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Genetics

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60917

Summary

La drosophila è un modello sperimentale ampiamente utilizzato adatto per lo screening di farmaci con potenziali applicazioni per la terapia del cancro. Qui, descriviamo l'uso di fenotipi di colore degli occhi variati della Drosophila come metodo per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina.

Abstract

La drosophila è un organismo modello eccellente che può essere utilizzato per vagliare composti che potrebbero essere utili per la terapia del cancro. Il metodo qui descritto è un metodo in vivo conveniente per identificare composti che promuovono l'eterocromatina utilizzando la Drosophila. Ceppo DX1 della Drosophila, con un fenotipo di colore degli occhi variegato che riflette le estensioni della formazione di etecromatina, fornendo così uno strumento per uno schermo farmaco che promuove l'eteocromatina. In questo metodo di screening, la varianza degli occhi viene quantificata in base alla superficie della pigmentazione rossa che occupa parti dell'occhio e viene valutata su una scala da 1 a 5. Il metodo di screening è semplice e sensibile e consente di testare composti in vivo. Lo screening farmacologico con questo metodo fornisce un modo rapido ed economico per identificare farmaci che promuovono l'eteocromatina che potrebbero avere effetti benefici nelle terapie contro il cancro. Identificare composti che promuovono la formazione di eteocromatica potrebbe anche portare alla scoperta di meccanismi epigenetici dello sviluppo del cancro.

Introduction

L'eterocromatina è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nell'espressione genica, nella regolazione della segregazione cromosomica durante la divisione cellulare e nella protezione contro l'instabilità delgenoma 1. L'eterocromatina è stata considerata un regolatore di repressione genica e per proteggere l'integrità cromosomica durante la mitosi cellulare2,3. È associato con la di- e tri-metilazione di istone H3 lisina 9 (H3K9me) durante l'impegno di lignaggio4,5. Inoltre, il reclutamento di proteine del cromodominio Heterochromatin Protein 1 (HP1) è anche considerato associato all'eterocromatica e alla repressione epigenetica dell'espressione genica6. Queste proteine sono componenti essenziali e marcatori della formazione di eterocromatica.

Poiché l'instabilità genomica consente alle cellule di acquisire alterazioni genetiche che promuovono la carcinogenesi, l'eterocromatina sta diventando sempre più riconosciuta nello sviluppo del cancro e può essere mirata per il trattamento del cancro7,8. Attualmente, non ci sono farmaci che sono ben consolidati nell'assistere la formazione di eterocromatina. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce ma efficiente per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina. Lo screening viene fatto trattando la Drosophila con una libreria di farmaci di piccole molecole. Questo metodo sfrutta un fenotipo del colore degli occhi variegato nel ceppodi Drosophila DX1che è influenzato dai livelli di eteromatina. Le mosche DX1 contengono una matrice di tandem di sette transgenie P[lac-w], che hanno l'espressione/depressione variegata a seconda dell'eteocromaticizzazione, quindi, l'entità della varietà nel colore degli occhi riflette il livello di eteocromatica. In particolare, l'aumento dell'eteocromatica potrebbe essere rilevato dall'aumento della proporzione di colore degli occhi variegato (occhio bianco). Al contrario, la diminuzione dell'eterocromatina sarebbe rilevata dall'aumento della proporzione dell'espressione transgenica P[lac-w] (occhio rosso)9,10,11,12.

Pertanto, approfittiamo di questo sistema transgene di Drosophila che produce un fenotipo del colore degli occhi variegato poiché la sua espressione è direttamente correlata alla quantità di etecromatina presente. Dopo la scoperta di composti che sono sospettati di promuovere la formazione di etecromatina, possiamo confermare questo sospetto utilizzando altri metodi come macchia occidentale. Queste sostanze che promuovono l'eteocromatina possono essere ulteriormente sviluppate per gli studi clinici in pazienti in futuro.

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Protocol

1. Preparazione della biblioteca di farmaci

  1. Identificare e preparare una libreria di farmaci da vagliare utilizzando un solvente appropriato ad una concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mM in DMSO).
    NOTA: Un esempio specifico per una biblioteca di farmaci è l'Oncologia Set III dal National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). I composti in questo set sono forniti come 20 a 10 mM in 100% DMSO in due piastre U-bottom PP 96-well e conservate a -20 gradi centigradi. Le mappe NCI Plate, e i dati chimici di base di ogni farmaco potrebbero essere trovati presso i seguenti siti web:
    Numero di targa NCI 4740
    Targa numero targa 4741

2. Schermo per farmaci che promuovono l'eteocromatina che promuovono l'uso della Drosophila

  1. Drosophila Strategia di allevamento (Figura 1A)
    1. Giorno 1: Croce tre w1118/Y; Le mosche maschili DX1/CyO e tre o più mosche vergini w1118 mosche femmine in una fiala alimentare da 25 mm x 95 mm con 9 mL di supporti alimentari standard della Drosophila (ricetta Bloomington). Impostare tre fiale di replica per ogni farmaco e un controllo per lo schermo.
      NOTA: le mosche DX1 sono state gentilmente fornite da James Birchler (Università del Missouri)9,13.
    2. Giorno 2 e Giorno 3: Lasciare le mosche a deporre le uova per 2 giorni a temperatura ambiente (22 gradi centigradi).
    3. Giorno 4: Utilizzare una breve raffica di CO2 gas per anetizzare le mosche genitore e smaltire le mosche genitore in un "obitorio di mosca" (una bottiglia contenente 70% alcol).
  2. Farmaci per mangimi alla Drosophila per lo screening.
    1. Diluire ogni composto di droga dal brodo originale (20 -L a 10 mM in 100% DMSO in piastre a 96 pozze A Lut U) a una concentrazione finale di 10 M con 33% DMSO in acqua. Utilizzare 33% DMSO in acqua senza alcun farmaco come il controllo.
      NOTA: Alcuni farmaci sono scarsamente solubili in acqua e sono stati sciolti in DMSO. 100% DMSO è tossico per le mosche. Il 33% è tollerabile.
    2. Giorno 4: Pipette 60 - L di una soluzione di 10 M di droga o controllo sulla parte superiore del cibo a mosca. A questo punto, assicurarsi che le mosche genitore siano state rimosse e ci siano uova di mosca e larve di prima stella striscianti sul cibo.
    3. Giorno 6: Ripetere la depipazione di 60 -L della stessa soluzione di 10 -M di droga alla fiala alimentare.
      NOTA: Poiché i farmaci sono stati aggiunti al cibo a mosca, il cibo di superficie superiore contiene quasi 10 m di concentrazione e il cibo di fondo potrebbe non essere completamente penetrato. Tutte le mosche depongono le uova sulla parte superiore del cibo e mangiano il cibo di superficie superiore.
  3. Osservare e segnare i cambiamenti di colore degli occhi.
    1. Due giorni dopo l'emergere delle mosche di F1 (circa il giorno 14), esaminare le mosche. Utilizzare una breve raffica di CO2 per anetizzare le mosche F1 e rimuovere le mosche dalla loro fiala su un porose tampone di dissezione con CO2 sorseggiando da sotto una carta da filtro.
    2. Ispezionare le mosche su questo cuscinetto al microscopio di dissezione. Esaminare l'intera mosca e identificare tutti w1118/Y; DX1 / ozofozigous maschi per la loro mancanza del fenotipo dell'ala ricci dominante CyO.
    3. Segnare il colore degli occhi di ciascuno dei w1118/Y; DX1 / z maschio eterozigoto vola su una scala da 1 a 5(Figura 1B). La percentuale di colore degli occhi bianchi è stata valutata come segue:
      1. <5% di superficie totale dell'occhio rosso sparso
      2. 6% - 25% macchie rosse occhio totale superficie
      3. 26% - 50% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      4. 51% - 75% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      5. >75% macchie rosse della superficie totale degli occhi
      NOTA: In alternativa, omogeneizzare le testine delle fari in metanolo al 100% e utilizzare uno spettrometro per misurare la pigmentazione degli occhi a OD 450 nm. Selezionare solo i maschi perché PEV è più prognouced nei maschi DX1. Segna più di 10 maschi in ogni fiala.
    4. Calcolare l'indice di colore medio di tutti i maschi da ogni fiala segnata. Eseguire triplicati per ogni composto (Figura 1C).
      NOTA: Poiché il colore degli occhi varia a seconda dell'età, questo è un passo sensibile al tempo. Il colore degli occhi deve essere calcolato alla stessa età – 2 giorni di età. Di solito >10 mosche dovrebbero essere segnati in ogni fiala.
    5. Per confermare che i composti effettivamente promuovono la formazione di eterocromatica, utilizzare una tecnica diversa come il gonfiore occidentale per convalidare (Figura 1G).

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Representative Results

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per vagliare composti che promuovono la formazione di etecromatina nella Drosophila, che è un sistema in vivo efficiente e a basso costo per lo sviluppo di farmaci (Figura 1). Abbiamo proiettato una libreria di farmaci di piccole molecole, Oncologia Set III, che è composto da 97 farmaci oncologici autorizzati FDA, utilizzando il ceppo DX1 di Drosophila melanogaster (Figura 1B). I risultati per un farmaco significativo sono stati rappresentati in un grafico a barre (Figura 1C,D). Secondo il test di screening, il methotrexate (acido 4-aminopteroylglutamic), codificato come E7 nella biblioteca, ha causato la più variegia nel ceppo DX1, suggerendo che il methotrexate potrebbe essere il farmaco più promettente che promuove l'eterocrotina per la futura terapia mirata al cancro (Figura 1E,F). Per confermare ulteriormente che questo è effettivamente testare i composti che promuovono la formazione di eteocromatina, dati di macchie occidentali mostrano che la proteina associata alla formazione di eterocromatica associata H3K9me3 è upregolata (Figura 1G), verificando ulteriormente che la metatoxate potrebbe essere il farmaco che promuove l'eterocromatica più promettente.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione dello screening farmacologico in Drosophila. (A) Metodologia dello schermo della Drosophila. Una panoramica dello schema per lo screening dei composti che promuovono l'eteocromatica utilizzando il modello della Drosophila. Tre w1118/Y; I maschi DX1/CyO e tre vergini w1118 sono incrociati a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere le mosche adulte al quarto giorno e aggiungere 60 L del farmaco di 10 m disciolto nella soluzione DMSO 33% alla parte superiore del cibo di mosca al quarto giorno e al sesto giorno, rispettivamente. La soluzione DMSO del 33% è stata utilizzata come controllo. È stato osservato il rapporto colore degli occhi (da bianco a rosso) della generazione maschile di F1. (B) Analisi e punteggio del fenotipo del colore degli occhi. Immagini rappresentative del colore degli occhi che mostrano fenotipo variegato. La percentuale di colore degli occhi di varietà è stata classificata come segue: 1, 1-5% macchie rosse nella superficie totale; 2, 6-25% macchie rosse in superficie totale; 3, 26-50% macchie rosse in superficie totale; 4, 51-75% macchie rosse in superficie totale; e 5, >75% macchie rosse nella superficie totale. (Barra di scala 200 m) (C) Ogni farmaco è stato analizzato come i valori medi di tre esperimenti indipendenti - s.d. (deviazione standard). La barra rossa mostra il controllo. (D) Risultati della scala eseguita nel farmaco E7 e controllo. Le differenze tra E7 e i gruppi di controllo sono state considerate significative se i valori P erano <0.05 (sezione) dal test t di Student. (E) La struttura molecolare di un composto chimico che ha chiamato E7 utilizzato nella libreria dei farmaci di esempio. (F) Immagini rappresentative degli occhi mosca in E7 e gruppo di trattamento di controllo. (Barra di scala, 200 m) (G) La macchia occidentale è stata eseguita con anticorpi specifici per H3K9me3, H3, o z-Tubulina utilizzando la proteina totale 3rd instar senza o con trattamento di methotrexate alle concentrazioni indicate. Questa cifra è stata modificata da Loyola et al14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'eteocromatica è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'espressione genica. Sta diventando sempre più riconosciuto nel cancro e può servire come potenziale bersaglio per la terapia del cancro15,16,17,18. Composti di piccole molecole sono comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci a causa di vantaggi nella produzione, conservazione, e metabolismo nei corpi umani. Per identificare i composti di piccole molecole che promuovono l'eteocromatina, è stato progettato e presentato un metodo efficiente utilizzando il ceppo DX1Drosophila, che ha dimostrato di influenzare il colore degli occhi delle mosche in modo dipendente dall'etecromatina (Figura 1).

Il nostro protocollo di screening è un sistema in vivo semplice, economico e facile da seguire per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, una limitazione della strategia di screening è determinare un'efficace concentrazione di farmaci. La mosca della frutta femmina depone le uova sulla superficie del cibo semisolido. Per il trattamento farmacologico, abbiamo pipet la soluzione farmacologica alla superficie del cibo, che dovrebbe contenere una concentrazione predeterminata. Tuttavia, poiché diversi farmaci potrebbero avere diverse efficienze nella diffazione sul fondo del cibo, la concentrazione di droga non è garantita per essere coerente sotto la superficie o verso il fondo del cibo. Con una concentrazione di 10 M, la letalità è stata osservata raramente nelle larve trattate con uno qualsiasi dei farmaci nella biblioteca che abbiamo esaminato. Tuttavia, la maggior parte dei farmaci ha causato una grave letalità alle larve a una concentrazione di 100 m, suggerendo che la concentrazione di farmaci potrebbe anche essere considerata come un fattore importante per lo schermo.

Qui, notiamo che le ripetizioni tandem come quelle usate qui possono innescare il PEV da un meccanismo che differisce per alcuni aspetti da quello visto in eterocromatina pericentrica. Un farmaco che influisce sulla PEV durante lo sviluppo embrionale e larvale (il test qui descritto) identificherà solo i farmaci che influiscono sulla manutenzione dell'eteocromatica nelle cellule somatiche e non identificherà i farmaci che influiscono sulla formazione iniziale di eteocroromatina, che molto probabilmente si verifica durante il blastoderm (cicli nucleari 10-14). Ciò nonostante, questo potrebbe essere un saggio utile per una schermata di avvio rapido.

Questo protocollo è affidabile ed economico grazie alla sensibilità di questo ammasso transgene (DX1) alla formazione di eterocromatina, riflessa dalla quantità di pigmentazione rossa presente nell'occhio. Inoltre, la breve durata della Drosophila rende questo protocollo più efficiente rispetto ad altri organismi modello come il pesce zebra o le cellule umane. Mentre è probabile che ci possa essere un sistema genetico dei reporter presente nel pesce zebra che sia altrettanto sensibile ai livelli di etecromatica, la loro durata di vita è molto più lunga della Drosophila e richiederebbe più tempo per ottenere risultati. Inoltre, l'uso di cellule umane non sarebbe possibile poiché questo protocollo si concentra specificamente sull'utilizzo di cambiamenti fenotipici da regolazione epigenetica per determinare i livelli di eteocromatica. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo efficiente in vivo per determinare quale piccola molecola di farmaco potrebbe potenzialmente servire come candidato per la soppressione degli oncogeni nelle terapie contro il cancro. Mentre il metodo di screening farmacologico della Drosophila è un approccio lento all'identificazione dei composti rispetto ad alcuni metodi di screening in vitro, è relativamente sensibile e ci permette di testare composti in vivo. In combinazione con il metodo di screening cellulare, che è relativamente poco costoso, facile da eseguire ed è ad alta produttività, il metodo di screening della Drosophila potrebbe anche essere utilizzato per confermare i risultati come metodo supplementare.

In sintesi, con un interesse a identificare i composti per ulteriori ricerche e mirare all'eteocromatina per la terapia del cancro, anche se il meccanismo in cui ciò si sta verificando non è ancora pienamente compreso, è stato eseguito un semplice schermo al fine di identificare farmaci che promuovono l'eteocromatina. Scoprire una bassa concentrazione a cui un farmaco può promuovere la formazione di eterocromatica potrebbe offrire trattamenti più unici che possono provocare meno effetti collaterali rispetto ai moderni trattamenti chemioterapici.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Ringraziamo J. Birchler, E. Bach e il Bloomington Drosophila Stock Center per vari ceppi di Drosophila; il Programma di Terapia Di Sviluppo del National Cancer Institute (NCI) per la libreria di farmaci per piccole molecole del Set di Oncologia; Studenti universitari UCSD tra cui Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza e Alex Chavez. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione di ricerca dalla American Thoracic Society a J.L. e dai finanziamenti da NIH: R01GM131044 a W.X.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila DX1 strain DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri)
Drosophila food media UCSD fly kitchen
Methotrexate NCI drug library
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Ethyl alcohol Sigma E7023-500ML

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Zhang, L., Dao, K., Kang, A.,More

Zhang, L., Dao, K., Kang, A., Loyola, A. C., Shang, R., Li, J., Li, W. X. A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila. J. Vis. Exp. (157), e60917, doi:10.3791/60917 (2020).

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