Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

Drosophila is een veel gebruikt experimenteel model geschikt voor het screenen van geneesmiddelen met mogelijke toepassingen voor kankertherapie. Hier beschrijven we het gebruik van Drosophila bonte oogkleurfenotypes als een methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen.

Abstract

Drosophila is een uitstekend model organisme dat kan worden gebruikt om verbindingen die nuttig kunnen zijn voor kankertherapie scherm. De hier beschreven methode is een kosteneffectieve in vivo methode om heterochromatine-bevorderende verbindingen te identificeren met behulp van Drosophila. De Drosophila's DX1 stam, met een bonte oogkleur fenotype dat de omvang van heterochromatine vorming weerspiegelt, waardoor een hulpmiddel voor een heterochromatine-bevorderend drugscherm. Bij deze screeningmethode wordt oogvariatie gekwantificeerd op basis van het oppervlak van rode pigmentatie dat delen van het oog beslaat en wordt beoordeeld op een schaal van 1 tot 5. De screeningmethode is eenvoudig en gevoelig en maakt het mogelijk om verbindingen in vivo te testen. Drug screening met behulp van deze methode biedt een snelle en goedkope manier voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende geneesmiddelen die gunstige effecten kunnen hebben in kanker therapieën. Het identificeren van verbindingen die de vorming van heterochromatine bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van epigenetische mechanismen voor de ontwikkeling van kanker.

Introduction

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij genexpressie, bij het reguleren van chromosoomsegregatie tijdens celdeling en bij de bescherming tegen genoominstabiliteit1. Heterochromatine wordt beschouwd als een genrepressieregulator en ter bescherming van de chromosoomintegriteit tijdens celmitose2,3. Het wordt geassocieerd met de di- en tri-methylatie van histon H3 lysine 9 (H3K9me) tijdens afstamming strekkende verplichting 4,5. Bovendien wordt de aanwerving van Chroom-1-eiwitten (Heterochromatine 1) ook beschouwd als geassocieerd met heterochromatine en epigenetische onderdrukking van genexpressie6. Deze eiwitten zijn essentiële componenten en markers van heterochromatinevorming.

Aangezien genomische instabiliteit cellen in staat stelt genetische veranderingen te verwerven die carcinogenese bevorderen, wordt heterochromatine steeds meer erkend in de ontwikkeling van kanker en kan het doelwit zijn voor kankerbehandeling7,8. Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het helpen van heterochromatinevorming. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle maar efficiënte methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen. De screening wordt gedaan door Drosophila te behandelen met een bibliotheek van kleine moleculen. Deze methode maakt gebruik van een bonte oogkleur fenotype in de DX1Drosophila stam die wordt beïnvloed door heterochromatine niveaus. DX1 vliegen bevatten een tandem array van zeven P [lac-w] transgenes, die de bonte expressie / depressie, afhankelijk van heterochromatinisatie, daarom, de omvang van de variëteit in de oogkleur weerspiegelen de heterochromatine niveau. Specifiek, toenemende heterochromatine kan worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van bonte oogkleur (wit oog). Integendeel, afnemende heterochromatine zou worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van de P[lac-w] transgene expressie (rode ogen)9,10,11,12.

Daarom maken we gebruik van dit Drosophila transgene systeem dat een bonte oogkleur fenotype produceert, omdat de expressie direct gecorreleerd is aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig. Bij ontdekking van verbindingen die worden verdacht van het bevorderen van heterochromatine vorming, kunnen we bevestigen dit vermoeden met behulp van andere methoden, zoals westerse vlek. Deze heterochromatine-bevorderende stoffen kunnen in de toekomst verder worden ontwikkeld voor klinische studies bij patiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding drugsbibliotheek

  1. Identificeer en bereid een geneesmiddelenbibliotheek voor om te worden gescreend met behulp van het juiste oplosmiddel bij een gewenste concentratie (bijvoorbeeld 10 mM in DMSO).
    OPMERKING: Een specifiek voorbeeld voor een geneesmiddelenbibliotheek is het Oncologie Set III van het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Compounds in deze set worden geleverd als 20 μL bij 10 mM in 100% DMSO in twee 96-well PP U-bodemplaten en opgeslagen bij -20 °C. De NCI Plate kaarten, en de fundamentele chemische gegevens van elk medicijn kon worden gevonden op de volgende websites:
    NCI-kenteken 4740
    NCI-kenteken 4741

2. Scherm voor heterochromatine-bevorderende drugs met Drosophila

  1. Drosophila Drosophila Fokstrategie (Figuur 1A)
    1. Dag 1: Kruis drie w1118/Y; DX1/CyO mannelijke vliegen en drie of meer maagdelijke w1118 vrouwelijke vliegen in een 25 mm x 95 mm voedsel flacon met 9 mL van standaard Drosophila food media (Bloomington recept). Stel drie replicerenflacons in voor elk medicijn en één controle voor het scherm.
      LET OP: DX1 vliegen werden vriendelijk verstrekt door James Birchler (Universiteit van Missouri)9,13.
    2. Dag 2 en dag 3: Laat de vliegen 2 dagen eieren leggen bij kamertemperatuur (22 °C).
    3. Dag 4: Gebruik een korte uitbarsting van CO2-gas om de ouder vliegen te verdoven en te ontdoen van de ouder vliegt in een "vliegen mortuarium" (een fles met 70% alcohol).
  2. Voer drugs naar Drosophila voor onderzoek.
    1. Verdun elke drugverbinding uit de oorspronkelijke voorraad (20 μL bij 10 mM in 100% DMSO in 96-well PP U-bodemplaten) tot een 10 μM eindconcentratie met 33% DMSO in water. Gebruik 33% DMSO in water zonder enig medicijn als controle.
      OPMERKING: Sommige geneesmiddelen zijn slecht oplosbaar in water en werden opgelost in DMSO. 100% DMSO is giftig voor vliegen. 33% is aanvaardbaar.
    2. Dag 4: Pipetteer 60 μL van een 10 μM medicijnoplossing of controle op de bovenkant van vliegvoedsel. Zorg er op dit punt voor dat de oudervliegen zijn verwijderd en dat er vliegeieren en kruipende eerste-instar larven op het voedsel zijn.
    3. Dag 6: Herhaal pipetteren 60 μL van dezelfde 10 μM medicijnoplossing voor de voedselflacon.
      OPMERKING: Aangezien drugs aan het vliegvoedsel zijn toegevoegd, bevat het voedsel aan het bovenste oppervlak een concentratie van bijna 10 μM en kon het bodemvoedsel niet volledig worden gepenetreerd. Alle vliegen leggen eieren op de voedseltop en eten het bovenste oppervlaktevoedsel.
  3. Observeer en scoor kleurveranderingen in de ogen.
    1. Twee dagen nadat de F1-vliegen tevoorschijn komen (ongeveer op dag 14), onderzoeken de vliegen. Gebruik een korte uitbarsting van CO2 om de F1-vliegen te verdoven en verwijder de vliegen van hun flacon op een poreus ontleedpad met CO2 die onder een filterpapier doorsippend is.
    2. Inspecteer de vliegen op dit pad onder een dissectie microscoop. Bestudeer de hele vlieg en identificeer alle w1118/Y; DX1/+ heterozygoot mannetjes door hun het ontbreken van de CyO dominante krullend vleugel fenotype.
    3. Scoor de oogkleur van elk van de w1118/Y; DX1/+ heterozygoot man vliegt op een schaal van 1 tot 5 (Figuur 1B). Het percentage witte oogkleur werd als volgt beoordeeld:
      1. <5% rood verstrooid oog totaal oppervlak
      2. 6% - 25% rode vlekken oog totale oppervlakte
      3. 26% - 50% rode vlekken oog totale oppervlakte
      4. 51% - 75% rode vlekken oog totale oppervlakte
      5. >75% rode vlekken oog totale oppervlakte
      OPMERKING: Als alternatief homogeniseer vliegkoppen in 100% methanol en gebruik een spectrometer om oogpigmentatie te meten op OD 450 nm. Selecteer alleen mannetjes omdat PEV meer pronouced is in DX1-mannetjes. Score meer dan 10 mannetjes in elk flesje.
    4. Bereken de gemiddelde kleurindex van alle mannetjes van elke flacon gescoord. Werk drievouden uit voor elke verbinding(figuur 1C).
      OPMERKING: Aangezien de kleur van het oog varieert met de leeftijd, is dit een tijdgevoelige stap. De oogkleur moet worden berekend op dezelfde leeftijd - 2 dagen oud. Meestal >10 vliegen moet worden gescoord in elke flacon.
    5. Om te bevestigen dat de verbindingen inderdaad heterochromatinevorming bevorderen, gebruikt u een andere techniek, zoals westerse vlekken om te valideren (figuur 1G).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol werd met succes gebruikt om verbindingen te screenen die heterochromatinevorming in Drosophilabevorderen , wat een efficiënt en goedkoop in vivo-systeem is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen(figuur 1). We onderzochten een kleine-molecuul drug bibliotheek, Oncologie Set III, die bestaat uit 97 FDA geautoriseerde oncologie drugs, met behulp van de DX1 stam van Drosophila melanogaster (Figuur 1B). De resultaten van een significant medicijn waren vertegenwoordigd in een staafgrafiek (figuur 1C,D). Volgens de screening test, methotrexaat (4-aminopteroylglutamic zuur), die is gecodeerd als E7 in de bibliotheek, veroorzaakte de meest variëteit in de DX1 stam, wat suggereert dat methotrexaat zou de meest veelbelovende heterochromatine-bevorderende drug voor toekomstige kanker gerichte therapie(figuur 1E, F). Om verder te bevestigen dat dit inderdaad het testen van de verbindingen ter bevordering van heterochromatine vorming, westerse vlek gegevens blijkt dat heterochromatine vorming geassocieerdeiwit H3K9me3 is upregulated(figuur 1G),verder na te gaan of methotrexaat zou de meest veelbelovende heterochromatine-bevorderende drug.

Figure 1
Figuur 1: Een illustratie van de drugscreening in Drosophila. (A) Drosophila scherm methodologie. Een overzicht van de regeling voor heterochromatine-bevorderende verbindingen screening met behulp van de Drosophila model. Drie w1118/Y; DX1/CyO mannetjes en drie maagdelijke w1118 worden gekruist bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de volwassen vliegen op dag vier en voeg 60 μL van het 10 μM-medicijn dat is opgelost in 33% DMSO-oplossing aan de bovenkant van het vliegvoer op respectievelijk dag vier en dag zes. 33% DMSO oplossing werd gebruikt als een controle. De oogkleur (wit tot rood) verhouding van de F1 mannelijke generatie werden waargenomen. (B) Oogkleur fenotype analyse en score. Representatieve afbeeldingen van oogkleur met een gevarieerd fenotype. Het percentage van de kleur van de variëteit oogkleur werd beoordeeld als volgt: 1, 1-5% rode vlekken in de totale oppervlakte; 2, 6-25% rode vlekken in de totale oppervlakte; 3, 26-50% rode vlekken in de totale oppervlakte; 4, 51-75% rode vlekken in de totale oppervlakte; en 5, >75% rode vlekken in het totale oppervlak. (Schaalbalk = 200 μm) (C) Elk medicijn werd geassaid als de gemiddelde waarden uit drie onafhankelijke experimenten ± s.d. (standaarddeviatie). Rode balk toont de controle. (D) Resultaten van de schaal uitgevoerd in drug E7 en controle. Verschillen tussen E7 en controlegroepen werden als significant beschouwd als P-waarden <0,05 (*) waren door student t-Test. (E) De moleculaire structuur van een chemische verbinding die E7 wordt genoemd die in de voorbeelddrugbibliotheek wordt gebruikt. (F) Representatieve beelden van de vliegogen in E7 en controlebehandelingsgroep. (Schaalbalk, 200 μm) (G) De westelijke vlek werd uitgevoerd met antilichamen die specifiek zijn voor H3K9me3, H3, of α-Tubulin met behulp van de 3e instar larven totaal eiwit zonder of met methotrexaat behandeling op de aangegeven concentraties. Dit cijfer is gewijzigd van Loyola etal. 14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij het reguleren van genexpressie. Het wordt steeds meer erkend bij kanker en kan dienen als een potentieel doelwit voor kankertherapie15,16,17,18. Kleine moleculen verbindingen worden vaak gebruikt in de ontwikkeling van geneesmiddelen als gevolg van voordelen in de productie, behoud, en metabolisme in menselijke lichamen. Om heterochromatine-bevorderende verbindingen van kleine moleculen te identificeren, werd een efficiënte methode ontworpen en gepresenteerd met behulp van de DX1Drosophila-stam, waarvan is bewezen dat het de oogkleur van vliegen beïnvloedt op een heterochromatine-afhankelijke manier (figuur 1).

Ons screeningprotocol is een eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk te volgen in vivo systeem voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Echter, een beperking van de screening strategie is het bepalen van een effectieve concentratie van geneesmiddelen. De vrouwelijke fruitvlieg legt haar eieren op het oppervlak van het halfvaste vliegvoer. Voor de medicamenteuze behandeling, we pipet de drug oplossing aan het oppervlak van het voedsel, die wordt verondersteld om een vooraf bepaalde concentratie bevatten. Aangezien verschillende geneesmiddelen echter verschillende efficiëntieverbeteringen kunnen hebben bij het verspreiden naar de bodem van het voedsel, is de concentratie van geneesmiddelen niet gegarandeerd consistent onder het oppervlak of naar de bodem van het voedsel. Bij een concentratie van 10 μM werd de dodelijkheid zelden waargenomen bij larven die behandeld werden met een van de geneesmiddelen in de bibliotheek die we hebben gescreend. De meeste geneesmiddelen veroorzaakten echter ernstige dodelijkheid voor de larven bij een concentratie van 100 μM, wat suggereert dat de concentratie van geneesmiddelen ook kan worden beschouwd als een belangrijke factor voor het scherm.

Hier merken we dat tandemherhalingen zoals die hier worden gebruikt, PEV kunnen activeren door een mechanisme dat in sommige opzichten verschilt van die gezien in pericentrische heterochromatine. Een geneesmiddel dat pev beïnvloedt tijdens de ontwikkeling van embryonale en larven (de hier beschreven test) identificeert alleen geneesmiddelen die van invloed zijn op het onderhoud van heterochromatine in somatische cellen en zal geen geneesmiddelen identificeren die van invloed zijn op de initiële vorming van heterochromatine, die waarschijnlijk optreedt tijdens blastoderm (nucleaire cycli 10-14). Toch kan dit een nuttige test voor een snelle startscherm.

Dit protocol is betrouwbaar en kosteneffectief vanwege de gevoeligheid van deze transgene cluster(DX1)voor heterochromatinevorming, weerspiegeld door de hoeveelheid rode pigmentatie die in het oog aanwezig is. Bovendien maakt de korte levensduur van Drosophila dit protocol efficiënter dan andere modelorganismen zoals zebravissen of menselijke cellen. Hoewel er waarschijnlijk een reporter gensysteem aanwezig is bij zebravissen dat net zo gevoelig is voor heterochromatineniveaus, is hun levensduur veel langer dan Drosophila en zou het langer duren om resultaten te verkrijgen. Bovendien zou het gebruik van menselijke cellen niet mogelijk zijn, omdat dit protocol zich specifiek richt op het gebruik van fenotypische veranderingen van epigenetische regulatie om heterochromatineniveaus te bepalen. Dit protocol biedt dus een efficiënte in vivo methode om te bepalen welk klein medicijnmolecuul mogelijk kan dienen als kandidaat voor het onderdrukken van oncogenes in kankertherapieën. Terwijl de Drosophila drug screening methode is een langzame benadering van het identificeren van verbindingen in vergelijking met sommige in vitro screening methoden, het is relatief gevoelig en stelt ons in staat om verbindingen te testen in vivo. In combinatie met de celscreeningmethode, die relatief goedkoop is, gemakkelijk uit te voeren en een hoge doorvoer is, kan de Drosophila-screeningmethode ook worden gebruikt om hits als aanvullende methode te bevestigen.

Samengevat, met een belang in het identificeren van verbindingen voor verder onderzoek en gericht op heterochromatine voor kankertherapie, hoewel het mechanisme waarin dit gebeurt nog niet volledig wordt begrepen, werd een eenvoudig scherm uitgevoerd om heterochromatine-bevorderende drugs. Het ontdekken van een lage concentratie waarbij een geneesmiddel heterochromatinevorming kan bevorderen, kan meer unieke behandelingen bieden die kunnen leiden tot minder bijwerkingen in vergelijking met moderne chemotherapiebehandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

Wij danken J. Birchler, E. Bach en het Bloomington Drosophila Stock Center voor diverse Drosophila stammen; het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD studenten waaronder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, en Alex Chavez. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van american Thoracic Society aan J.L. en financiering van NIH: R01GM131044 aan W.X.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Tags

Genetica Kwestie 157 heterochromatine tumoronderdrukking kleine moleculesamenstellingen drugonderzoek heterochromatine-bevorderend medicijn celproliferatie Larven Drosophila, Drosophilacellen, volwassen Drosophila positie-effect variegation
Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met <em>drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter