腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除
Summary
レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。
Abstract
神経膠腫は、その侵襲性および不均一性を特徴とする原発性脳腫瘍である。例えば、偽官麻痺、微小血管増殖、間葉形転換および壊死などの特定の組織学的パターンは、高級神経膠腫の組織学的不均一性を特徴付ける。我々の研究室は、オンコストリームと名付けられた間葉細胞の高密度の存在が腫瘍悪性腫瘍と相関することを実証した。私たちは、グリオーマの成長と侵略の根本となるメカニズムを理解するためのユニークなアプローチを開発しました。ここでは、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)およびRNAシーケンシングを利用して、腫瘍内の異種多細胞構造(すなわち、間葉領域または腫瘍浸潤領域)の微分mRNA発現を解析する包括的なプロトコルについて説明する。この方法は、良好な組織組織組織学およびRNA完全性を維持する。灌流、凍結、埋め込み、切り離し、染色は、形態を保存し、高品質のレーザーマイクロ解剖サンプルを得るために最適化されました。結果は、30%スクロースを使用するグリオーマを担うマウスの灌流が良好な形態およびRNAの質を提供することを示している。さらに、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンで腫瘍切片を染色すると、RNAの完全性を維持しながら、良好な核染色および細胞染色が行われます。記載された方法は、感受性と高度に再現性が高く、様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態学を研究するために利用することができる。要約すると、固体腫瘍内の異種多細胞構造の分子的特徴を研究するために、シーケンシングのための形態およびRNAの質を維持するLMDを行う完全な方法を説明する。
Introduction
神経膠腫は中枢神経系の最も積極的な原発腫瘍である。彼らは非常に侵襲的で異質な1です。腫瘍の細胞および分子成分の分析は、新たな治療標的を明らかにする。
現在利用可能なさまざまな方法の中で、凍結脳腫瘍組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LMD)は、腫瘍組織からの離散解剖学的領域または特異的細胞集団の単離を可能にする費用対効果の高い、信頼性の高い技術であり、その分子プロファイル22,33を研究する。LMDは、選択した単一細胞または多細胞構造のmRNA遺伝子発現プロファイルの解析を可能にする4,5。54LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的な知識を得るために利用することができる。腫瘍組織の処理の改善は、組織形態およびRNA品質6の最適な光学分解能を得るために必要である。パラホルムアルデヒド固定は形態学的解析に最適な選択肢ですが、これらの条件下でRNAの品質が影響を受けて分解されるため、RNA-seq解析のRNA品質が低下します。凍結組織切片の使用は、細胞膜を破壊し、細胞内に穴を生成する可能性のある氷の結晶形成を回避し、RNA-Seq分析7のための最良の選択肢であり続ける。
ここでは、LMD用の凍結マウス脳腫瘍組織を処理するための最適化されたセクション固定および染色方法について述べている。氷の結晶が組織に形成されるのを防ぐために、我々は30%スクロースの溶液をマウスに浸透させた。この溶液は、極性水分子間の相互作用を破壊し、氷の結晶の形成を防ぎ、組織形態を維持します。組織染色は、腫瘍内の細胞または解剖学的に異なる領域の特定の集団を分化し、得るために必要である。RNAの完全性を維持するために、無害な染料で組織を固定し、染色することが不可欠です。以前に示されているヘマトキシリン/エオシン(H&E)を用いた組織の染色は、RNAの完全性を低下させる 8.エタノール、クレシルバイオレット4%、エオシンY 0.5%溶液で目的の組織を固定し、染色しました。クレシルバイオレットは、細胞核を濃い青色で染色する酸性の色素です。エオシンYは、細胞の基本的な成分を染色する好塩基性染料であり、細胞質と他の細胞構造8との区別を提供する。どちらの色素もエタノールに溶け、RNAの品質を低下させない。組織の損傷を避け、細胞構造の高い光学解像度を維持するために、我々はLMD9の前に組織切片を取り付けた。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経膠腫の不均一性と侵略の根底にある分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的13を発見するために非常に重要である。本稿では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)に続いて、微小化解析を行い、それに続いて神経膠腫の不均質性と浸潤の分子景観を解析するための詳細かつ最適化された方法を説明する。
レーザー捕捉マイクロディショ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は国立衛生研究所(NIH/NINDS)助成金によってサポートされました:R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894からM.G.C.;(NIH/ニンズ)P.R.L.に R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311 を付与します。(NIH/NIBI): R01-EB022563;(NIH/NCI)U01CA224160;ミシガン大学ローゲルがんセンター、チャドタフ財団、リアのハッピーハーツ財団、M.G.C.とP.R.L.生物医学グラントF046166、M.G.C.国立衛生研究所、UL1 TR002240ミシガン臨床健康研究所(MICHR)、博士後期翻訳学者プログラム(PTSP) ミシガン大学フォーベがん研究所へのプロジェクトF049768、失明防止研究研究から医師科学者賞(RPB)、NIH(AK)のNEIからR01 EY022633を付与し、RPBから眼科と視覚科学科への無制限の助成金。本研究では、ビジョン研究コア(P30 EY007003)とがんセンター研究コア(P30 CA046592)を活用しました。AKは、A.アルフレッド・タウブマン医学研究所のウィリアム・デビッドソン夫人・エマージング・スカラー賞の支援を受けています。
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin – Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
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