Summary
Heri viser vi en effektiv metode til rensning af oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-konditioneret medium, der kan bruges til co-kultur eksperimenter.
Abstract
I centralnervesystemet er oligodendrocytes kendt for deres rolle i axon myelination, der fremskynder udbredelsen af handlingspotentialer gennem saltatoring. Desuden tyder et stigende antal rapporter på, at oligodendrocytes interagerer med neuroner ud over myelination, især gennem udskillelsen af opløselige faktorer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der gør det muligt at rense oligodendroglial afstamningsceller fra gliacellekulturer, der også indeholder astrocytter og mikroglielle celler. Metoden er afhængig af natten ryster ved 37 °C, som giver mulighed for selektiv løsrivelse af de overliggende oligodendroglile celler og mikroglielle celler, og fjernelse af mikroglia ved differential vedhæftning. Vi beskriver derefter kulturen i oligodendrocytes og produktion af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). Vi leverer også kinetik ocm behandling eller oligodendrocytes ud til renset hippocampal neuroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaktioner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) er glielle celler i centralnervesystemet (CNS), der genererer myelin indpakning omkring axoner. OLs stammer fra oligodendrocyte prækursorceller (OPC'er), som formerer sig inden for de ventrikulære zoner i embryonale CNS og derefter migrerer og differentieres til fuldt modne OP'er (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rigelige i den tidlige udvikling, men også fortsætter i den voksne hjerne, hvor de repræsenterer de store proliferative celle population2. En enkelt OL beskærer flere axoner i ikke-excitable sektioner (dvs. internoder), og kanten af hver myelin loop tillægger axon danner paranodal domæne, som er afgørende for isolerende egenskaber myelin1,3. I mellem paranoder er små umyelinerede huller kaldet noder ranvier. Disse noder er rige på spændingsgated natriumkanaler (Nav), der gør det muligt at regenerering og hurtig udbredelse af handlingspotentialer gennem saltatoring4. Denne tætte interaktion muliggør også axonal energistøtte gennem neuronal optagelse af laktat fra OLs5,6.
Modning af oligodendroglial afstamning celler og myelination proces er stramt reguleret af deres interaktioner med neuroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kaldet NG2 celler, udtrykke en række receptorer for neurotransmittere, og kan modtage input fra excitatoriske og hæmmende neuroner, giver dem mulighed for at fornemme neuronal aktivitet, der kan udløse deres spredning og / eller differentiering i myelinating celler2. Til gengæld udskiller OPCs/OLs mikrovesikler og proteiner ind i det ekstracellulære rum, som alene eller synergistisk mediat mægle neuromodulative og neuroprotektive funktioner8,9,10,11,12. Men de molekylære mekanismer, der styrer de mange former for interaktioner mellem oligodendroglial afstamning celler og neuroner er endnu ikke fuldt dechifreret.
Desuden, i flere CNS patologiske tilstande, ER OLs primært påvirket, hvilket forstyrrer deres interaktion med neuroner. For eksempel, i multipel sklerose (MS), neurologisk dysfunktion er forårsaget af fokal demyelinering i CNS, sekundært til OLs tab, der kan føre til axonale skader og relaterede handicap ophobning. Remyelination kan finde sted, om end utilstrækkeligt i de fleste tilfælde13. Fremskridt i det sidste årti har på grund af udviklingen af immunterapier reduceret tilbagefaldsraten, men at fremme remyelinnation er fortsat et udækket behov. Som sådan er en bedre forståelse af OP'ers rolle, funktioner og indflydelse af særlig interesse for udviklingen af nye behandlingsformer for et bredt spektrum af CNS-betingelser.
Her beskriver vi metoderne til OP'er rensning og kultur. Dette muliggør en præcis undersøgelse af iboende mekanismer, der regulerer deres udvikling og biologi. Desuden tillader sådanne højt berigede OLs-kulturer produktionen af oligodendrocyte-conditioned medium (OCM), som kan føjes til rensede neuronkulturer for at få indsigt i virkningen af OLs-udskillede faktorer på neuronal fysiologi og konnektivitet. Desuden beskriver vi, hvordan man implementerer et in vitro-co-kultursystem, hvor renset oligodendrocytes og neuroner kombineres sammen, så de kan håndtere de mekanismer, der regulerer (re)myelination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje og anvendelse af rotter i dette eksperiment er i overensstemmelse med institutionelle politikker og retningslinjer (UPMC, INSERM og Det Europæiske Fællesskabs direktiv 86/609/EØF). Følgende protokol er fastsat for et standardkuld på 12 unger.
1. Fremstilling af kolberne (~5 min.)
BEMÆRK: Udfør følgende trin dagen før dissektion i en laminarflowhætte under sterile forhold.
- Knop 150 cm2 kolber (T150) med filterhætte (1 kolbe til 2 unger) med 5 ml polyethylenimin (PEI, 100 mg/L, se protokol i supplerende fil 1).
- Kolberne opbevares ved 4 °C natten over.
- Skyl overtrukket kolber 3 gange med sterilt destilleret vand på dissektionsdagen.
2. Forberedelse af medier (~10 min.)
BEMÆRK: Udfør trinene i en laminarflowhætte under sterile forhold.
- Forbered 500 ml kulturmedium, bestående af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% af føtale kalveserum (FCS) og penicillin-streptomycin (100 IE/ml).
- Der fremstilles 20,6 ml af enzymnedbrydningsmediet i et 50 ml rør bestående af 20 ml DMEM, 200 μL DNase (50 μg/ml), 200 μL papain (30 U/ml) og 200 μL L-cystein (0,24 mg/ml).
- Filtersteriliser mediet ved hjælp af et filter på 0,22 μm.
- Opbevar mediet i laminarflowhætten ved stuetemperatur (RT) indtil dissektion.
3. Forberedelse til dissektion (~10 min.)
BEMÆRK: Udfør trinene i en laminarflowhætte under sterile forhold.
- Forbered 100 ml fosfat-buffered saltvand uden calcium og magnesium (PBS; 1x). Filtersteriliser ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Der fremstilles 50 ml iskold 1x PBS-opløsning suppleret med 750 μL 45% glukose. Filtersteriliser ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Fyld en 100 mm petriskål med 1x PBS til rengøringsinstrumenter og tre 60 mm petriskåle med iskold PBS-glukose til vævshøst. Sæt petriskåle på is indtil dissektion.
4. Dissektion
BEMÆRK: Dissektion udføres fra mandlige og kvindelige Wistar rotteunger på postnatal dag (P) 2.
- For at give et sterilt miljø skal du sørge for at rengøre bænken med 100% ethanol. Steriliser alle kirurgiske værktøjer med 100% ethanol.
- Sprøjt forsigtigt hvalpens hals med 70% ethanol.
- Brug store kirurgiske saks til at halshugge dyret og placere hovedet i en 100 mm petriskål, der indeholder iskold PBS-glukose.
- Brug buede pincet til at opretholde dyrets hoved i øjenhøjde. Brug små kirurgiske saks til at gøre et lille snit i bunden af kraniet og skære kraniet efter hjernen midterlinjen.
- Brug pincet til forsigtigt at skrælle de to dele af kraniet fra midterlinjen.
- Brug en lille kirurgisk ske til at fjerne hjernen fra hovedhulrummet. Sæt hjernen i en 60 mm petriskål, der indeholder iskold PBS-glukose på is.
- Visning under et steromikroskop, bruge fine pincet til at fjerne lillehjernen, hjernestammen og olfaktoriske pærer fra hjernehalvdele.
- Brug fine pincet til at adskille de to hjernehalvdele. Brug fine pincet til at skrælle meninges. Sæt cerebral cortices i en 60 mm-petriskål på is.
BEMÆRK: Iskold PBS er afgørende for korrekt fjernelse af meninges.
5. Vævsdissociation
BEMÆRK: Udfør trinene i en laminarflowhætte under sterile forhold.
- Brug en skarp skalpel til fint at hugge cerebralcortices. Overfør hakket væv til et 50 ml rør, der indeholder enzymfordøjelsesmedium.
- Inkubere i 30 min i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
- Brug en p1000 mikropipette til forsigtigt at fjerne enzymfordøjelsesmediet, samtidig med at du sørger for, at det kortikale væv forbliver i bunden af 50 ml-røret.
- Brug en p1000 mikropipette til at tilføje 1 ml DMEM-10% FCS og forsigtigt triturate vævet.
- Brug et filter på 70 μm og et stempel på en 1 ml sprøjte til at filtrere det kortikale væv i et 50 ml rør.
BEMÆRK: Man kan skylle restvæv på inderrøret væggen flere gange med DMEM-10% FCS. - Fyld 50 ml-røret med DMEM-10%FCS. Centrifuge på 423 x g i 5 min på RT. Fjern forsigtigt supernatant og resuspendercellepellet med 2 ml DMEM-10%FCS.
- Forsigtigt triturate celle pellet med en p1000 mikropipette og derefter med en p200 mikropipette. Celleaffjedringen udvandes med den passende mængde DMEM-10%FCS.
BEMÆRK: To hjerner = en T150 = 5 ml DMEM-10%FCS. - Plade 5 ml af celleaffjedringen på en T150 ved en tæthed på 1 x 105 celler/cm2. Tilføj 20 ml varm DMEM-10%FCS til hver T150. Inkuberi et befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2.
- Forny halvdelen af kulturmediet efter 6 dage in vitro (DIV) med varm DMEM-10%FCS.
6. Rystende forberedelse
- Udfør rystende forberedelse dagen før omrystning i en laminar flow hætte under sterile forhold.
- Forny halvdelen af kulturmediet ved at tilsætte frisk varm kulturmedium i kolben og inkubere ved 37 °C under 5 % CO2.
7. Rysten
- Coat tre 100 mm petriskåle med PEI. Opbevar dem ved 4 °C natten over.
- Dæk kolberhætten med paraffinfilm og læg kolberne i en plastikpose. Kolber, der indeholder gliaceller natten over ved 250 omdr./min. ved 37 °C.
BEMÆRK: Første rystelser udføres ved 8 DIV, og man kan udføre op til tre forskellige rystelser (se figur 1 for timing).
8. OL afstamning celler høst og kultur
BEMÆRK: Disse trin skal udføres i en laminar flow hætte under sterile forhold.
- Dagen efter rystelser forberedes Bottenstein-Sato -mediet (BS) i henhold til tabel 1.
- Skyl belagtpetriskåle 3 gange med sterilt destilleret vand.
- Høst kolber 'supernatant indeholder hovedsagelig OL afstamning celler, men også nogle mikroglial celler og plade det på ikke-belagte 100 mm Petri retter.
BEMÆRK: Dette trin gør det muligt at fjerne mikroglielle celler gennem differentialhurtig vedhæftning på skålens overflade. - Inkuber petriskålene i 15 minutter i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
- Fyld hver T150 kolbe med 25 ml varm frisklavet kulturmedium og inkuber i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2 indtil den anden rystelse.
- Overfør supernatanten fra petriskålene til nye ikke-belagte 100 mm petriskåle for at tillade vedhæftning af resterende mikroglielle celler.
- Inkuber petriskålene i 15 minutter i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
- Fjern supernatantet, som indeholder ikke-klæbende OL afstamningsceller, og overfør det til 50 ml rør (supernatant fra 2 petriskåle til et 50 ml rør). Kassér petriskåle belagt med mikroglia.
- Centrifuger supernatantet i 5 min ved 423 x g. Fjern omhyggeligt supernatant og resuspendercellepellet med 1 ml BS-medium. Pool alle pellets i et fælles 50 ml rør og juster volumen til 10 ml med BS medium.
- Bestem celletæthedstælleceller under et mikroskop.
BEMÆRK: Der skal opnås en celletæthed på mellem 3 x 105/ml og 5 x 105/ml. - Tilføj 20 ml BS, hvis celletætheden er højere end eller lig med 4 x 105/ml for at opnå en endelig volumen på 30 ml, eller tilsæt kun 10 ml BS, hvis celletætheden er mindre end 4 x 105/ml for at opnå et endeligt volumen på 20 ml.
- Plade to eller tre forbelagte 100 mm petriskåle med 10 ml celleaffjedring. Inkuberi et befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2.
- Ryd snavs fra Petri retterne ved at forfriske alle BS medium 2 h senere.
BEMÆRK: Undersøg kulturen under mikroskopet før og efter clearing for at kontrollere celletæthedog effektiviteten af fjernelse af snavs. - Inkubere i 2 dage i BS-medium i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
BEMÆRK: Undersøg kulturen under mikroskopet. Sammenløbet bør være 70% til 80%.
9. PRODUKTION AF OCM
BEMÆRK: Udfør disse trin i en laminar flow hætte under sterile forhold.
- Klargør NB-B27low medium i henhold til tabel 2.
- Forny kulturmedium med 10 ml varmt NB-B27low-medium. Inkubere i 2 dage i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
- Høst OCM, dvs supernatant indeholdende OL udskilles faktorer. Filtersteriliser OCM ved hjælp af et 0,22 μm filter.
BEMÆRK: Opbevar OCM ved 4 °C i højst 2 måneder.
10. OCM-tilføjelse
BEMÆRK: Trinskal udføres i en laminar flow hætte under sterile forhold. OCM kan tilsættes renset hippocampal neuron kulturer udarbejdet i henhold til følgende protokol14, og opnås ved at tilføje, 24 h efter isolation, anti-mitotiske midler uridine og 5- fluorodeoxyuridin (5 μM) for 36 timer.
- På 3 DIV, fjerne alle neuron kultur medium, der indeholder anti-mitotiske midler og tilsæt 500 μL af frisk varm OCM.
- Forny halvdelen af mediet hver 3.
BEMÆRK: Sådanne kulturer kan opretholdes op til 21 DIV.
11. Tilføjelse af OL til renset hippocampal neuron kultur
BEMÆRK: Udfør følgende trin i en laminarflowhætte under sterile forhold. OLs kan føjes til renset hippocampal kulturer opnået på samme måde som beskrevet ovenfor.
- Forbered co-kultur medium i henhold til tabel 3.
- Hent OL-kulturen med 70% til 80% sammenløb. Skyl med 2 ml varm 1x PBS.
- For at frigøre cellerne, tilføje 2 ml 0,25% trypsin til en 100 mm Petri skål.
- Inkubere i 5 min i en befugtet kuvøse ved 37 °C under 5% CO2.
- Tilføj 2 ml DMEM-10% FCS for at blokere enzymatisk reaktion. Høst supernatanten, der indeholder OL afstamningsceller.
- Centrifugeres ved 423 x g i 5 min ved RT. Fjern forsigtigt supernatanten og ophæng cellepelletet igen i varmt co-kulturmedium for at opnå en koncentration på 1,25 x 105 celler/ml.
- Tilføj OL til renset hippocampal neuroner kultur ved at fjerne 200 μL af neuron kultur medium og tilføje 200 μL celle suspension per brønd (2,5 x 104 celler / godt) af en 24-brønd plade.
- Opdater halvdelen af co-kultur medium hver 2-3 dage.
BEMÆRK: Co-kulturer kan opretholdes op til 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol renses OL-afstamningsceller fra gliakulturer ved at ryste astrocytter og mikroglia af. Renhed og fænotypisk undersøgelse af OL-kulturer kan vurderes ved immunfarvning med gliale markører15. Analysen af udtrykket af forskellige markører viste, at OL-kulturer for det meste var præ-O'er med 90 % ± 4 % af O4+ celler, 85 % ± 7 % NG2+ celler og 4,7 % ± 2,1 % af PLP+ celler, mens 7,2 % ± 2,5 % af cellerne var GFAP+ astrocytter (gennemsnitlige ± S.D., n = 3; Figur 2). Desuden var 4,6 % ± 0,7 % af cellerne CD11b+ mikroglielle celler (gennemsnitlig ± S.D., ikke vist).
OCM fremstillet af sådanne kulturer kan tilføjes på 3 DIV til renset hippocampal neuron kulturer. Denne behandling fremmer klyngedannelse af nodal proteiner, bestående af Nav kanaler forbundet med Neurofascin 186 og Ankyrin G langs axon af hippocampal GABAergic neuroner før myelination, på 17 DIV(Figur 3A,B). Bemærk, elektrofysiologiske optagelser afslørede, at disse klynger er forbundet med en øget ledning af handling potentialer14. Desuden øges ekspressionaf fosforyleret mellemliggende glødetråd protein H plettet af Smi31 i OCM-behandlede hippocampal neuroner (Figur 3A). Oligodendroglial udskillede faktorer er derfor impliceret i neuronal modning og fysiologi.
Myelination af hippocampal neuroner kan studeres gennem tilsætning af OL på 14 DIV. Fra 20 DIV til 24 DIV, immunfarvning af myelin markører, såsom myelin basic protein (MBP) giver mulighed for visualisering af myelin segmenter (Figur 4).
Figur 1: Protokoltidslinje for isolering af OL-afstamningsceller og produktion af OCM. Efter dissekere ud cerebral cortices fra P2 Wistar rotter (trin 4), udføre væv dissociation til kultur gliaceller (trin 5). På 8, 12 og 15 DIV (dvs. dage før rystelser), forny halv medium med varm DMEM-10% FCS (trin 6). Den næste dag rystes glialkulturer natten over ved 250 omdrejninger i minuttet ved 37 °C (trin 7.2). Høst supernatant indeholdende OL afstamning celler og få mikroglia celler og plade det i 15 min i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2 (trin 8.3 til 8.7). Supernatanten centrifugeres i 5 min ved 423 x g,ophængcellepellet med BS og inkuberes i 2 dage i en befugtet inkubator ved 37 °C under 5% CO2 (trin 8.8 til 8.12). At producere OCM, inkubere i 2 dage i NB-B27low (trin 9). Hvis du vil isolere O-adresser til co-kultureksperimenter, skal du frigøre celle ved hjælp af trypsin (trin 11.3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: OL afstamning celler fænotype i kulturer. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et konfokalmikroskop. Der præsenteres maksimale intensitetsfremskrivninger. (A) OL-kulturer indeholder for det meste præ-OLs (dvs. kun udtrykker NG2 (rød), eller både O4 (grøn) og NG2 (rød), celler, der udtrykker begge markører er angivet med gule stjerner), men også nogle umodne OLs (dvs. kun udtrykke O4 og ikke NG2; hvide stjerner). (B) Få modne OLs (dvs. PLP+; grøn) og få astrocytter (GFAP+ celler, rød) findes i OL afstamning cellekulturer. Skalastænger = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative ansøgninger. (A,B) Hippocampal neuroner behandlet med OCM på 3 DIV og fastgjort til 17 DIV express fosforyleret mellemliggende glødetråd protein H (Smi31; grøn; panel A). GABAergic neuroner, identificeret ved glutamat decarboxylase isoform af 67 kDa (GAD67) udtryk (hvid), display ophobning af Ankyrin G og Namod natrium kanaler (rød; paneler A og B, henholdsvis) på axon oprindelige segment og danner Ankyrin G og Nav klynger langs deres axon (paneler A og B, henholdsvis). Skalastænger = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative ansøgninger. OL afstamning celler føjet til hippocampal neuron kultur på 14 DIV myelinate nogle hippocampal axoner, her fast på 23 DIV (MBP som en myelin markør; grøn). Noder af Ranvier (Nav ;rød) er observeret i mellem myelin segmenter. Skalabjælke = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Bottenstein-Sato (BS) medier | Endelig koncentration |
| Dulbecco's Modificerede Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| apo-Transferrin menneskelige | 100 μg/ml |
| BSA (KvægSerum Albumin) | 100 μg/ml |
| Insulin | 5 μg/ml |
| PDGF (PDGF) | 10 ng/ml |
| Progesteron | 62 ng/ml |
| Putrescine dihydrochlorid | 16 μg/ml |
| Natriumselenit | 40 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 30 ng/ml |
| T4 (L-Thyroxin) | 40 ng/ml |
Tabel 1: Forberedelse af Bottenstein-Sato (BS) medier.
| NB-B27 lavt medie | Endelig koncentration |
| Neurobasal | |
| B27 tillæg | 0,5 x |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| NB-B27 medier | Endelig koncentration |
| Neurobasal | |
| B27 tillæg | 1x |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
Tabel 2: Forberedelse af NB-B27low- og NB-B27-medier.
| Co-kultur medier | Endelig koncentration |
| Dulbecco's Modificerede Eagle Medium | 1 vol. |
| Neurobasal | 1 vol. |
| B27 tillæg | 1x |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| apo-Transferrin menneskelige | 50 μg/ml |
| Biotin | 10 ng/ml |
| BSA (KvægSerum Albumin) | 50 μg/ml |
| Ceruloplasmin (Ceruloplasmin) | 100 ng/ml |
| Hydrocortison | 0,05 μM |
| Insulin | 5 μg/ml |
| N-Acetyl-L-cystein | 5 μg/ml |
| Progesteron | 6.2 ng/ml |
| Putrescin | 16 μg/ml |
| Rekombinant Human CNTF | 0,1 ng/ml |
| Natriumselenit | 5 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 40 ng/ml |
| Vitamin B12 | 27.2 ng/ml |
Tabel 3: Forberedelse af samkulturmedier.
Supplerende fil 1. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi en detaljeret protokol for at opnå højt berigede oligodendroglial afstamning cellekulturer fra blandede gliakulturer, tilpasset fra en tidligere offentliggjort metode16, og den efterfølgende produktion af OL-betinget medium. Denne rysteteknik er ikke dyr, kan gentages tre gange og er optimal til at opnå en stor mængde rensede O'er, da celler, der dyrkes i Bottenstein-Sato (BS) medium, der indeholder PDGFα, formeresig. Glial celler er forberedt ved hjælp af cerebralcortices af Wistar rotter på P2, et tidspunkt, hvor et stort flertal af oligodendroglial afstamning celler er pre-oligodendrocytes udtrykke NG2 og O415. Bemærk, OL afstamning modning er ens ved P2 i mus og rotte, og denne protokol kan også bruges til at isolere musen pre-oligodendrocytes17.
Efter at have rystet de blandede gliacellekulturer består de fritliggende celler hovedsageligt af oligodendroglial afstamningsceller, men også nogle mikroglielle celler og få astrocytter. Mikroglielle celler fjernes gennem differential vedhæftning på ubestrøget petriskåle. Bemærk, fjernelse effektivitet kan forbedres ved at udføre en ekstra vedhæftning trin. Men, omkring 5% af mikroglielle celler findes stadig i beriget oligodendroglial celle kulturer, samt 5% til 9% af astrocytter. Det er muligt at mindske forureningen fra astrocytter til mindre end 5% ved at udføre et ekstra immunpanoreringstrin ved hjælp af O4 antistofbelagte petriskåle; for en detaljeret protokol se supplerende oplysninger i Freeman et al.14. Fjernelse af snavs 2 timer efter plating oligodendroglial celler er et kritisk skridt, som bygger på styrken af strømmen anvendes med pipetten. På dette trin er det vigtigt at undersøge kulturen under mikroskopet før og efter clearing for at kontrollere effektiviteten, da tilstedeværelsen af for meget snavs kan forringe cellernes levedygtighed og vækst. Bemærk, det er også vigtigt at bruge frisklavet BS medium, ellers kunne det ændre oligodendrocytes overlevelse. Desuden overlever rensede celler kun op til 6 dage efter plating. Faktisk er det kendt, at andre gliaceller og neuroner fremme OPC overlevelse og spredning eller differentiering gennem udskillede faktorer eller direkte kontakter2,18.
Andre metoder tillader OLs isolation umiddelbart efter hjernedissociation ved hjælp af immunmærkning med O4-antistof efterfulgt af fluorescerende cellesortering ved flowcytometri (FACS) eller magnetisk-aktiveret cellesortering (MACS). Desuden kan GFP-positive OPCs eller GFP-positive oligodendrocytter renses ved fluorescerende-aktiveret cellesortering fra PDGFαR: GFP eller PLP:GFP mus, henholdsvis19,20. Disse sorteringsmetoder er mere relevante for at studere fysiologiske tilstand af oligodendrocytes sammenlignet med kulturer behandlet med vækstfaktorer, som kan ændre deres fænotype. Især fluorescerende-aktiveret celle sortering er blevet brugt til gen-profilering tilgange i den normale fysiologiske tilstand og demyeliniserende betingelser21. Da celleoverlevelse kan ændres ved cellesortering, er det bedre at udføre funktionelle analyser umiddelbart efter sortering.
Vi har vist, at OL kulturer kan adskilles og føjes til renset hippocampal neuron kulturer på 14 DIV. En sådan OL-neuron co-kultur giver mulighed for undersøgelse af tidlige trin af myelination, som starter i løbet af den første uge af co-kultur (Dubessy, ikke offentliggjorte resultater). Andre modeller af OL-hippocampal neuron myelinating co-kultur er opnået ved at tilføje oligodendrocytes umiddelbart efter sortering22,23. Desuden producerede vi OCM for yderligere at dissekere OL-neuron interaktioner og løse den rolle, OL-udskillede faktorer på neuron kulturer. Ved at bruge denne teknik, viste vi, at hippocampal GABAergic neuron undertyper (dvs. parvalbumin+ og / eller somatostatin+) kan danne klynger af nodal proteiner langs deres axon, som er induceret af OCM før myelination14,24. Massespektrometrianalyse af OCM har optrævlet flere udskillede proteiner og ført til at identificere oligodendroglial Contactin-1, der i synergi med ekstracellulære matrixproteiner formidler tidlige trin i knudepunktsklyngedannelse24. Primære kulturer er nyttige modeller, der gør det muligt at vurdere oligodendroglial afstamning celle differentiering og interaktioner med neuroner. Men andre tilgange er også blevet udviklet til at evaluere OL funktioner og myelination, demyelination og remyelination fra ex vivo cerebellar organotypic skive kulturer25,26, og in vivo undersøgelser, især med zebrafisk og haletudsmodeller27, som er nødvendige i de sidste trin af prækliniske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller modstridende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Rémi Ronzano for hans kloge råd i manuskriptredigering. Dette arbejde blev finansieret af ICM, INSERM, ARSEP foundation grant til NSF og Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
