יותר או שווה ל-4 x 105/mL כדי לקבל נפח סופי של 30 מ"ל, או להוסיף רק 10 מ ל BS אם צפיפות התא היא פחות מ 4 x 105/ml כדי לקבל נפח סופי של 20 mL.
- צלחת שניים או שלושה מצופה מראש 100 מ"מ מנות פטרי עם 10 מ ל של השעיית תאים. מודטה באינקובטור מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
- לנקות את ההריסות מן הצלחות פטרי על ידי רענון כל BS בינונית 2 h מאוחר יותר.
הערה: בדוק את התרבות תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי ניקוי כדי לוודא צפיפות התא ויעילות של הסרת פסולת. - דגירה עבור 2 ימים ב BS בינונית בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
הערה: בחנו את התרבות שמתחת למיקרוסקופ. המפגש אמור להיות 70% עד 80%.
9. ייצור OCM
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- הכיני NB-B27low בינונית לפי שולחן 2.
- חידוש בינוני התרבות עם 10 מ ל מדיום חם NB-B27low. דגירה עבור 2 ימים בתוך מחולל החממה ב 37 ° c תחת 5% CO2.
- לקצור את OCM, כלומר, supernatant המכיל גורמים מופרש OL. סינון-לחטא ocm באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר.
הערה: אחסן OCM ב -4 ° c עבור מקסימום 2 חודשים.
10. תוספת OCM
הערה: יש לבצע את הצעדים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. OCM ניתן להוסיף מטוהרים היפוקמאל תרבויות עצב מוכן על פי הפרוטוקול הבא14, ומושגת על ידי הוספת, 24 שעות לאחר בידוד, סוכני anti-mitotic ומקבל 5-fluorאודלדין (5 μm) עבור 36 h.
- ב 3 DIV, להסיר את כל בינוני תרבות העצב המכיל anti-mitotic סוכנים ולהוסיף 500 μL של חדש חם OCM.
- לחדש חצי בינוני כל 3 ימים עם חם תוצרת NB-B27.
הערה: ניתן לשמור על תרבויות כאלה עד 21 DIV.
11. הוספת מטהר לתרבות הנוירונים
הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה זרימה למינארי בתנאים סטריליים. ניתן להוסיף כלים לתרביות מטוהרים היפוקמאל באותו אופן כפי שמתואר לעיל.
- הכינו מדיום לשיתוף התרבות לפי שולחן 3.
- לאחזר את התרבות OL ב 70% כדי 80% זרימה. לשטוף עם 2 מ"ל של חם 1x PBS.
- כדי לנתק את התאים, הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין לצלחת פטרי 100 מ"מ.
- מודטה עבור 5 דקות בחממה לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2.
- הוסף 2 מ ל של DMEM-10% FCS כדי לחסום את התגובה האנזימטית. לקצור את הסופרנטנט המכיל תאים השושלת OL.
- צנטריפוגה ב 423 x g עבור 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר supernatant ולהשעות את הגלולה התא במדיום התרבות המשותף חם כדי לקבל ריכוז של 1.25 x10 תאים/ mL.
- הוסף OL לתרבות הנוירונים מטוהרים היפוקמאל על ידי הסרת 200 μL של בינוני תרבות העצב והוספת 200 μL של התא ההשעיה לכל טוב (2.5 x 104 תאים/גם) של צלחת 24.
- לרענן חצי מדיום שיתוף התרבות כל 2-3 ימים.
הערה: ניתן לשמור על תרבויות שיתוף עד 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, תאים השושלת OL מטוהרים מתרבויות גליה על ידי ניעור האסטרוציטים ו microglia. טוהר הבדיקה פנוטימית של תרבויות OL יכול להיות מוערך על ידי הכתמים עם סמנים גליה15. ניתוח הביטוי של סמנים שונים עולה כי תרבויות OL היו בעיקר pre-OLs עם 90% ± 4% של O4+ תאים, 85% ± 7% NG2+ תאים, ו 4.7% ± 2.1% של plp+ תאים, בעוד 7.2% ± 2.5% של תאים היו gfapו אסטרוציטים (ממוצע ± ש גויטיין, n = 3; איור 2). בנוסף, 4.6% ± 0.7% התאים היו CD11b+ תאים microglial (ממוצע ± ש גויטיין, לא מוצג).
OCM המיוצר מתרבויות כאלה ניתן להוסיף ב 3 DIV כדי מטוהרים היפוקמאל תרביות עצב. טיפול זה מקדם את האשכולות של חלבונים קטרי, המורכב של Nav ערוצים המשויכים neurofascin 186 ו ankyrin G לאורך אקסון של היפוקמאלהנוירונים gabaergic לפני המיאלונציה, ב 17 DIV (איור 3A, B). של הערה, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חשפו כי אשכולות אלה קשורים הולכה מוגברת של הפעולה פוטנציאל14. בנוסף, ביטוי של חלבון פילמנט ביניים זרחאני ומוכתם על ידי Smi31 הוא גדל ב-OCM מטופלים היפוקמאל נוירונים (איור 3A). גורמים Oligodendroglial מופרש ולכן מעורבים בהבשלה עצבית ופיזיולוגיה.
מיאלונציה של נוירונים היפוקמאל ניתן ללמוד באמצעות תוספת של OL ב 14 DIV. מ 20 DIV ל 24 DIV, כתמים חיסוני של סמנים המיאלין, כגון חלבון בסיסי של מיאלין (MBP) מאפשר ויזואליזציה של מקטעי המיאלין (איור 4).
איור 1: ציר זמן של פרוטוקול של בידוד תאים השושלת OL ו-OCM הייצור. לאחר מנתח המוח מתוך מוחין מ P2 וויסטאר חולדות (שלב 4), לבצע דיסוציאציה רקמות לתאי גליה התרבות (שלב 5). ב-8, 12 ו-15 DIV (כלומר, ימים לפני הטלטול), לחדש חצי בינוני עם DMEM חם-10% FCS (שלב 6). למחרת, לנער תרבויות גליה לילה ב 250 rpm ב 37 ° צ' (שלב 7.2). הקציר סופר המכיל תאים השושלת OL ומספר תאים מיקרוגלייה ולוחית אותו עבור 15 דקות בחממה מחולל לחות ב 37 ° c תחת 5% CO2 (שלבים 8.3 כדי 8.7). צנטריפוגה את supernatant עבור 5 דקות ב 423 x g, השהה מחדש את כדור התאים עם BS ו דגירה עבור 2 ימים בתוך מחולל לחות ב-37 ° צ' תחת 5% CO2 (שלבים 8.8 כדי 8.12). כדי לייצר OCM, מודטה עבור 2 ימים ב-NB-B27low (שלב 9). כדי לבודד את הולים לניסויים בתרבות השותפת, התנתק תא באמצעות טריפסין (שלב 11.3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שושלת היוחסין התאים פנוטיפ בתרבויות. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונמוקד. מוצגים תחזיות אינטנסיביות מרביות. (א) התרבויותמכילות בעיקרPre-OLs (כלומר, ביטוי רק NG2 (אדום), או שניהם O4 (ירוק) ו NG2 (אדום); תאים המבטאים שני סמנים מסומנים עם כוכבים צהובים), אבל גם כמה OLs בוגרים (כלומר, רק לבטא O4 ולא NG2; כוכבים לבנים). (ב) כמה OLs בוגרים (כלומר, plp+; ירוק) ומספר אסטרוציטים (gfap+ תאים; אדום) נמצאים בתרבויות תא היוחסין של OL. קנה מידה של פסים = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יישומים מייצגים. (א, ב) נוירונים היפוקמוניים שטופלו עם OCM ב 3 DIV ו קבוע בשנת 17 הבטא המהירה האקספרס של החלבון (Smi31; ירוק; פאנל A). Gabaergic נוירונים, מזוהה על ידי גלוטמט decarboxylase של 67 kda (GAD67) ביטוי (לבן), הצטברות התצוגה של ankyrin G ו-nav נתרן ערוצים (אדום; פאנלים A ו-B, בהתאמה) ב אקסון קטע ראשוני וטופס ankyrin G ו-Nav אשכולות לאורך אקסון שלהם (פאנלים A קנה מידה של פסים = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: יישומים מייצגים. תאים השושלת OL הוסיף לתרבות תא ההיפוקמאל בשנת 14 DIV מיאלואידית כמה axons היפוקמונים, כאן קבוע ב 23 DIV (MBP כמו סמן מיאלין; ירוק). צמתים של Ranvier (Nav; אדום) נצפו בין פלחי המיאלין. סרגל קנה מידה = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בונשטיין-סאטו (BS) מדיה | ריכוז סופי |
| בינונית הנשר השונה של dulbecco | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin | 100 μg/mL |
| BSA (סרום של שור) | 100 μg/mL |
| אינסולין | 5 μg/mL |
| מיכל בע | 10 ng/mL |
| פרוגסטרון | 62 ng/mL |
| ריקבון דהידרוכללוריד | 16 μg/mL |
| סודיום סלניט | 40 ng/mL |
| T3 (3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine נתרן מלח) | 30 ng/mL |
| T4 (L-תירוקסין) | 40 ng/mL |
שולחן 1: הכנת מדיית בונשטיין-סאטו (BS).
| NB-B27 מדיה נמוכה | ריכוז סופי |
| נוירובסיס | |
| תוספת B27 | 0.5 x |
| ל-גלוטמין | 0.5 ממ ' |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 IU/mL |
| NB-B27 מדיה | ריכוז סופי |
| נוירובסיס | |
| תוספת B27 | 1x |
| ל-גלוטמין | 0.5 ממ ' |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 IU/mL |
שולחן 2: הכנת NB-B27low ו-NB-B27 מדיה.
| מדיה שותפה לתרבות | ריכוז סופי |
| בינונית הנשר השונה של dulbecco | 1 כדורעף |
| נוירובסיס | 1 כדורעף |
| תוספת B27 | 1x |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin | 50 μg/mL |
| ביוטין | 10 ng/mL |
| BSA (סרום של שור) | 50 μg/mL |
| Ceruloplasmin | 100 ng/mL |
| ידרוקורטיזון | 0.05 μM |
| אינסולין | 5 μg/mL |
| מרחש-ל-ציסטאין | 5 μg/mL |
| פרוגסטרון | 6.2 ng/mL |
| ריקבון | 16 μg/mL |
| רקומביננטי האדם CNTF | 0.1 ng/mL |
| סודיום סלניט | 5 ng/mL |
| T3 (3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine נתרן מלח) | 40 ng/mL |
| ויטמין B12 | 27.2 ng/mL |
שולחן 3: הכנת התקשורת הבין-תרבותית.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לקבל מועשר ביותר oligodendroglial היוחסין תרבויות תאים מתרבויות גליה מעורבים, מותאם מתוך שיטה שפורסמה בעבר16, ואת הייצור הבא של מדיום ממוזג. טכניקה זו רועדת לא יקר, ניתן לחזור שלוש פעמים והוא אופטימלי להשיג כמות גבוהה של מטוהרים מטוהר, כמו תאים התרבותי בבונשטיין-סאטו (BS) בינוני המכיל PDGFα מתרבים. התאים glial מוכנים באמצעות מוחין של חולדות Wistar ב P2, נקודת זמן שבה רוב המכריע של התאים הoligodendroglial השושלת הם pre-oligodendrocytes הפוך להביע NG2 ו O415. של הערה, התבגרות השושלת OL דומה P2 בעכבר ועכברוש, ופרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד את העכבר pre-oligodendrocytes הפוך17.
לאחר לטלטל את התרבויות המעורבות גליה, תאים מנותקים בעיקר של תאים oligodendroglial השושלת, אבל גם כמה תאים microglial ומספר אסטרוציטים. תאים מיקרוגליאל מוסרים באמצעות הדבקה דיפרנציאלית על מנות פטרי שאינן מצופות. של הערה, יעילות ההסרה ניתן לשפר על ידי ביצוע צעד הדבקה נוסף. עם זאת, כ 5% של תאים microglial עדיין נמצאים בתרבויות מועשר oligodendroglial cell, כמו גם 5% כדי 9% של astrocytes. ניתן להקטין את הזיהום מאסטרוציטים לפחות מ -5% על-ידי ביצוע צעד נוסף החיסונית-גלילה באמצעות O4 מצופה נוגדן מנות פטרי; לפרוטוקול מפורט ראו מידע משלים בפרימן ואח '14. הסרת פסולת 2 h לאחר ציפוי תאים oligodendroglial הוא צעד קריטי, אשר מסתמך על חוזק של הזרימה מוחל עם pipet. בשלב זה, חשוב לבחון את התרבות תחת המיקרוסקופ לפני ואחרי ניקוי כדי לוודא את היעילות כמו נוכחות של פסולת יותר מדי עלול לפגוע בכדאיות התאים וצמיחה. לתשומת לב, חשוב גם להשתמש במדיום BS שנעשו טרי, אחרת זה יכול לשנות oligodendrocytes הפוך הישרדות. בנוסף, תאים מטוהרים לשרוד רק עד 6 ימים לאחר ציפוי. אכן, ידוע כי תאים אחרים גליה ונוירונים לקדם הישרדות opc והתפשטות או בידול דרך גורמים מופרש או אנשי קשר ישיר2,18.
שיטות אחרות מאפשרות בידוד OLs מיד לאחר דיסוציאציה המוח, באמצעות אימונויניום עם נוגדן O4 ואחריו מיון התא המופעל פלורסנט על ידי הזרמת cy try (FACS) או מגנטי המופעל מיון התא (מקינטוש). בנוסף, gfp-חיובי opcs או gfp-חיובי oligodendrocytes הפוך ניתן לטהר על ידי מיון תא פלורסנט מופעל מ PDGFαR: gfp או plp: עכברים gfp , בהתאמה19,20. שיטות מיון אלה רלוונטיות יותר לחקר המצב הפיזיולוגי של oligodendrocytes הפוך בהשוואה לתרבויות שטופלו בגורמי גדילה שיכולים לשנות את פנוטיפים שלהם. בעיקר, מיון התא המופעל על-ידי פלורסנט שימש לגישות ליצירת פרופיל גנטי במצב פיזיולוגי רגיל והתנאים המיאלומית121. כמו הישרדות התא יכול להיות שונה על ידי מיון התא, עדיף לבצע מאמר פונקציונלי מיד לאחר מיון.
הצגנו כי תרבויות OL ניתן להתנתק והוסיף לתרביות היפוקמאל מטוהרים בשנת 14 DIV. שיתוף התרבות הOL-בצורה כזו מאפשר לימוד של צעדים מוקדמים של מיאלואידית שמתחילה בשבוע הראשון של התרבות המשותף (Dubessy, התוצאות שלא פורסמו). מודלים אחרים של תא-היפוקמאל מיאלואידית התרבות שיתוף הoligodendrocytes הפוך על ידי הוספת מיידית לאחרמיון 22,23. יתר על כן, הצלחנו לייצר OCM כדי לנתח עוד יותר את האינטראקציות OL-נוירונים ולטפל בתפקיד של גורמים המופרשים-OL על תרבויות העצב. על-ידי שימוש בטכניקה זו, הדגמנו את תת-הצורה של מיני היפוגיים (כלומר, parvalbumin+ ו/או סומטוסטטין+) יכולים ליצור אשכולות של חלבונים מסוג קטרי לאורך אקסון אשר המושרה על ידי ocm לפני מיאלונציה14,24. ניתוח ספקטרומטר המסה של ocm הפכה למספר חלבונים המופרשים והובילו לזיהוי oligodendroglial קשר-1 שבסינרגיה עם חלבונים בעלי מטריצה מבעיים מדיטים את הצעדים המוקדמים של קטרי באשכולות24. התרבויות העיקריות הן מודלים שימושיים המאפשרים הערכה של בידול תא השושלת oligodendroglial ואינטראקציות עם נוירונים. עם זאת, גישות אחרות פותחו גם כדי להעריך פונקציות OL ו מיאלואידית, deמיאלונציה ו reמיאלונציה מפני לשעבר vivo המוח בתרבויות של הפרוסה25,26, ו ב vivo מחקרים, בעיקר עם מודלים דג זברה ו ראשן27 אשר נחוצים בשלבים הסופיים של מחקרים פרה-קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מתחרים או אינטרסים סותרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לרמי רוננזנו על עצתו הנבונה בעריכת כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי ICM, INSERM, מענק הקרן ARSEP כדי NSF, ו-Bouvet-Labruyère מחיר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
