Summary

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

Published: February 09, 2020
doi:

Summary

هنا ، نعرض طريقة فعالة لتنقية oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة التي يمكن استخدامها لتجارب الثقافة المشتركة.

Abstract

في الجهاز العصبي المركزي ، تشتهر oligodendrocytes بدورها في الميالات المحورية ، التي تسرع من انتشار إمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي. وعلاوة على ذلك، يشير عدد متزايد من التقارير إلى أن oligodendrocytes تتفاعل مع الخلايا العصبية وراء الميالين، لا سيما من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا يسمح بتنقية خلايا النسب oligodendroglial من ثقافات الخلايا الدبقية التي تحتوي أيضًا على الخلايا الفلكية والخلايا المجهرية. تعتمد الطريقة على الاهتزاز بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ، مما يسمح بانفصال انتقائي للخلايا الأولية المنفّذة والخلايا المجهرية ، والقضاء على microglia عن طريق الالتصاق التفاضلي. ثم نصف ثقافة oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة (OCM). ونحن نقدم أيضا حركية العلاج OCM أو oligodendrocytes بالإضافة إلى الخلايا العصبية قرنية النهر المنقى في تجارب الثقافة المشتركة, دراسة التفاعلات oligodendrocyte الخلايا العصبية.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) هي الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تولد التفاف المالين حول محاور عصبية. تنشأ OLs من الخلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs) التي تتكاثر داخل المناطق البطينية من الجهاز العصبي المركزي الجنيني ثم تهاجر وتفرق إلى OLs ناضجة تماما (أي، الخلايا تشكيل المالين)1. OPCs وفيرة خلال التنمية المبكرة، ولكن أيضا تستمر في الدماغ الكبار حيث أنها تمثل عدد الخلايا التكاثرية الرئيسية2. واحد OL ensheathes محاور متعددة في أقسام غير منفعل (أي، internodes)، وحافة كل حلقة المالين تعلق على محور عصبي تشكيل المجال البارانودال الذي أمر بالغ الأهمية للخصائص العازلة من المائلين1،3. بين paranodes هي فجوات صغيرة unmyelinated تسمى العقد من رانفييه. هذه العقد غنية بقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد (Nav) ، مما يسمح بتجديد والانتشار السريع لإمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي4. هذا التفاعل ضيق يتيح أيضا دعم الطاقة المحورية من خلال التمازى العصبية من اللاكتات من OLs5،6.

يتم تنظيم نضوج خلايا النسب oligodendroglial وعملية الميالين بإحكام من خلال تفاعلاتها مع الخلايا العصبية7. في الواقع، OLs وOPCs، واسمه أيضا خلايا NG2، والتعبير عن مجموعة من المستقبلات للناقلات العصبية، ويمكن أن تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية مثير ومثبطة، مما يسمح لهم باستشعار النشاط العصبي الذي يمكن أن يؤدي انتشارها و / أو التمايز في الخلايا المائلة2. بدوره، OPCs / OLs تفرز microvesicles والبروتينات في الفضاء خارج الخلية التي وحدها أو التوسط بشكل تآزري وظائف التشكيل العصبي واعصاب8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في طرق متعددة من التفاعلات بين خلايا النسب oligodendroglial والخلايا العصبية لم يتم فك شفرتها بالكامل.

وعلاوة على ذلك، في العديد من الحالات المرضية CNS، تتأثر OLs في المقام الأول، وبالتالي تعكير تفاعلها مع الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في التصلب المتعدد (MS) ، يحدث الخلل العصبي عن طريق إزالة الميالة البؤرية في الجهاز العصبي المركزي ، وهو ثانوي لفقدان OLs الذي يمكن أن يؤدي إلى تلف عصبي وتراكم الإعاقة ذات الصلة. يمكن أن يحدث Remyelination ، وإن كان غير كاف في معظم الحالات13. وقد أدى التقدم المحرز في العقد الماضي، بسبب تطور العلاجات المناعية، إلى خفض معدل الانتكاس، ولكن تعزيز إعادة التمالع لا يزال حتى الآن حاجة غير ملباة. على هذا النحو ، فإن فهم أفضل لدور OLs ووظائفه وتأثيراته له أهمية خاصة لتطوير علاجات جديدة لمجموعة واسعة من ظروف الجهاز العصبي المركزي.

هنا ، ونحن نصف أساليب تنقية OLs والثقافة. وهذا يتيح إجراء دراسة دقيقة للآليات الجوهرية التي تنظم تطورها وبيولوجيتها. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الثقافات OLs عالية التخصيب بإنتاج وسيط أوليغودندروسيتي مكيف (OCM)، والتي يمكن إضافتها إلى ثقافات الخلايا العصبية النقية للحصول على نظرة ثاقبة لتأثير العوامل التي تفرزها OLs على فسيولوجيا الخلايا العصبية والاتصال. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية تنفيذ نظام الثقافة المشتركة في المختبر حيث يتم الجمع بين oligodendrocytes تنقية والخلايا العصبية معا، مما يسمح لمعالجة الآليات التي تنظم (إعادة) myelination.

Protocol

وتتوافق رعاية الفئران واستخدامها في هذه التجربة مع السياسات والمبادئ التوجيهية المؤسسية (UPMC وINSERM وتوجيهات مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC). تم إنشاء البروتوكول التالي لالقمامة القياسية من 12 الجراء. 1. إعداد القوارير (~ 5 دقيقة) ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في الي…

Representative Results

في هذا البروتوكول ، يتم تنقية خلايا النسب OL من الثقافات الدبقية عن طريق التخلص من الخلايا الفلكية وmicroglia. يمكن تقييم النقاء والفحص الفينوتيبيك لثقافات OL عن طريق تلطيخ المناعة مع علامات الدبقية15. وأشار تحليل التعبير عن علامات مختلفة إلى أن ثقافات OL كانت في ال?…

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للحصول على ثقافات خلية النسب oligodendroglial عالية التخصيب من الثقافات الدبقية المختلطة ، المقتبسة من طريقة نشرت سابقًا16، والإنتاج اللاحق للوسط المكيف OL. هذه التقنية اهتزاز ليست مكلفة، ويمكن أن تتكرر ثلاث مرات، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من OLs الم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا ريمي رونزانو على نصيحته الحكيمة في تحرير المخطوطات. تم تمويل هذا العمل من قبل ICM ، INSERM ، منحة مؤسسة ARSEP إلى NSF ، وسعر Bouvet-Labruyère.

Materials

5-fluorodeoxyuridine Sigma F0503
B27 supplement ThermoFisher 17504044
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Ethanol 100% Sigma 32221-M
Ethanol 70% VWR Chemicals 83801.360
Fetal Calf Serum ThermoFisher 10082147
L-cysteine Sigma C7352
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium ThermoFisher A1285601
Polyethylenimine(PEI) Sigma P3143
Tetraborate decahydrate Sigma B9876
Trypsin Sigma Sigma
Uridine Sigma U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human Sigma T1147
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Insulin Sigma I5500
PDGF Peprotech AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
T4 (L-Thyroxine) Sigma T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human Sigma T1147
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Biotin Sigma B4639
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Ceruloplasmin Sigma 239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Sigma I5500
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A8199
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescin Sigma P5780
Recombinant Human CNTF Sigma 450-13
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
Vitamin B12 Sigma V6629
Tools
0.22 µm filter Sartorius 514-7010
1 mL syringe Terumo 1611127
100 mm Petri dish Dutscher 193100
15 mL tube Corning Life Science 734-1867
50 mL tube Corning Life Science 734-1869
60 mm Petri dish Dutscher 067003
70 µm filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Binocular microscope Olympus SZX7
Curved forceps Fine Science Tools 11152-10
Fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Large surgical scissors Fine Science Tools 14008-14
Scalpel Swann-morton 233-5528
Shaker Infors HT
Small surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Small surgical spoon Bar Naor Ltd BN2706
T150 cm2 flask with filter cap Dutscher 190151
Animal
P2 Wistar rat Janvier RjHAn:WI

References

  1. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
  2. Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
  3. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  4. Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
  5. Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
  6. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
  7. Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  8. Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
  9. Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
  10. Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
  11. Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
  12. Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
  13. Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
  14. Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
  15. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
  16. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  17. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  19. Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
  20. Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
  21. Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
  22. Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
  23. Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
  24. Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
  25. Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
  26. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  27. Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).

Play Video

Cite This Article
Mazuir, E., Dubessy, A., Wallon, L., Aigrot, M., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments. J. Vis. Exp. (156), e60912, doi:10.3791/60912 (2020).

View Video