Summary
דרוזופילה הוא מודל ניסיוני נפוץ המתאים לסינון תרופות עם יישומים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. כאן, אנו מתארים את השימוש של דרוזוהילה מגוונים העין פנוטיפים כשיטה להקרנה תרכובות קטנות מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין.
Abstract
Drosophila ילה היא אורגניזם מודל מעולה כי ניתן להשתמש כדי המסך תרכובות שעשוי להיות שימושי עבור טיפול בסרטן. השיטה המתוארת כאן היא חסכונית בשיטה vivo כדי לזהות הטרוכרוטין-קידום תרכובות באמצעות Drosophila ילה. המאמץ הDX1 של דרוזוההילה , לאחר שצבע עיניים מגוון המשקף את האקסון של היווצרות הטרוכרומטין, ובכך מספק כלי עבור הטרוכרומטין לקידום התרופה. בשיטת ההקרנה הזאת, מגוון העין מבוסס על השטח של פיגמנטציה אדומה הכובשת חלקים של העין, והוא הבקיע בקנה מידה של 1 עד 5. שיטת ההקרנה פשוטה ורגישה ומאפשרת בדיקת תרכובות בvivo. הקרנת סמים בשיטה זו מספקת דרך מהירה וזולה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות שיכולות להיות השפעות מועילות בtherapeutics הסרטן. זיהוי תרכובות לקדם את היווצרות של הטרוכרומטין יכול גם להוביל לגילוי של מנגנונים אפיגנטיים של התפתחות הסרטן.
Introduction
הטרוכרומטין היא צורה מרוכזת של דנ א אשר ממלאת תפקיד מרכזי בביטוי הגנים, בוויסות הפרדה של כרומוזום במהלך חלוקת התא, ובהגנה מפני אי-יציבות הגנום1. הטרוכרומטין נחשב הרגולטור הדיכוי הגנטי כדי להגן על שלמות כרומוזום במהלך מיטוזיס תא2,3. הוא משויך ל-di ו tri-מתילציה של היסטון H3 ליזין 9 (H3K9me) במהלך מחויבות השושלת4,5. יתר על כן, הגיוס של חלבון הטרוכרומטין 1 (HP1) חלבונים chromodomain נחשב גם להיות משויך עם הטרוכרומטין ודיכוי אפיגנטי של ביטוי גנים6. חלבונים אלה הם רכיבים חיוניים וסמנים של היווצרות הטרוכרומטין.
מאז אי-יציבות גנומית מאפשר לתאים לרכוש שינויים גנטיים לקדם קרצינובגנזה, הטרוכרומטין הוא הופך להיות מוכר יותר בפיתוח סרטן יכול להיות מיועד לטיפול בסרטן7,8. כיום, אין תרופות שהוקמו היטב בסיוע להיווצרות הטרוכרומטין. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה אך יעילה להקרנה תרכובות קטנות-מולקולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין. ההקרנה נעשית על ידי הטיפול בדרוסופילה עם ספרייה של תרופות מולקולות קטנות. שיטה זו מנצלת צבע עיניים מגוונים העין בתוך DX1drosophila ילה זן המושפע על ידי רמות הטרוכרומטין. DX1 זבובים מכילים מערך דו-מושביים של שבעה מפלסים [lac-w] transgenes, אשר יש ביטוי מגוון/דיכאון בהתאם הטרוכרוהמלחה, ולכן, היקף המגוון בצבע העיניים משקף את רמת הטרוכרומטין. באופן ספציפי, הטרוכרוטין יכול להתגלות על ידי היחס העולה של צבע עיניים מגוונים (עין לבנה). להיפך, הטרוכרומטין היורדת יזוהו על ידי שיעור העלייה של P [lac-w] הביטוי (עין אדומה)9,10,11,12.
לכן, אנו מנצלים את המערכת הזאת של דרוזולה טרנסגנטית המפיקה מגוון מגוונים של צבע עיניים מאחר והביטוי שלה מתואם ישירות לכמות הטרוכרומטין הנוכחית. עם גילוי תרכובות החשודות לקדם את היווצרות הטרוכרומטין, אנו עשויים לאשר חשד זה באמצעות שיטות אחרות כגון אבן חשופה מערבית. אלה הטרוכרוטין-קידום חומרים עשויים להתפתח עוד לניסויים קליניים בחולים בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לספריות תרופות
- לזהות ולהכין ספריית סמים להיות מוקרן באמצעות הממס המתאים בריכוז הרצוי (למשל, 10 מ"מ ב DMSO).
הערה: דוגמה ספציפית לספריית תרופות היא מערכת האונקולוגיה השלישי מ המכון לסרטן הלאומי (NCI) תוכנית Therapeutics התפתחותית (DTP). תרכובות בקבוצה זו מסופקים כ 20 μL ב 10 מ"מ ב 100% DMSO ב 2 96-ובכן PP U-בתחתית לוחות ומאוחסנים ב-20 ° c. מפות הלוח NCI, ואת הנתונים הכימיים הבסיסיים של כל תרופה ניתן למצוא באתרי האינטרנט הבאים:
לוחית מספר 4740 של NCI
לוחית מספר 4741 של NCI
2. מסך עבור הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה
-
דרוסופילה אסטרטגיית רבייה (איור 1א)
- יום 1: לחצות שלושה w1118/y; DX1/CyO זכר זבובים ושלושה או יותר בתולה w1118 נקבה זבובים בבקבוקון 25 מ"מ x 95 מ"מ מזון עם 9 מ מ של מזון מסוג drosophila ילה מדיה (בלומינגטון מתכון). הגדר שלוש מבחנות שכפול עבור כל תרופה ושליטה אחת עבור המסך.
הערה: DX1 זבובים סופקו על ידי ג ' יימס birchler (אוניברסיטת מיזורי)9,13. - יום 2 ויום 3: הניחו לזבובים להטיל ביצים במשך יומיים בטמפרטורת החדר (22 ° c).
- יום 4: להשתמש בפרץ קצר של CO2 גז כדי להשליך את זבוב ההורה ולהיפטר של זבוב ההורה "חדר המתים לעוף" (בקבוק המכיל 70% אלכוהול).
- יום 1: לחצות שלושה w1118/y; DX1/CyO זכר זבובים ושלושה או יותר בתולה w1118 נקבה זבובים בבקבוקון 25 מ"מ x 95 מ"מ מזון עם 9 מ מ של מזון מסוג drosophila ילה מדיה (בלומינגטון מתכון). הגדר שלוש מבחנות שכפול עבור כל תרופה ושליטה אחת עבור המסך.
- . להאכיל את התרופות לדרוסופילה להקרנה
- לדלל כל תרכובת התרופה מהמלאי המקורי (20 μL ב 10 מ"מ ב 100% DMSO ב 96-טוב PP U-בתחתית לוחות) עד 10 μM ריכוז סופי עם 33% DMSO במים. השתמש ב-33% DMSO במים ללא כל תרופה כפקד.
הערה: חלק מהסמים מסיסים במים ירודים והתפרקה ב-DMSO. 100% DMSO רעיל לזבובים. .33% נסבל - יום 4: פיפטה 60 μL של 10 מתוך פתרון התרופה μM או שליטה על החלק העליון של מזון לעוף. בשלב זה, ודא כי זבובים ההורה הוסרו ויש ביצים לעוף וזוחלים הזחלים הראשון על המזון.
- יום 6: חזור על ליטוף 60 μL של אותו הפתרון של 10 μM תרופה לבקבוקון המזון.
הערה: מאחר והתרופות נוספו למזון לעוף, מזון הפנים העליון מכיל כמעט 10 הריכוז μM והאוכל התחתון לא יכול להיות חודר לחלוטין. כל הזבובים להטיל ביצים על גבי האוכל ולאכול את האוכל העליון משטח.
- לדלל כל תרכובת התרופה מהמלאי המקורי (20 μL ב 10 מ"מ ב 100% DMSO ב 96-טוב PP U-בתחתית לוחות) עד 10 μM ריכוז סופי עם 33% DMSO במים. השתמש ב-33% DMSO במים ללא כל תרופה כפקד.
- להתבונן ולהבקיע צבע עיניים שינויים.
- יומיים לאחר הזבובים F1 לצאת (בערך ביום 14), לבחון את הזבובים. השתמש פרץ קצר של CO2 כדי להוריד את הזבובים F1 ולהסיר את הזבובים מן המבחנה שלהם על משטח מבתר נקבובי עם CO2 ללגום מתחת נייר סינון.
- לבדוק את הזבובים על הלוח הזה תחת מיקרוסקופ ניתוח. בדוק את כל זבוב ולזהות את כל w1118/y; DX1/+ heterozygous זכרים על ידי חסרי הכנף cyo דומיננטי מתולתל האגף.
- ציון צבע העין של כל אחד w1118/y; DX1/+ heterozygous גברים זבובים בקנה מידה של 1 עד 5 (איור 1B). אחוז צבע העיניים הלבנות דורג כדלקמן:
1. < 5% מפוזרים על פני השטח הכולל עיניים מפוזרות
2.6%-25% כתמים אדומים עין שטח כולל הקרקע
3.26%-50% העיניים האדומות כתמים בשטח השטח הכולל
4.51%-75% כתמים אדומים עין שטח הקרקע הכולל
5. > 75% כתמים אדומים עין שטח הקרקע הכולל
הערה: לחילופין, הומוגון ראשי לטוס ב 100% מתנול ולהשתמש ספקטרומטר למדוד פיגמנטציה העין ב OD 450 nm. בחר רק זכרים, כי PEV הוא בולט יותר DX1 זכרים. ציון יותר מ 10 זכרים בכל בקבוקון. - לחשב את אינדקס צבע ממוצע של כל הזכרים מכל בקבוקון הבקיע. בצע מטריפליטים עבור כל תרכובת (איור 1ג).
הערה: מכיוון שצבע העיניים משתנה עם הגיל, זהו שלב רגיש לזמן. יש לחשב את צבע העין באותו גיל – בן יומיים. בדרך כלל > 10 זבובים צריך להיות הבקיע בכל בקבוקון. - כדי לאשר כי תרכובות אכן לקדם את היווצרות הטרוכרומטין, להשתמש בטכניקה שונה כגון בלוק המערבי כדי לאמת (איור 1G).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי להקרין תרכובות המקדמים את היווצרות הטרוכרומטין בדרוסופילה, שהוא יעיל ובעלות נמוכה במערכת vivo לפיתוח התרופה (איור 1). הוקרן ספרייה קטנה מולקולה סמים, אונקולוגיה Set III, אשר מורכב של 97 FDA תרופות מורשה לאונקולוגיה, באמצעות זן DX1 של Drosophila ילה melanogaster (איור 1B). התוצאות עבור תרופה משמעותית היו מיוצגים בגרף עמודות (איור 1ג, ד). על פי שיטת ההקרנה, מטוטרקסט (4-aminopteroylglutamic חומצה), אשר מקודד כמו E7 בספרייה, גרם הזנים ביותר בזנים DX1 , מציע כי מטוטרקסט יכול להיות הטרוכרומטין המבטיחים ביותר-קידום התרופה עבור סרטן עתידי המיועד לטיפול (איור 1E, F). כדי לוודא עוד כי זה אכן בדיקות תרכובות קידום היווצרות הטרוכרומטין, כתמי הנתונים המערבית מראה כי היווצרות הטרוכרומטין משויך חלבון H3K9me3 הוא upregulated (איור 1G), עוד מוודא כי מטוטרקסט יכול להיות הטרוכרומטין המבטיחים ביותר-קידום הסם.
איור 1: איור של הקרנת הסמים בדרוסופילה. (א) דרוזוהילה מתודולוגיהלמסך. סקירה של תוכנית עבור הטרוכרומטין-קידום ההקרנה תרכובות באמצעות מודל Drosophila ילה . שלושה w1118/y; DX1/CyO זכרים ושלושה wבתול1118 מצטלבים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את הזבובים בוגרים ביום 4 ולהוסיף 60 μL של התרופה 10 μM מומס 33% DMSO פתרון לראש המזון לעוף ביום ארבעה ויום שש, בהתאמה. 33% הפתרון DMSO שימש כפקד. צבע העיניים (לבן עד אדום) יחס של הדור הגברי F1 נצפו. (ב) צבע עין לניתוח וציון. תמונות מייצגות של צבע עיניים המראה פנוטיפים מגוונים. אחוז העיניים הססגוניות דורג כדלקמן: 1, 1-5% כתמים אדומים בשטח שטח כולל; 2, 6-25% כתמים אדומים בשטח השטח הכולל; 3, 26-50% כתמים אדומים בשטח השטח הכולל; 4, 51-75% כתמים אדומים בשטח השטח הכולל; ו-5, > 75% כתמים אדומים בשטח השטח הכולל. (קנה מידה של בר = 200 μm) (ג) כל תרופה הייתה הערכים הרעים משלושה ניסויים עצמאיים ± ש גויטיין (סטיית תקן). . הבר האדום מראה את השליטה (ד) תוצאות הסקאלה שבוצעה ב-E7 ובקרה של התרופה. הבדלים בין E7 וקבוצות בקרה נחשבו למשמעותיים אם ערכי P היו < 0.05 (*) לפי מבחן ה-t של הסטודנט. (ה) המבנה המולקולרי של תרכובת כימית הנקראת E7 המשמשת בספריית התרופות לדוגמה. (ו) דמויות מייצגות של עיני הזבוב בקבוצת הטיפול E7 ושליטה. (סרגל קנה מידה, 200 μm) (ז) אבן החשופה המערבית בוצעה עם נוגדנים ספציפיים עבור H3K9לי3, H3, או α-טובולין באמצעות הזחלים 3rd הרימות הכולל חלבון ללא או עם טיפול מטוטרקסט בריכוזים המצוין. דמות זו שונתה מלויולה ואח '14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטרוכרוטין היא צורה מרוכזת של דנ א אשר ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות הביטוי הגנטי. זה הופך יותר ויותר מוכר בסרטן עשוי לשמש יעד פוטנציאלי לטיפול בסרטן15,16,17,18. תרכובות קטנות מולקולה משמשות בדרך כלל בפיתוח התרופה בשל יתרונות בייצור, שימור, ומטבוליזם בגוף האדם. כדי לזהות הטרוכרומטין-קידום תרכובות קטנות-מולקולה, שיטה יעילה תוכננה והוצגה באמצעות DX1drosophila ילה מאמץ, אשר הוכח להשפיע על הזבובים ' צבע עיניים בצורה תלוית הטרוכרומטין (איור 1).
פרוטוקול ההקרנה שלנו הוא פשוט, זול וקל לבצע במערכת vivo לפיתוח התרופה. עם זאת, מגבלה אחת של אסטרטגיית ההקרנה היא קביעת ריכוז התרופה יעיל. זבוב הפרי הנשי מניח את ביציה על פני מזון הוצק. כדי לקבל טיפול תרופתי, אנו מפימים את פתרון התרופה למשטח האוכל, שאמור להכיל ריכוז מוגדר מראש. עם זאת, מאחר שסמים שונים יכולים להיות בעלי יעילות שונה בפיזור המזון, ריכוז התרופה אינו מובטח להיות עקבי מתחת לפני השטח או לקראת החלק התחתון של המזון. בריכוז 10 μM, לעתים רחוקות נצפתה הרימות בזחלים שטופלו בסמים בספרייה שהובחנו. עם זאת, רוב התרופות גרמו לזחלים חמורים במהלך ריכוז של 100 μM, ומציע שריכוז הסמים יכול להיחשב גם כגורם חשוב למסך.
כאן, אנו שמים לב כי הדו חוזר, כגון אלה המשמשים כאן יכול להפעיל PEV על ידי מנגנון השונה בחלק מהדברים שנראו בהטרוכרומטין. תרופה המשפיעים על PEV במהלך התפתחות עובריים וזחל (המבחן המתואר כאן) רק תזהה סמים המשפיעים על אחזקה של הטרוכרומטין בתאים הסומטיים ולא יזהה תרופות שישפיעו על היווצרות ראשוני של הטרוכרומטין, אשר ככל הנראה מתרחשת במהלך בלסטועור (מחזורי גרעיני 10-14). עם זאת, הדבר עשוי להיות שימושי עבור מסך מתחיל מהיר.
פרוטוקול זה הוא אמין וחסכוני בשל הרגישות של אשכול זה הטרנסגנטית (DX1) להיווצרות הטרוכרומטין, המתבטא בכמות הפיגמנטציה האדומה הקיימת בעין. בנוסף, תוחלת החיים הקצרה של דרוזוהילה הופכת את הפרוטוקול הזה ליעיל יותר מאשר אורגניזמים מודל אחרים, כגון דגים מסוג דג זברה או תאים אנושיים. בעוד שסביר להניח שמדובר במערכת גנים של כתבת שקיימת ב-דג זברה שהיא רגישה בדיוק כמו רמות הטרוכרומטין, תוחלת החיים שלהם ארוכה הרבה יותר מאשר דרוסופילה ויקח יותר זמן להשיג תוצאות. בנוסף, השימוש בתאים אנושיים לא יהיה אפשרי מאז פרוטוקול זה מתמקד באופן ספציפי באמצעות שינויים פנוטים מן התקנה האפיגנטית כדי לקבוע רמות הטרוכרומטין. כך, פרוטוקול זה מספק יעיל בשיטה vivo כדי לקבוע איזו מולקולה תרופה קטנה עלולה לשמש כמועמד לדיכוי אונאוגנים בtherapeutics סרטן. בעוד שיטת הסינון התרופתי של דרוזוהילה היא גישה איטית לזיהוי תרכובות בהשוואה לכמה בשיטות הסינון החוץ-גופית, היא רגישה יחסית ומאפשרת לנו לבדוק תרכובות בvivo. בשילוב עם שיטת ההקרנה הסלולרית, שהיא זולה יחסית, קלה לביצוע והיא תפוקה גבוהה, ניתן להשתמש בשיטת ההקרנה של הדרוסופילה גם כדי לאשר כניסות כשיטה משלימה.
לסיכום, עם עניין בזיהוי תרכובות עבור מחקר נוסף ופילוח הטרוכרוטין לטיפול בסרטן, למרות המנגנון שבו זה מתרחש עדיין לא הבינו במלואו, מסך פשוט בוצע כדי לזהות הטרוכרומטין-קידום סמים. לגלות ריכוז נמוך שבו תרופה יכולה לקדם את היווצרות הטרוכרומטין יכול להציע טיפולים ייחודיים יותר שעלולים לגרום פחות תופעות לוואי לעומת טיפולים כימותרפיה מודרנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים לג בירכדלר, א. באך ומרכז המלאי של בלומינגטון דרוסופילה עבור זנים דרוזופילה שונים; המכון הלאומי לסרטן (NCI) תוכנית Therapeutics התפתחותית עבור האונקולוגיה להגדיר מולקולה קטנה בספרייה סמים; UCSD סטודנטים לתואר ראשון כולל איימי צ ' אנג, טאסיק אתה, ג'סיקה סינג-באנג, רחל Meza, ו אלכס צ'אבז. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקנית לבית החזה לJ.L. ומימון מ-NIH: R01GM131044 כדי W.X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
References
- Morgan, M. A., Shilatifard, A.
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S.
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H.
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
