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Neuroscience

सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए ओलिगोडेन्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट-वातानुकूलित माध्यम की पीढ़ी

Published: February 9, 2020 doi: 10.3791/60912
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1,2, 1
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

Summary

इसके साथ, हम ओलिगोडेन्रोसाइट्स की शुद्धि और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट-वातानुकूलित माध्यम के उत्पादन के लिए एक कुशल विधि प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Abstract

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स एक्सॉन माइलिनेशन में अपनी भूमिका के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, जो नमकीन चालन के माध्यम से कार्रवाई क्षमता के प्रचार को तेज करता है। इसके अलावा, रिपोर्टों की बढ़ती संख्या से पता चलता है कि ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स माइलेनेशन से परे न्यूरॉन्स के साथ बातचीत करते हैं, विशेष रूप से घुलनशील कारकों के स्राव के माध्यम से। यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो ग्लियल सेल संस्कृतियों से ओलिगोडेड्रोग्लिअल वंश कोशिकाओं की शुद्धि की अनुमति देता है जिसमें एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लियल कोशिकाएं भी होती हैं। विधि 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिलाते हुए पर निर्भर करती है, जो ओवरलाइंग ओलिगोडेंड्रोग्लिल कोशिकाओं और माइक्रोग्लियल कोशिकाओं की चयनात्मक टुकड़ी और अंतर आसंजन द्वारा माइक्रोग्लिया का उन्मूलन करने की अनुमति देती है। इसके बाद हम ओलिगोडेन्रोसाइट्स की संस्कृति और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट-वातानुकूलित माध्यम (ओसीएम) के उत्पादन का वर्णन करते हैं । हम ओलिगोडेन्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन का अध्ययन करते हुए सह-संस्कृति प्रयोगों में शुद्ध हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के अलावा ओसीएम उपचार या ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के काइनेटिक्स भी प्रदान करते हैं।

Introduction

ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स (ओएलएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की ग्लियल कोशिकाएं हैं जो एक्सोन के चारों ओर माइलिन लपेटन उत्पन्न करती हैं। ओएलएस ओलिगोडेन्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) से उत्पन्न होता है जो भ्रूण सीएनएस के वेंट्रिकुलर क्षेत्रों के भीतर पैदा होता है और फिर पूरी तरह से परिपक्व ओएलएस (यानी, मायलिन बनाने वाली कोशिकाओं)1में स्थानांतरित और अंतर करता है। प्रारंभिक विकास के दौरान ओपीसी प्रचुर मात्रा में होते हैं, लेकिन वयस्क मस्तिष्क में भी बने रहते हैं जहां वे प्रमुख प्रोलिफेरेटिव सेल जनसंख्या2का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक एकल राजभाषा गैर-उत्तेजनीय वर्गों (यानी, इंटरनोड्स) में कई एक्सोन को जोड़ता है, और प्रत्येक मायलिन लूप का किनारा पैरानोडल डोमेन बनाने वाले एक्सॉन को देता है जो माइलिन1,3के इन्सुलेट गुणों के लिए महत्वपूर्ण है। बीच में पैरानोड्स छोटे अमीलिनेट अंतराल होते हैं जिन्हें रैनविएर के नोड्स कहा जाता है। ये नोड्स वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनलों (एनएवी) से समृद्ध हैं, जिससे नमकीन चालन4के माध्यम से कार्रवाई क्षमता के उत्थान और तेजी से प्रचार की अनुमति मिल जाती है। इस कड़ी बातचीत से ओएलएस5,6से लैक्टेट के न्यूरोनल तेज के माध्यम से एक्सोनल एनर्जी सपोर्ट भी मिल ता है .

ओलिगोडेंड्रोग्लियाल वंश कोशिकाओं की परिपक्वता और माइलेनेशन प्रक्रिया को न्यूरॉन्स7के साथ उनकी बातचीत द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है । दरअसल, ओल और ओपीसी, ने एनजी2 कोशिकाओं का भी नाम लिया, न्यूरोट्रांसमीटर के लिए रिसेप्टर्स की एक सरणी व्यक्त की, और उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स से इनपुट प्राप्त कर सकते हैं, जिससे उन्हें न्यूरोनल गतिविधि को समझने की अनुमति मिलती है जो उनके प्रसार को ट्रिगर कर सकती है और/या myelinating कोशिकाओं में अंतर2। बदले में, ओपीसी/ओएलएस माइक्रोवेसिकल्स और प्रोटीन को बाह्य स्थान में स्रावित करते हैं जो अकेले या सहक्रियात्मक रूप से न्यूरोमोडुलेटिव और न्यूरोप्रोटेक्टिव कार्योंमें 8,9,10,11,12में मध्यस्थता करते हैं । हालांकि, ओलिगोडेंड्रोगियल वंश कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत के कई तरीकों को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को अभी पूरी तरह से समझमें नहीं आ रहा है।

इसके अलावा, कई सीएनएस रोग स्थितियों में, ओएलएस मुख्य रूप से प्रभावित होते हैं, इस प्रकार न्यूरॉन्स के साथ उनकी बातचीत को परेशान करते हैं। उदाहरण के लिए, मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) में, न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन सीएनएस में फोकल डिमायनेशन के कारण होता है, ओएलएस हानि के माध्यमिक होते हैं जो अक्षीय क्षति और संबंधित विकलांगता संचय का कारण बन सकते हैं। Remyelination जगह ले जा सकते हैं, हालांकि ज्यादातर मामलों में अपर्याप्त13। पिछले दशक में प्रगति, इम्यूनोथेरपी के विकास के कारण, पतन दर को कम किया है, लेकिन remyelination को बढ़ावा देने के लिए एक अपूरित जरूरत की तारीख बनी हुई है । इस प्रकार, ओएलएस भूमिका, कार्यों और प्रभावों की बेहतर समझ सीएनएस स्थितियों के व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए नए उपचारों के विकास के लिए विशेष रुचि है।

यहां, हम ओएलएस शुद्धि और संस्कृति के तरीकों का वर्णन करते हैं। यह उनके विकास और जीव विज्ञान को विनियमित करने वाले आंतरिक तंत्रों की सटीक जांच में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस तरह की अत्यधिक समृद्ध ओल संस्कृतियां ओलिगोडेनरोसाइट-वातानुकूलित माध्यम (ओसीएम) के उत्पादन की अनुमति देती हैं, जिसे न्यूरोनल फिजियोलॉजी और कनेक्टिविटी पर ओएलएस-स्रावित कारकों के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए शुद्ध न्यूरॉन संस्कृतियों में जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, हम वर्णन कैसे एक इन विट्रो सह संस्कृति प्रणाली को लागू करने के लिए जहां शुद्ध ओलिगोडेंट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स एक साथ संयुक्त कर रहे हैं, विनियमन तंत्र को संबोधित करने की अनुमति (पुनः) myelination ।

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Protocol

इस प्रयोग में चूहों की देखभाल और उपयोग संस्थागत नीतियों और दिशानिर्देशों (यूपीएमसी, INSERM, और यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देश 86/609/EEC) के अनुरूप है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल 12 पिल्ले के एक मानक कूड़े के लिए स्थापित किया गया है।

1. फ्लास्क की तैयारी (~ 5 मिन)

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में विच्छेदन से पहले दिन निम्नलिखित कदम प्रदर्शन करें।

  1. कोट 150 सेमी2 फ्लास्क (T150) फिल्टर कैप (2 पिल्ले के लिए 1 फ्लास्क) के साथ पॉलीथीनमाइन (पी, 100 मिलीग्राम/एल) के 5 मिलील का उपयोग करके, पूरक फ़ाइल 1में प्रोटोकॉल देखें।
  2. फ्लास्क को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. विच्छेदन के दिन बाँझ आसुत पानी के साथ 3 बार लेपित फ्लास्क कुल्ला।

2. मीडिया की तैयारी (~ 10 min)

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में कदम प्रदर्शन करते हैं।

  1. संस्कृति माध्यम के 500 मीटर तैयार करें, जिसमें डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) शामिल हैं, जो भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 आईयू/एमएल) के 10% के साथ पूरक हैं।
  2. 50 मिलीग्राम ट्यूब में एंजाइम पाचन माध्यम का 20.6 मिलील तैयार करें, जिसमें डीएमईएम का 20 मिलीएल, डीनएसे का 200 माइक्रोन (50 μg/mL), 200 माइक्रोन ऑफ पैकिन (30 यू/एमएल) और एल-साइस्टीन (0.24 मिलीग्राम/एमएल) का 200 माइक्रोन शामिल है।
  3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके मीडिया को फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
  4. विच्छेदन तक कमरे के तापमान (आरटी) पर लैमिनार प्रवाह हुड में मीडिया रखें।

3. विच्छेदन के लिए तैयारी (~ 10 min)

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में कदम प्रदर्शन करते हैं।

  1. कैल्शियम और मैग्नीशियम (पीबीएस; 1x) के बिना फॉस्फेट-बफर्ड लवण का 100 एमएल तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
  2. 45% ग्लूकोज के 750 माइक्रोन के साथ पूरक बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस समाधान के 50 मिलील तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज करें।
  3. सफाई उपकरणों के लिए 1x पीबीएस के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश और ऊतक संचयन के लिए बर्फ-ठंडा पीबीएस-ग्लूकोज के साथ तीन 60 मिमी पेट्री व्यंजन भरें। डरी व्यंजन ों को बर्फ पर विच्छेदन तक रखें।

4. विच्छेदन

नोट: विच्छेदन प्रसवोत्तर दिन (पी) 2 पर पुरुष और महिला Wistar चूहा पिल्ले से किया जाता है ।

  1. बाँझ वातावरण प्रदान करने के लिए, 100% इथेनॉल के साथ बेंच को साफ करना सुनिश्चित करें। 100% इथेनॉल के साथ सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें।
  2. धीरे-धीरे 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला की गर्दन को स्प्रे करें।
  3. जानवर को काटना और बर्फ ठंडा PBS-ग्लूकोज युक्त एक १०० मिमी पेट्री पकवान में सिर जगह के लिए बड़ी सर्जिकल कैंची का प्रयोग करें ।
  4. आंखके स्तर पर जानवर के सिर को बनाए रखने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। खोपड़ी के आधार पर एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग करें और मस्तिष्क मिडलाइन के बाद खोपड़ी को काट दें।
  5. मिडलाइन से खोपड़ी के दो हिस्सों को धीरे से छीलने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  6. सिर गुहा से मस्तिष्क को हटाने के लिए एक छोटे से सर्जिकल चम्मच का प्रयोग करें। बर्फ पर बर्फ-ठंडे पीबीएस-ग्लूकोज युक्त 60 एमएम पेट्री डिश में दिमाग लगाएं।
  7. एक स्टरोमाइक्रोस्कोप के नीचे देखना, सेरिबैलम, ब्रेनस्टेम और सेरेब्रल गोलार्द्धों से घ्राण बल्ब को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
  8. दो सेरेब्रल गोलार्द्धों को अलग करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। मेनिंग्स को छीलने के लिए बारीक संदंश का प्रयोग करें। बर्फ पर 60 एमएम पेट्री डिश में सेरेब्रल कॉर्टिस डाल दें।
    नोट: बर्फ ठंड PBS सही meninges हटाने के लिए महत्वपूर्ण है ।

5. ऊतक विच्छेदन

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में कदम प्रदर्शन करते हैं।

  1. सेरेब्रल कॉर्टिस को बारीक काटने के लिए तेज स्केलपेल का इस्तेमाल करें। कीमा बनाया हुआ ऊतक एंजाइम पाचन माध्यम युक्त 50 मिलील ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 30 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  3. एंजाइम पाचन माध्यम को धीरे से हटाने के लिए एक p1000 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें, जबकि यह सुनिश्चित करें कि कॉर्टिकल ऊतक 50 मीटर ट्यूब के तल पर रहता है।
  4. डीएमईएम-10% एफसीएस के 1 मिलील को जोड़ने और ऊतक को धीरे-धीरे त्रिकोणीय बनाने के लिए पी1000 माइक्रोपाइपेट का उपयोग करें।
  5. कॉर्टिकल ऊतक को 50 मिलील ट्यूब में फ़िल्टर करने के लिए 70 माइक्रोन फिल्टर और 1 मिलीस सिरिंज के पिस्टन का उपयोग करें।
    नोट: एक डीएमईएम-10% एफसीएस के साथ कई बार भीतरी ट्यूब दीवार पर अवशिष्ट ऊतक कुल्ला कर सकते हैं।
  6. डीएमईएम-10% एफसीएस के साथ 50 एमएएल ट्यूब भरें। आरटी में 5 मिनट के लिए 423 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। DMEM-10% FCS के 2 mL के साथ सुपरनेटेंट को सावधानी से हटा दें और सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
  7. धीरे-धीरे एक p1000 माइक्रोपाइपेट के साथ सेल पैलेट को ट्राइट्यूरेट करें और फिर एक पी 200 माइक्रोपाइपेट के साथ। डीएमईएम-10% एफसीएस की उचित मात्रा के साथ सेल निलंबन को पतला करें।
    नोट: दो दिमाग = एक T150 = DMEM के 5 mL-10% FCS ।
  8. 1 x 105 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर एक T150 पर सेल निलंबन की प्लेट 5 mL । प्रत्येक T150 में गर्म डीएमईएम-10% एफसीएस के 20 मिलील जोड़ें। 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर ।
  9. गर्म डीएमईएम-10% एफसीएस के साथ विट्रो (DIV) में 6 दिनों के बाद संस्कृति माध्यम के आधे को नवीनीकृत करें।

6. मिलाते हुए तैयारी

  1. बाँझ परिस्थितियों में एक टुकड़े टुकड़े में मिलाते हुए पहले दिन पर मिलाते हुए तैयारी प्रदर्शन करते हैं ।
  2. 5% सीओ2के तहत फ्लास्क में ताजा गर्म संस्कृति माध्यम जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़कर संस्कृति माध्यम के आधे को नवीनीकृत करें ।

7. मिलाते हुए

  1. पी के साथ कोट तीन 100 मिमी पेट्री व्यंजन। उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. फ्लैक्स कैप को पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें और फ्लास्क को प्लास्टिक बैग में डाल दें । 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम पर रात भर ग्लियल कोशिकाओं वाले फ्लास्क मिलाएं।
    नोट: पहले मिलाते हुए 8 DIV पर किया जाता है और एक तीन अलग-अलग मिलाते हुए प्रदर्शन कर सकता है (समय के लिए चित्रा 1 देखें)।

8. राजभाषा वंश कोशिकाओं की कटाई और संस्कृति

नोट: इन चरणों बाँझ परिस्थितियों में एक टुकड़े टुकड़े में किया जाना चाहिए।

  1. मिलाते हुए दिन टेबल 1के अनुसार बॉटेंस्टीन-सातो (बीएस) मीडियम तैयार करें ।
  2. बाँझ आसुत पानी के साथ 3 बार लेपित पेट्री व्यंजन कुल्ला।
  3. हार्वेस्ट फ्लास्क मुख्य रूप से राजभाषा कोशिकाओं से युक्त सुपरनेटेंट लेकिन कुछ माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को भी शामिल करता है और इसे गैर-लेपित 100 मिमी पेट्री व्यंजनों पर प्लेट करें।
    नोट: यह कदम पकवान की सतह पर अंतर तेजी से आसंजन के माध्यम से माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को हटाने की अनुमति देता है ।
  4. 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 15 मिन के लिए पेट्री व्यंजन इनक्यूबेट करें ।
  5. प्रत्येक T150 फ्लास्क को गर्म हौसले से तैयार संस्कृति माध्यम के 25 मिलील के साथ भरें और दूसरे मिलाते हुए तक 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  6. अवशिष्ट माइक्रोग्लियल कोशिकाओं के आसंजन की अनुमति देने के लिए पेट्री व्यंजनों से नए गैर-लेपित 100 मिमी पेट्री व्यंजनों में अधिनेत स्थानांतरित करें।
  7. 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 15 मिन के लिए पेट्री व्यंजन इनक्यूबेट करें ।
  8. अधिज्ञ को हटा दें, जिसमें गैर-अनुयायी ओएल वंश कोशिकाएं होती हैं, और इसे 50 मिलील ट्यूब (50 मिलील ट्यूब के लिए 2 पेट्री व्यंजनों से अधिनैंट) में स्थानांतरित करें। पेट्री व्यंजन माइक्रोग्लिया के साथ चढ़ाया त्यागें।
  9. 423 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सुपरनेटेंट को सेंट्रलाइज करना । बीएस मीडियम के 1 एमएल के साथ सुपरनेटेंट और रीसस्पेंड सेल पैलेट को सावधानी से हटा दें। एक आम 50 मीटर ट्यूब में सभी छर्रों पूल और बीएस माध्यम के साथ 10 mL करने के लिए मात्रा समायोजित करें।
  10. एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल घनत्व गिनती कोशिकाओं का निर्धारण करें।
    नोट: 3 x 105/mLऔर 5 x 105/mLके बीच एक सेल घनत्व प्राप्त किया जाना चाहिए ।
  11. यदि सेल घनत्व 30 मीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करनेके लिए 4 x 10 5/mL से अधिक या बराबर है, या 20 मिलील की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए सेल घनत्व 4 x 105/mLसे कम है तो बीएस के केवल 10 मीटर जोड़ें ।
  12. प्लेट दो या तीन पूर्व लेपित 100 मिमी पेट्री व्यंजन सेल निलंबन के 10 mL के साथ। 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर ।
  13. बाद में बीएस मीडियम 2 एच के सभी ताज़ा करके पेट्री व्यंजनों से मलबा साफ करें ।
    नोट: सेल घनत्व और मलबे हटाने की दक्षता को सत्यापित करने के लिए समाशोधन से पहले और बाद में माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति की जांच करें।
  14. बीएस मीडियम में 2 दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति की जांच करें। संगम 70 फीसद से 80 फीसद तक होना चाहिए।

9. ओसीएम उत्पादन

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में इन चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. तालिका 2के अनुसार एनबी-बी 27लो मीडियम तैयार करें ।
  2. गर्म एनबी-B27low माध्यम के 10 मिलील के साथ संस्कृति माध्यम नवीनीकृत करें । 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट ।
  3. ओसीएम की कटाई करें, यानी, ओएल स्रावित कारकों वाले अधिनेत। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज ओसीएम।
    नोट: अधिकतम 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ओसीएम स्टोर करें।

10. ओसीएम अतिरिक्त

नोट: कदम बाँझ परिस्थितियों में एक टुकड़े टुकड़े में किया जाना चाहिए। ओसीएम को निम्नलिखित प्रोटोकॉल14के अनुसार तैयार किए गए शुद्ध हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृतियों में जोड़ा जा सकता है, और अलगाव के बाद 24 घंटे, एंटी-माइटोटिक एजेंटयूडीन और 36 घंटे के लिए 5-फ्लोरोडोऑक्सीयूरिडीन (5 माइक्रोन) जोड़कर प्राप्त किए जा सकते हैं।

  1. 3 DIV में, एंटी-माइटोटिक एजेंटों वाले सभी न्यूरॉन कल्चर मीडियम को हटा दें और ताजा गर्म ओसीएम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  2. हौसले से बनाया गर्म एनबी-B27 के साथ हर 3 दिन में माध्यम के आधे नवीनीकृत करें ।
    नोट: ऐसी संस्कृतियों को 21 DIV तक बनाए रखा जा सकता है।

11. शुद्ध हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति के लिए राजभाषा के अलावा

नोट: बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह हुड में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। ओल शुद्ध हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के लिए जोड़ा जा सकता है उसी तरह प्राप्त के रूप में ऊपर वर्णित है ।

  1. तालिका 3के अनुसार सह-संस्कृति माध्यम तैयार करें ।
  2. 70% से 80% संगम पर राजभाषा संस्कृति को पुनः प्राप्त करें। गर्म 1x पीबीएस के 2 mL के साथ कुल्ला।
  3. कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 100 मिमी पेट्री डिश में 0.25% ट्रिप्सिन का 2 एमएल जोड़ें।
  4. 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  5. एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को ब्लॉक करने के लिए डीएमईएम-10% एफसीएस के 2 मिलील जोड़ें। ओएल वंश कोशिकाओं वाले अधिस्थान को काटें।
  6. आरटी में 5 मिनट के लिए 423 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 1.25 x 105 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गर्म सह-संस्कृति माध्यम में सेल पेलेट को सावधानीपूर्वक हटा दें और फिर से निलंबित करें।
  7. न्यूरॉन संस्कृति माध्यम के २०० μL को हटाने और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के २०० μL जोड़ने और प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के २०० μL जोड़ने के द्वारा हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स संस्कृति शुद्ध करने के लिए ओएल जोड़ें ।
  8. हर 2-3 दिन में सह-संस्कृति माध्यम का आधा ताज़ा करें।
    नोट: सह संस्कृतियों को 24 DIV तक बनाए रखा जा सकता है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में ओएल वंश कोशिकाओं को एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को मिलाकर ग्लियाल संस्कृतियों से शुद्ध किया जाता है। ओएल संस्कृतियों की शुद्धता और फेनोटाइपिक परीक्षा का आकलन ग्लियल मार्कर15के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया जा सकता है । विभिन्न मार्कर की अभिव्यक्ति के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि ओएल संस्कृतियां ज्यादातर 90% ± 4% O4+ कोशिकाओं, 85% ± 7% NG2+ कोशिकाओं, और पीएलपी+ कोशिकाओं के 4.7% ± 2.1% के साथ पूर्व-ओएल थीं, जबकि 7.2% ± 2.5% कोशिकाएं GFAP+ एस्ट्रोसाइट्स (मतलब ± एस.डी., एन = 3; चित्रा 2)। इसके अलावा, 4.6% ± 0.7% कोशिकाएं CD11b+ माइक्रोग्लिल कोशिकाएं (मतलब ± एसडी, नहीं दिखाई गई)।

ऐसी संस्कृतियों से उत्पादित ओसीएम को हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों को शुद्ध करने के लिए 3 DIV में जोड़ा जा सकता है। यह उपचार नोडल प्रोटीन के क्लस्टरिंग को बढ़ावा देता है, जिसमें न्यूरोफास्किन 186 से जुड़े नावी चैनल और एंकिरिन जी शामिल हैं, जो माइनेशन से पहले हिप्पोकैम्पल गैबार्गिक न्यूरॉन्स के एक्सोन के साथ, 17 DIV(चित्रा 3ए, बी)में शामिल हैं। नोट के, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग से पता चला है कि इन समूहों कार्रवाई क्षमता14की वृद्धि हुई चालन के साथ जुड़े रहे हैं । इसके अलावा, Smi31 द्वारा दाग फॉस्फोरेटेड मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन एच की अभिव्यक्ति ओसीएम-इलाज हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स(चित्रा 3ए)में बढ़ जाती है। इसलिए ओलिगोडेन्ड्रोगलियाल स्रावित कारकों को न्यूरोनल परिपक्वता और शरीर विज्ञान में फंसाया जाता है।

हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के Myelination 14 DIV में राजभाषा के अलावा के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है । 20 DIV से 24 DIV तक, मायलिन मार्कर का इम्यूनोस्टेनिंग, जैसे मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) मायलिन सेगमेंट(चित्रा 4)के दृश्य की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: ओएल वंश कोशिकाओं अलगाव और OCM उत्पादन की प्रोटोकॉल समयरेखा। P2 Wistar चूहों (चरण 4) से सेरेब्रल कॉर्टिस को विच्छेदन करने के बाद, संस्कृति ग्लियल कोशिकाओं (चरण 5) के लिए ऊतक विसोजन करते हैं। 8, 12 और 15 DIV (यानी, मिलाते समय से पहले), गर्म DMEM-10% FCS (चरण 6) के साथ आधा माध्यम नवीनीकृत । अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस (चरण 7.2) पर 250 आरपीएम पर रात भर ग्लियल संस्कृतियों को हिलाएं। हार्वेस्ट सुपरनेटेंट जिसमें ओएल वंश कोशिकाएं और कुछ माइक्रोग्लिया कोशिकाएं होती हैं और इसे 5% सीओ2 (चरण 8.3 से 8.7) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में 15 मिनके लिए प्लेट करें। 423 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सुपरनेटेंट को सेंट्रलाइज करें, बी एस के साथ सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और 5% सीओ2 (चरण 8.8 से 8.12) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। ओसीएम का उत्पादन करने के लिए, एनबी-B27low (चरण 9) में 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट। सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए ओएलएस को अलग करने के लिए, ट्राइप्सिन (चरण 11.3) का उपयोग करके अलग सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: संस्कृतियों में राजभाषा वंश कोशिकाएं फेनोटाइप। छवियों को एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे । अधिकतम तीव्रता अनुमान प्रस्तुत किए जाते हैं। (क)राजभाषा संस्कृतियों में ज्यादातर पूर्व-ओएल (यानी, केवल NG2 (लाल), या दोनों O4 (हरे) और NG2 (लाल) को व्यक्त करते हुए होते हैं; दोनों मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाएं पीले सितारों के साथ संकेत ित की जाती हैं), लेकिन कुछ अपरिपक्व ओल (यानी, केवल O4 और नहीं NG2; सफेद सितारों को व्यक्त करना)। (ख)कुछ परिपक्व ओल (यानी पीएलपी+; हरित) और कुछ एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी+ कोशिकाएं; लाल) राजभाषा वंश कोशिका संस्कृतियों में पाए जाते हैं । स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि आवेदन। (ए, बी) हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स 3 DIV में ओसीएम के साथ इलाज किया और 17 DIV एक्सप्रेस फॉस्फोरेटेड मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन एच (Smi31; ग्रीन; पैनल ए) पर तय किया गया । गैबार्गिक न्यूरॉन्स, 67 केडीए (GAD67) अभिव्यक्ति (सफेद) के ग्लूटामेट डिकार्बोसिले ससोफॉर्म द्वारा पहचाने जाते हैं, एक्सन प्रारंभिक खंड में एंकिरिन जी और नावी सोडियम चैनलों (लाल; पैनल ए और बी, क्रमशः) का प्रदर्शन संचय और उनके एक्सॉन (पैनल ए और बी, क्रमशः पैनल ए और बी) के साथ Ankyrin जी और नावी समूहों के रूप में। स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि आवेदन। राजभाषा वंश कोशिकाओं को 14 DIV में हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृति में जोड़ा कुछ हिप्पोकैम्पल अक्षत, यहां 23 DIV (एक myelin मार्कर के रूप में एमबीपी; हरे रंग) में तय की । रानिएर (नावी;लाल) के नोड्स मायलिन सेगमेंट के बीच में देखे जाते हैं । स्केल बार = 25 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बॉटनस्टीन-सातो (बीएस) मीडिया अंतिम एकाग्रता
दुल्बेकको का संशोधित ईगल मीडियम
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 आईयू/एमएल
मानव में एपीओ-ट्रांसफर 100 μg/mL
बीएसए (गोजातीय सीरम एल्बुमिन) 100 μg/mL
इंसुलिन 5 μg/mL
पीडीजीएफ 10 एनजी/एमएल
प्रोजेस्टेरोन 62 एनजी/एमएल
पुत्रस्सिन डाइहाइड्रोक्लोराइड 16 μg/mL
सोडियम सेलेनिट 40 एनजी/एमएल
T3 (3,3', 5-ट्रिओडो-एल-थाइरोनिन सोडियम नमक) 30 एनजी/एमएल
T4 (एल-थायरॉक्सिन) 40 एनजी/एमएल

तालिका 1: बॉटनस्टीन-सातो (बीएस) मीडिया की तैयारी।

एनबी-बी 27 कम मीडिया अंतिम एकाग्रता
न्यूरोबेसल
B27 पूरक 0.5x
एल-ग्लूटामाइन 0.5 एमएम
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 आईयू/एमएल
एनबी-बी 27 मीडिया अंतिम एकाग्रता
न्यूरोबेसल
B27 पूरक 1x
एल-ग्लूटामाइन 0.5 एमएम
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 आईयू/एमएल

तालिका 2: एनबी-B27low और NB-B27 मीडिया की तैयारी।

सह संस्कृति मीडिया अंतिम एकाग्रता
दुल्बेकको का संशोधित ईगल मीडियम 1 वोल
न्यूरोबेसल 1 वोल
B27 पूरक 1x
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 आईयू/एमएल
मानव में एपीओ-ट्रांसफर 50 μg/mL
बायोटिन 10 एनजी/एमएल
बीएसए (गोजातीय सीरम एल्बुमिन) 50 μg/mL
सेरुलोप्लास्मिन 100 एनजी/एमएल
हाइड्रोकॉर्टिसोन 0.05 माइक्रोन
इंसुलिन 5 μg/mL
एन-एसिटाइल-एल-साइस्टीन 5 μg/mL
प्रोजेस्टेरोन 6.2 एनजी/एमएल
पुत्रस्विनी 16 μg/mL
रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन सीएनटीएफ 0.1 एनजी/एमएल
सोडियम सेलेनिट 5 एनजी/एमएल
T3 (3,3', 5-ट्रिओडो-एल-थाइरोनिन सोडियम नमक) 40 एनजी/एमएल
विटामिन बी12 27.2 एनजी/एमएल

तालिका 3: सह संस्कृति मीडिया की तैयारी।

अनुपूरक फाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यहां, हम मिश्रित ग्लियल संस्कृतियों से अत्यधिक समृद्ध ओलिगोडेड्रोग्लिसियल वंश कोशिका संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो पहले प्रकाशित विधि16से अनुकूलित है, और बाद में ओएल-वातानुकूलित माध्यम का उत्पादन है। यह मिलाते हुए तकनीक महंगी नहीं है, तीन बार दोहराया जा सकता है और शुद्ध ओलकी की उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए इष्टतम है, क्योंकि बॉटनस्टीन-सातो (बीएस) माध्यम में सुसंस्कृत कोशिकाएं PDGFα पैदा होती हैं। ग्लियल कोशिकाओं को पी 2 में विस्टार चूहों के सेरेब्रल कॉर्टिस का उपयोग करके तैयार किया जाता है, एक समय बिंदु जिस पर ओलिगोडेड्रोग्लिल वंश कोशिकाओं का एक विशाल बहुमत पूर्व-ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स को NG2 और O415व्यक्त करते हैं। नोट की, राजभाषा वंश परिपक्वता माउस और चूहे में P2 में समान है, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग माउस पूर्व-ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स17को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है।

मिश्रित ग्लियल सेल संस्कृतियों को मिलाने के बाद, अलग कोशिकाओं में मुख्य रूप से ओलिगोडेंड्रोग्लिअल वंश कोशिकाएं होती हैं, लेकिन कुछ माइक्रोग्लियल कोशिकाएं और कुछ एस्ट्रोसाइट्स भी होते हैं। माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को अनकोटेड पेट्री व्यंजनों पर अंतर आसंजन के माध्यम से हटा दिया जाता है। नोट के, एक अतिरिक्त आसंजन कदम प्रदर्शन करके हटाने की दक्षता में सुधार किया जा सकता है। हालांकि, माइक्रोग्लियल कोशिकाओं के बारे में 5% अभी भी समृद्ध ओलिगोडेंड्रोग्लिल सेल संस्कृतियों में पाए जाते हैं, साथ ही 5% से 9% एस्ट्रोसाइट्स। O4 एंटीबॉडी-लेपित पेट्री व्यंजनों का उपयोग करके एक अतिरिक्त इम्यूनो-पैनिंग कदम प्रदर्शन करके एस्ट्रोसाइट्स से संदूषण को 5% से कम करना संभव है; एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए Freeman एट अल14में पूरक जानकारी देखें । ओलिगोडेरोगेलियाल कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद मलबे 2 एच को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है, जो पाइप्ट के साथ लागू प्रवाह की ताकत पर निर्भर करता है। इस कदम पर, दक्षता को सत्यापित करने के लिए समाशोधन से पहले और बाद में माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति की जांच करना महत्वपूर्ण है क्योंकि बहुत अधिक मलबे की उपस्थिति सेल व्यवहार्यता और विकास को ख़राब कर सकती है। ध्यान दें, यह भी हौसले से बनाया बीएस माध्यम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, अन्यथा यह oligodendrocytes अस्तित्व को बदल सकता है। इसके अलावा, शुद्ध कोशिकाएं चढ़ाना के 6 दिनों तक ही जीवित रहती हैं। दरअसल, यह ज्ञात है कि अन्य ग्लियल कोशिकाएं और न्यूरॉन्स गुप्त कारकों या प्रत्यक्षसंपर्कों 2,18के माध्यम से ओटीसी अस्तित्व और प्रसार या भेदभाव को बढ़ावा देते हैं।

अन्य तरीके मस्तिष्क विजन के तुरंत बाद ओएलएस अलगाव की अनुमति देते हैं, ओ4 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोलेबलिंग का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री (एफएसीएस) या चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई (एमएसीएस) द्वारा फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटाई करते हैं। इसके अलावा, जीएफपी-पॉजिटिव ओपीसी या जीएफपी-पॉजिटिव ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स को क्रमशः19,20, पीडीजीएफ्क्यूर: जीएफपी या पीएलपी चूहों से फ्लोरोसेंट-एक्टिवेटेड सेल छंटाई द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। ये छंटाई विधियां विकास कारकों के साथ इलाज की संस्कृतियों की तुलना में ओलिगोडेनरोसाइट्स की शारीरिक स्थिति का अध्ययन करने के लिए अधिक प्रासंगिक हैं जो उनके फेनोटाइप को बदल सकती हैं। विशेष रूप से, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटाई का उपयोग सामान्य शारीरिक स्थिति और डिमिएलिनेटिंग स्थितियों21में जीन-प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों के लिए किया गया है। सेल अस्तित्व के रूप में सेल छंटाई से बदला जा सकता है, यह छंटाई के तुरंत बाद कार्यात्मक परख प्रदर्शन करने के लिए बेहतर है ।

हमने दिखाया है कि ओएल संस्कृतियों को अलग किया जा सकता है और 14 DIV में शुद्ध हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृतियों में जोड़ा जा सकता है। इस तरह के राजभाषा-न्यूरॉन सह-संस्कृति myelination के प्रारंभिक चरणों के अध्ययन की अनुमति देता है जो सह-संस्कृति (दुबेसी, अप्रकाशित परिणाम) के पहले सप्ताह के दौरान शुरू होता है। ओएल-हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन मायलिनिंग सह-संस्कृति के अन्य मॉडलों को22,23छंटाई के तुरंत बाद ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स जोड़कर हासिल किया गया है । इसके अलावा, हमने ओसीएम का उत्पादन ओएल-न्यूरॉन इंटरैक्शन को और विच्छेदन करने और न्यूरॉन संस्कृतियों पर ओएल-स्रावित कारकों की भूमिका को संबोधित करने के लिए किया। इस तकनीक का उपयोग करके, हमने दिखादिया कि हिप्पोकैम्पल गैबार्गिक न्यूरॉन उपप्रकार (यानी, परवएलबमिन+ और/या सोमाटोस्टैटिन+)अपने एक्सॉन के साथ नोडल प्रोटीन के समूह बना सकते हैं जो माईनेशन14,24से पहले ओसीएम द्वारा प्रेरित होते हैं। ओसीएम के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण ने कई स्रावित प्रोटीन ों को सुलझाया है और ओलिगोडेंड्रोग्लियाल कॉन्टैक्टिन-1 की पहचान की है जो अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ तालमेल में नोडल क्लस्टरिंग24के शुरुआती चरणों में मध्यस्थता करता है। प्राथमिक संस्कृतियां उपयोगी मॉडल हैं जो ओलिगोडेंड्रोग्लियाल वंश कोशिका विभेदन और न्यूरॉन्स के साथ बातचीत के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। हालांकि, पूर्व वीवो सेरिबैलर ऑर्गानोसाइटिक स्लाइस संस्कृतियों25,26से ओएल कार्यों और myelination, demyelination और remyelination का मूल्यांकन करने के लिए अन्य दृष्टिकोण भी विकसित किए गए हैं, और वीवो अध्ययनों में, विशेष रूप से जेब्राफिश और टैडपोल मॉडल27 के साथ जो पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के अंतिम चरणों में आवश्यक हैं।

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Disclosures

लेखकों में से कोई भी प्रतिस्पर्धी हितों या परस्पर विरोधी हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि संपादन में अपनी बुद्धिमान सलाह के लिए रेमी रोन्ज़ानो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को आईसीएम, INSERM, एनएसएफ को ARSEP फाउंडेशन ग्रांट और बोवेट-लाब्रुयेरे मूल्य द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorodeoxyuridine Sigma F0503
B27 supplement ThermoFisher 17504044
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Ethanol 100% Sigma 32221-M
Ethanol 70% VWR Chemicals 83801.360
Fetal Calf Serum ThermoFisher 10082147
L-cysteine Sigma C7352
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium ThermoFisher A1285601
Polyethylenimine(PEI) Sigma P3143
Tetraborate decahydrate Sigma B9876
Trypsin Sigma Sigma
Uridine Sigma U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human Sigma T1147
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Insulin Sigma I5500
PDGF Peprotech AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
T4 (L-Thyroxine) Sigma T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human Sigma T1147
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Biotin Sigma B4639
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Ceruloplasmin Sigma 239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Sigma I5500
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A8199
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescin Sigma P5780
Recombinant Human CNTF Sigma 450-13
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
Vitamin B12 Sigma V6629
Tools
0.22 µm filter Sartorius 514-7010
1 mL syringe Terumo 1611127
100 mm Petri dish Dutscher 193100
15 mL tube Corning Life Science 734-1867
50 mL tube Corning Life Science 734-1869
60 mm Petri dish Dutscher 067003
70 µm filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Binocular microscope Olympus SZX7
Curved forceps Fine Science Tools 11152-10
Fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Large surgical scissors Fine Science Tools 14008-14
Scalpel Swann-morton 233-5528
Shaker Infors HT
Small surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Small surgical spoon Bar Naor Ltd BN2706
T150 cm2 flask with filter cap Dutscher 190151
Animal
P2 Wistar rat Janvier RjHAn:WI

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References

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Mazuir, E., Dubessy, A. L., Wallon, L., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments. J. Vis. Exp. (156), e60912, doi:10.3791/60912 (2020).

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