Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

Drosophila kanser tedavisi için potansiyel uygulamaları ile tarama ilaçları için uygun yaygın olarak kullanılan deneysel bir modeldir. Burada, Heterokromatin oluşumunu teşvik küçük moleküllü bileşiklertarama için bir yöntem olarak Drosophila alacalı göz rengi fenotiplerin kullanımını açıklar.

Abstract

Drosophila kanser tedavisi için yararlı olabilir bileşikleri taramak için kullanılabilir mükemmel bir model organizmadır. Burada açıklanan yöntem Drosophilakullanarak heterokromatin teşvik bileşikleri tanımlamak için bir maliyet-etkin in vivo yöntemidir. Drosophila's DX1 suşu, heterokromatin oluşumunun derecelerini yansıtan bir alacalı göz rengi fenotip sahip, böylece bir heterokromatin teşvik ilaç ekranı için bir araç sağlayan. Bu tarama yönteminde, göz variegasyonu gözün yüzey alanına göre ölçülür ve 1 ile 5 arasında bir ölçekte puanlandırılır. Tarama yöntemi basit ve hassastır ve bileşiklerin in vivo test edilmesine olanak tanır. Bu yöntemi kullanarak ilaç tarama kanser terapötik yararlı etkileri olabilir heterokromatin teşvik ilaçların belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir yol sağlar. Heterokromatin oluşumunu teşvik bileşiklerin belirlenmesi de kanser gelişiminin epigenetik mekanizmaların keşfine yol açabilir.

Introduction

Heterokromatin gen ekspresyonunda merkezi bir rol oynayan, hücre bölünmesi sırasında kromozom ayrımını düzenleyen ve genom instabilitesi1'ekarşı korumada yoğunlaşmış bir DNA şeklidir. Heterokromatin bir gen baskı düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir ve hücre mitoz sırasında kromozom bütünlüğünü korumak için2,3. Bu soy taahhüdü 4 sırasında histon H3 lizin 9 (H3K9me) di- ve tri-metilasyon ile ilişkilidir4,5. Ayrıca Heterokromatin Protein 1 (HP1) kromoetkialanı proteinlerinin işe alınmasının da heterokromatin ve gen ekspresyonunun epigenetik baskısı ile ilişkili olduğu kabul edilir6. Bu proteinler heterokromatin oluşumunun temel bileşenleri ve belirteçleridir.

Genomik istikrarsızlık kanserogenezteşvik genetik değişiklikler elde etmek için hücreleri sağlar yana, heterokromatin kanser gelişiminde daha tanınan hale geliyor ve kanser tedavisi için hedeflenebilir7,8. Şu anda heterokromatin oluşumuna yardımcı olmak için iyi kurulmuş hiçbir ilaç bulunmamaktadır. Burada heterokromatin oluşumunu teşvik eden küçük moleküllü bileşiklerin taranması için basit ve hızlı ama etkili bir yöntem salıyoruz. Tarama küçük moleküllü ilaçların bir kütüphane ile Drosophila tedavi ederek yapılır. Bu yöntem, heterokromatin düzeylerinden etkilenen DX1Drosophila suşundaki alacalı göz rengi fenotipinden yararlanır. DX1 sinekleri, heterokromatinizasyona bağlı olarak alacalı ekspresyonu/depresyonuna sahip yedi P[lac-w] transgeniiçeren bir tandem dizisi içerir, bu nedenle göz rengindeki variegasyonun derecesi heterokromatin seviyesini yansıtır. Özellikle, artan heterokromatin alacalı göz rengi (beyaz göz) artan oranda tespit edilebilir. Aksine, azalan heterokromatin P[lac-w] transgen ekspresyonu (kırmızı göz)9,10,11,12artan oranı ile tespit edilecektir.

Bu nedenle, ekspresyonu mevcut heterokromatin miktarıyla doğrudan ilişkili olduğundan, alacalı göz rengi fenotipüreten bu Drosophila transgen sisteminden yararlanıyoruz. Heterokromatin oluşumunu teşvik ettiğinden şüphelenilen bileşiklerin bulunması üzerine, batı lekesi gibi diğer yöntemler le bu şüpheyi doğrulayabiliriz. Bu heterokromatin teşvik edici maddeler ileride hastalarda klinik çalışmalar için daha da geliştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İlaç kütüphanesi nin hazırlanması

  1. İstenilen konsantrasyonda uygun çözücü kullanılarak taranacak bir ilaç kütüphanesi belirleyin ve hazırlayın (örneğin, DMSO'da 10 mM).
    NOT: Bir ilaç kütüphanesi için özel bir örnek Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Gelişimsel Tedavi Programı (DTP) Onkoloji Seti III olduğunu. Bu setteki bileşikler 10 mM'de 10 mM'de %100 DMSO'da 96 kuyulu iki PP U-alt plakada 20 μL olarak sağlanır ve -20 °C'de saklanır. NCI Plate haritaları ve her ilacın temel kimyasal verileri aşağıdaki web sitelerinde bulunabilir:
    NCI plaka numarası 4740
    NCI plaka numarası 4741

2. Drosophila kullanarak heterokromatin teşvik edici ilaçlar için ekran

  1. Drosophila Üreme stratejisi (Şekil 1A)
    1. 1. Gün: Çapraz üç w1118/Y; DX1/CyO erkek sinekler ve üç veya daha fazla bakire w1118 dişi sinekler 25 mm x 95 mm gıda şişesi standart Drosophila gıda medya 9 mL (Bloomington tarifi). Her ilaç için üç şişe ve ekran için bir kontrol çoğaltmak ayarlayın.
      NOT: DX1 sinekler nazik James Birchler (Missouri Üniversitesi)9,13tarafından sağlanmıştır.
    2. 2. Gün ve Gün 3: Sineklerin oda sıcaklığında (22 °C) 2 gün boyunca yumurtlamalarına izin verin.
    3. 4. Gün: Ebeveyn sineklerini canlandırmak için kısa bir CO2 gazı patlaması kullanın ve ebeveyn sineklerini "sinek morgunda" (%70 alkol içeren bir şişe) atın.
  2. Tarama için Drosophila'ya ilaç yedirin.
    1. Her ilaç bileşiğini orijinal stoktan seyreltin (96 kuyulu PP U-alt plakalarda %100 DMSO'da 10 mM'de 20 μL) suda %33 DMSO ile 10 μM son konsantrasyona kadar seyreltin. Kontrol olarak herhangi bir ilaç olmadan suda% 33 DMSO kullanın.
      NOT: Bazı ilaçlar suda kötü çözünür ve DMSO'da çözünmüştür. %100 DMSO sinekler için zehirlidir. %33'ü tolere edilebilir.
    2. 4. Gün: Pipet 60 μL 10 μM uyuşturucu çözeltisi veya kontrol sinek gıda üstüne. Bu noktada, ebeveyn sinekler kaldırılmış olduğundan emin olun ve sinek yumurta ve gıda üzerinde ilk instar larvaları sürünerek vardır.
    3. 6. Gün: Aynı 10 μM ilaç çözeltisinin 60 μL'lik kısmını gıda şişesine tekrarlayın.
      NOT: Sinekli gıdaya ilaçlar eklenmiştir, üst yüzey gıdayaklaşık 10 μM konsantrasyon içerir ve alt gıda tam olarak nüfuz edilemez. Tüm sinekler gıda üstüne yumurta bırakır ve üst yüzey gıda yemek.
  3. Göz rengi değişikliklerini gözlemleyin ve puanleyin.
    1. F1 sinekleri ortaya çıktıktan iki gün sonra (yaklaşık 14. günde), sinekleri inceleyin. F1 sineklerini anestezik için kısa bir CO2 patlaması kullanın ve sinekleri şişelerinden bir filtre kağıdının altından geçerken CO2 yudumlarken gözenekli bir diseksiyon pedine çıkarın.
    2. Bu pedteki sinekleri bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Tüm sineği inceleyin ve w1118/Y'nin tamamınıtanımlayın; DX1/+ heterozigot erkeklerde CyO dominant kıvırcık kanat fenotipi nden yoksun olarak görülürler.
    3. W1118/Y'nin her birinin göz renginipuanla; DX1/+ heterozigot erkek 1 ile 5 arasında bir ölçekte uçar (Şekil 1B). Beyaz göz rengi yüzdesi aşağıdaki gibi derecelendirildi:
      1. <%5 kırmızı dağınık göz toplam yüzey alanı
      2. 6% - 25% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      3. 26% - 50% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      4. 51% - 75% kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      5. >%75 kırmızı lekeler göz toplam yüzey alanı
      NOT: Alternatif olarak, homojenize sinek kafaları 100% metanol ve OD 450 nm göz pigmentasyon ölçmek için bir spektrometre kullanın. PEV DX1 erkeklerde daha pronouced çünkü sadece erkek seçin. Her şişede 10'dan fazla erkek puan.
    4. Puanlanmış her şişedeki tüm erkeklerin ortalama renk indeksi hesaplayın. Her bileşik için triplicates gerçekleştirin (Şekil 1C).
      NOT: Göz rengi yaşa göre değiştiğinden, bu zamana duyarlı bir adımdır. Göz rengi aynı yaşta hesaplanmalıdır - 2 gün eski. Genellikle >10 sinekler her şişede puanlanmalıdır.
    5. Bileşiklerin heterokromatin oluşumunu gerçekten desteklediğini doğrulamak için, doğrulamak için batı lekeleme gibi farklı bir teknik kullanın (Şekil 1G).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, drosophilaheterokromatin oluşumunu teşvik bileşikleri taramabaşarıyla kullanılmıştır , hangi ilaç gelişimi için vivo sistemi etkili ve düşük maliyetli(Şekil 1). Drosophila melanogasterinin DX1 türünü kullanarak 97 FDA yetkili onkoloji ilacından oluşan onkoloji seti III adlı küçük moleküllü bir ilaç kütüphanesini taradık (Şekil 1B). Önemli bir ilacın sonuçları bir çubuk grafikte gösterilmiştir(Şekil 1C,D). Tarama tadına göre, kütüphanede E7 olarak kodlanan metotreksat (4-aminopteroylglutamic asit), DX1 suşençok suşuen variegasyon neden, metotreksat gelecekteki kanser hedefli tedavi için en umut verici heterokromatin teşvik ilaç olabileceğini düşündürmektedir(Şekil 1E,F). Daha fazla bu gerçekten heterokromatin oluşumunu teşvik bileşikleri test olduğunu doğrulamak için, batı leke verileri heterokromatin oluşumu ilişkili protein H3K9me3 upregulated olduğunu göstermektedir(Şekil 1G),daha fazla metotreksat en umut verici heterokromatin teşvik ilaç olabileceğini doğrulayan.

Figure 1
Şekil 1: Drosophila'dakiilaç taramasının bir örneği. (A) Drosophila ekran metodolojisi. Drosophila modelini kullanarak heterokromatin teşvik bileşikler tarama için şema genel bir bakış. Üç w1118/Y; DX1/CyO erkekler ve üç bakire w1118 oda sıcaklığında çapraz. Daha sonra, dördüncü gün yetişkin sinekleri çıkarın ve sırasıyla, dördüncü gün ve altıncı gün sinek gıda üstüne% 33 DMSO çözeltisi çözünmüş 10 μM ilaç 60 μL ekleyin. %33 DMSO çözeltisi kontrol olarak kullanılmıştır. F1 erkek neslinin göz rengi (beyazdan kırmızıya) oranı gözlendi. (B) Göz rengi fenotip analizi ve skor. Alacalı fenotip gösteren göz renginin temsili görüntüleri. Variegasyon göz rengi yüzdesi aşağıdaki gibi derecelendirildi: 1, 1-5% toplam yüzey alanında kırmızı lekeler; 2, toplam yüzey alanında% 6-25 kırmızı noktalar; 3, toplam yüzey alanında% 26-50 kırmızı noktalar; 4, 51-75% toplam yüzey alanında kırmızı noktalar; ve 5, >75% toplam yüzey alanında kırmızı noktalar. (Ölçek Çubuğu = 200 μm) (C) Her ilaç, ± s.d. (standart sapma) üç bağımsız deneyden ortalama değerler olarak kabul edilmiştir. Kırmızı çubuk kontrolü gösterir. (D) E7 ilacında yapılan ölçek sonuçları ve kontrol. E7 ve kontrol grupları arasındaki farklar, Öğrencinin t-Testi'nde P-değerleri <0.05 (*) ise anlamlı kabul edildi. (E) Örnek ilaç kütüphanesinde kullanılan E7 olarak adlandırılan kimyasal bileşiğin moleküler yapısı. (F) E7 ve kontrol tedavi grubunda sinek gözlerin temsili görüntüleri. (Ölçek Çubuğu, 200 μm) (G) Batı lekesi, belirtilen konsantrasyonlarda metotreksat tedavisi olmaksızın veya metotreksat tedavisi olmadan3'üncü instar larvaları toplam proteini kullanılarak H3K9me3, H3veya α-Tubulin'e özgü antikorlarla yapıldı. Bu rakam Loyola ve ark14'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heterokromatin gen ekspresyonunu düzenleyen merkezi bir rol oynayan yoğun bir DNA şeklidir. Bu kanser giderek daha fazla tanınan hale geliyor ve kanser tedavisi için potansiyel bir hedef olarak hizmet verebilir15,16,17,18. Küçük moleküllü bileşikler, insan vücudunda üretim, koruma ve metabolizmadaki avantajlar nedeniyle ilaç geliştirmede yaygın olarak kullanılmaktadır. Heterokromatin teşvik eden küçük moleküllü bileşikleri tanımlamak için, dx1Drosophila suşu kullanılarak tasarlanmış ve sunulmuştur, bu yöntem de sineklerin göz rengini heterokromatin bağımlı bir şekilde etkilediği kanıtlanmıştır(Şekil 1).

Tarama protokolümüz ilaç gelişimi için basit, ucuz ve takip edilebilmektedir. Ancak, tarama stratejisinin bir sınırlama etkili bir uyuşturucu konsantrasyonu belirlenmesidir. Dişi meyve sineği yumurtalarını yarı katı sinek yiyeceğin yüzeyine bırakır. İlaç tedavisi için, ilaç çözeltisini önceden belirlenmiş bir konsantrasyon içermesi gereken gıda yüzeyine boruyla bağlıyoruz. Ancak, farklı ilaçların gıdanın dibine difüzyon farklı verimlilikleri olabilir bu yana, ilaç konsantrasyonu yüzeyin altında veya gıda nın altına doğru tutarlı olması garanti edilmez. 10 μM konsantrasyonda, tarandığımız kütüphanedeki herhangi bir ilaçla tedavi edilen larvalarda nadiren öldürücülük gözlendi. Ancak, ilaçların çoğu 100 μM konsantrasyonu yla larvalara ciddi öldürücülük neden olmuş, bu da ilaç konsantrasyonunun ekran için önemli bir faktör olarak düşünülebileceğini düşündürmektedir.

Burada, burada kullanılanlar gibi tandem tekrarlarının, perisentrik heterokromatinde görülenden bazı bakımlardan farklı bir mekanizma yla PEV'i tetiklediğini görüyoruz. Embriyonik ve larva gelişimi sırasında PEV'i etkileyen bir ilaç (burada açıklanan test) sadece somatik hücrelerde heterokromatin in bakımını etkileyen ilaçları belirleyecek ve heterokromatinin ilk oluşumunu etkileyen ilaçları tanımlayacaktır, büyük olasılıkla blastoderm sırasında meydana gelir (nükleer döngüleri 10-14). Yine de, bu hızlı bir başlangıç ekranı için yararlı bir deneme olabilir.

Bu protokol, bu transgen kümesinin(DX1)heterokromatin oluşumuna olan duyarlılığı nedeniyle güvenilir ve uygun maliyetlidir ve gözde bulunan kırmızı pigmentasyon miktarından yansıtılır. Ayrıca, Drosophila kısa ömrü bu protokolü zebra balığı veya insan hücreleri gibi diğer model organizmalardaha verimli hale getirir. Zebra balıklarında heterokromatin düzeylerine karşı hassas bir muhabir gen sistemi mevcut olsa da, yaşam süreleri Drosophila'dan çok daha uzundur ve sonuç elde etmek daha uzun sürer. Ayrıca, bu protokol özellikle heterokromatin düzeylerini belirlemek için epigenetik düzenlemeden yapılan phenotik değişikliklerin kullanılmasına odaklandığından, insan hücrelerinin kullanılması mümkün olmayacaktır. Böylece, bu protokol hangi küçük ilaç molekülünün kanser terapötiklerinde onkogenleri bastırmak için potansiyel olarak bir aday olarak hizmet edebileceğini belirlemek için etkili bir in vivo yöntemi sağlar. Drosophila ilaç tarama yöntemi bazı in vitro tarama yöntemleri ile karşılaştırıldığında bileşikleri tanımlamak için yavaş bir yaklaşım iken, nispeten hassas ve bize in vivo bileşikleri test sağlar. Nispeten ucuz, gerçekleştirmek kolay ve yüksek iş sahibi olan hücre tarama yöntemi ile birlikte, Drosophila tarama yöntemi de ek bir yöntem olarak isabet onaylamak için kullanılabilir.

Özetle, daha fazla araştırma için bileşiklerin belirlenmesi ve kanser tedavisi için heterokromatinin hedeflemesi ile, bunun meydana gelen mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, tespit etmek için basit bir ekran yapılmıştır. heterokromatin teşvik edici ilaçlar. Hangi bir ilaç heterokromatin oluşumunu teşvik edebilir düşük konsantrasyon keşfetmek modern kemoterapi tedavileri ile karşılaştırıldığında daha az yan etkilere neden olabilir daha benzersiz tedaviler sunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Acknowledgments

Biz J. Birchler, E. Bach ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi çeşitli Drosophila suşları için teşekkür ederiz; Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Onkoloji Seti küçük moleküllü ilaç kütüphanesi için Gelişimsel Terapötik Programı; Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza ve Alex Chavez dahil UCSD lisans öğrencileri. Bu yayında bildirilen araştırma, American Thoracic Society'den J.L.'ye yapılan bir araştırma bursu ve NIH:R01GM131044'ten W.X.L'ye kadar fonla desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
  2. Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
  3. Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
  4. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  5. Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
  6. Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
  7. Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).
  8. Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
  9. Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
  10. Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
  11. Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
  12. Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
  13. Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).
  14. Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
  15. Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
  16. Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
  17. Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
  18. Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).

Tags

Genetik Sayı 157 heterokromatin tümör baskılanması küçük moleküllü bileşikler ilaç taraması heterokromatin teşvik edici ilaç hücre çoğalması Drosophila larvaları Drosophila hücreleri yetişkin Drosophila pozisyon etkisi variegasyonu
<em>Drosophila</em> Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter