Summary

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

Published: February 09, 2020
doi:

Summary

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Abstract

Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.

Introduction

Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren1. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen2. Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung4ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs5,6.

Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert7. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann2. OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.

Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend13. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.

Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.

Protocol

Die Pflege und Verwendung von Ratten in diesem Experiment entspricht den institutionellen Politiken und Leitlinien (UPMC, INSERM und Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaft). Das folgende Protokoll wird für einen Standard-Wurf von 12 Welpen eingerichtet. 1. Vorbereitung der Kolben (ca. 5 min) HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte am Tag vor der Zerlegung in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus. Beschi…

Representative Results

In diesem Protokoll werden OL-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt werden. Reinheit und phänotypische Untersuchung von OL-Kulturen kann durch Immunfärbung mit Gliamarkern15beurteilt werden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass OL-Kulturen meist Vor-OLs waren, wobei 90 % 4 % der O4+-Zellen, 85 % bei 7 % NG2+ Zellen und 4,7 % 2,1 % der PLP+ Zellen, während 7,2…

Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode16, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Rémi Ronzano für seinen klugen Rat in der Manuskriptbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch ICM, INSERM, ARSEP Stiftung Zuschuss an NSF und Bouvet-Labruyére Preis finanziert.

Materials

5-fluorodeoxyuridine Sigma F0503
B27 supplement ThermoFisher 17504044
D-(+)-Glucose solution Sigma G8769
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington LS002139
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Ethanol 100% Sigma 32221-M
Ethanol 70% VWR Chemicals 83801.360
Fetal Calf Serum ThermoFisher 10082147
L-cysteine Sigma C7352
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium ThermoFisher A1285601
Polyethylenimine(PEI) Sigma P3143
Tetraborate decahydrate Sigma B9876
Trypsin Sigma Sigma
Uridine Sigma U3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin human Sigma T1147
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Insulin Sigma I5500
PDGF Peprotech AF-100-13A
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
T4 (L-Thyroxine) Sigma T1775
Co-culture media
apo-Transferrin human Sigma T1147
B27 supplement ThermoFisher 17504044
Biotin Sigma B4639
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma A4161
Ceruloplasmin Sigma 239799
Dulbecco's Modified Eagle Medium ThermoFisher 31966021
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Sigma I5500
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A8199
Neurobasal ThermoFisher 21103049
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
Progesterone Sigma P8783
Putrescin Sigma P5780
Recombinant Human CNTF Sigma 450-13
Sodium selenite Sigma S5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) Sigma T6397
Vitamin B12 Sigma V6629
Tools
0.22 µm filter Sartorius 514-7010
1 mL syringe Terumo 1611127
100 mm Petri dish Dutscher 193100
15 mL tube Corning Life Science 734-1867
50 mL tube Corning Life Science 734-1869
60 mm Petri dish Dutscher 067003
70 µm filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Binocular microscope Olympus SZX7
Curved forceps Fine Science Tools 11152-10
Fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Large surgical scissors Fine Science Tools 14008-14
Scalpel Swann-morton 233-5528
Shaker Infors HT
Small surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Small surgical spoon Bar Naor Ltd BN2706
T150 cm2 flask with filter cap Dutscher 190151
Animal
P2 Wistar rat Janvier RjHAn:WI

References

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Mazuir, E., Dubessy, A., Wallon, L., Aigrot, M., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments. J. Vis. Exp. (156), e60912, doi:10.3791/60912 (2020).

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