Summary
激光微解剖（LMD）是一种敏感且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和入侵的途径。在这里，我们描述了一个优化的协议，使用激光LMD从胶质瘤组织中分离离散区域，然后进行转录分析。
Abstract
胶质瘤是主要脑肿瘤，其侵入性和异质性。特定组织模式，如伪皮质、微血管增殖、微转化和坏死等，是高档胶质瘤组织异质性的特征。我们的实验室已经证明，高密度的间质细胞，称为肿瘤流，与肿瘤恶性肿瘤相关。我们开发了一种独特的方法来理解胶质瘤生长和入侵的机制。在这里，我们描述了一个全面的协议，利用激光捕获微切切（LMD）和RNA测序来分析肿瘤内异质多细胞结构（即间质区或肿瘤入侵区域）的微分mRNA表达。该方法保持良好的组织组织学和RNA完整性。对灌注、冷冻、嵌入、切片和染色进行了优化，以保存形态，获得高质量的激光微解剖样品。结果表明，使用30%蔗糖灌注胶质瘤轴承小鼠提供了良好的形态和RNA质量。此外，染色肿瘤部分与4%克雷西尔紫罗兰和0.5%eosin导致良好的核和细胞染色，同时保持RNA的完整性。所述方法灵敏度高，可重复性高，可用于研究各种肿瘤模型中的肿瘤形态。总之，我们描述了一种完整的LMD执行方法，该方法保留了形态学和RNA质量，用于测序，以研究实体肿瘤中异构多细胞结构的分子特征。
Introduction
胶质瘤是中枢神经系统最具攻击性的原发性肿瘤。他们是高侵入性和异质1。肿瘤细胞和分子成分分析将揭示新的治疗靶点。
在目前可用的不同方法中，激光捕获冷冻脑肿瘤组织的微切解剖（LMD）是一种经济高效、可靠的技术，它允许从肿瘤组织分离离散解剖区域或特定细胞群来研究其分子轮廓22、3。3LMD允许分析所选单细胞或多细胞结构的mRNA基因表达特征44，5。5LMD 可用于获得关于肿瘤进展期间发生的分子事件的深入机械学知识。改善肿瘤组织处理是获得组织形态和RNA质量的最佳光学分辨率所必需的。虽然对甲醛固定是形态分析的最佳选择，但RNA质量在这些条件下会受到影响和降解，导致RNA-seq分析的RNA质量较差。使用冷冻组织部分可以避免冰晶的形成，从而破坏细胞膜，在细胞内产生孔洞，仍然是RNA-Seq分析7的最佳选择。
在这里，我们描述了一种优化的截面固定和染色方法，用于处理LMD的冷冻小鼠脑肿瘤组织。为了防止冰晶在组织中形成，我们给老鼠注入30%蔗糖的溶液。这种溶液会破坏极水分子之间的相互作用，防止冰晶的形成，从而保持组织形态。组织染色是区分和获得肿瘤内特定细胞群或解剖学上不同区域所必需的。用无害的染料固定和染色组织以保持RNA完整性至关重要。以前已经证明，染色组织与血氧素/欧辛（H&E）恶化RNA完整性8。我们用乙醇、克里尔紫罗兰4%和欧辛Y0.5%溶液固定和染色感兴趣的组织。克西尔紫罗兰是一种嗜酸性染料，用深蓝色染色细胞核。Eosin Y是一种嗜血性染料，染色细胞的基本成分，提供细胞质和其他细胞结构的区分8。两种染料都溶于乙醇，不会降低RNA质量。为了避免组织损伤并保持细胞结构的高光学分辨率，我们在LMD9之前安装了组织部分。
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Protocol
此处描述的所有使用实验动物的方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
注：由GEMM或稳定线产生的胶质瘤神经球可用于小鼠10的颅内肿瘤移植，并处理LMD和RNA测序。这些细胞构成表达萤火虫荧光酶和GFP蛋白，这些蛋白质将进一步用于肿瘤生长分析和定位。
1. 从基因工程胶质瘤模型衍生的神经球生成颅内小鼠胶质瘤模型
- 要从基因工程小鼠（GEMM）模型生成神经球细胞的主要培养，请使用前面描述的10，11。10,
- 准备神经球培养介质，如所述：500 mL的Dulbecco的改良鹰中F-12（DMEM/F12）辅以10 mL的50xB-27和5 mL的100xN-2神经元培养补充剂，5 mL的100x抗生素抗霉素，和1 mL的诺莫辛。在电镀神经球之前，在培养介质中加入20纳克/mL人类重组EGF和FGF。
- 在颅内肿瘤移植前2-3天，在37°C和5%CO2的组织培养培养培养培养培养神经球。
- 在手术当天，收集胶质瘤神经球，并在室温下以550 x g旋转5分钟。小心地去除上清液，而不会干扰细胞颗粒。
- 要分离神经球，将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的细胞分离溶液中，并在37°C和5%CO2孵育2-4分钟。潜伏期后，用1 mL微移液器上下移液神经球，以确保单个细胞悬浮液。
- 使用 10 mL 未补充的 DMEM/F12 介质稀释神经球悬浮液，使细胞分离溶液失去活性。在室温下，以550 x g旋转神经球5分钟。小心，取出上清液。
- 在 100 μL DMEM/F12 介质中重新悬浮细胞颗粒，无补充剂。对细胞悬浮液进行1：50稀释，然后加入50μL的Trypan Blue来计数可行的细胞。使用以下公式确定细胞的浓度：
单元格/mL = （（每平方计数的单元格） / = 计数的平方数 x 50 x 10，000 个单元格/mL] - 确定细胞计数后，要达到100 μL体积30，000细胞/μL的目标浓度，将神经球向下旋转，并在不含补充剂的DMEM/F12的适当体积中重新悬浮。
- 将神经球放在预先标记的 0.6 mL 管中，放在冰上。
- 在植入前准备麻醉、镇痛剂和麻醉逆转的工作解决方案：对于氯胺酮/dexmedetomide麻醉，加入0.6 mL的100mg/mL氯胺酮盐酸和0.8 mL 0.5mg/mL脱盐脱盐脱盐，无菌8.6mL0.9%NaCl含有通过。对于丁丙诺啡镇痛剂，加入1 mL 0.3毫克/mL丁丙诺啡到9 mL 0.9%含小瓶的NaCl。对于阿提帕美酮麻醉逆转，加入1 mL 5mg/mL阿提帕梅佐尔到9 mL的0.9%NaCl含有小瓶。
- 使用6-8周大的C57BL/6J雌性小鼠进行颅内肿瘤移植。
- 在获准进行啮齿动物生存手术的房间里，为颅内肿瘤移植设置无菌用品。在配备消毒的 10 μL Hamilton 注射器的啮齿动物立体器框架上进行手术，该注射器带有可拆卸的 33G 针头。利用珠子消毒器在手术之间消毒工具。
- 麻醉小鼠，注射步骤1.11制备的麻醉溶液的单次腹内（即p.）注射（氯胺酮：75.0毫克/千克和脱粒：0.5毫克/千克）。大约，250μL体积的麻醉溶液将交付给体重为20克的小鼠。
- 一旦小鼠处于深度麻醉状态，将无菌的汽油眼润滑剂涂抹在眼睛上，以防止干燥。把毛皮在老鼠的颅骨上去。在扫描区域涂抹 10% 的 povidone 碘局部溶液以进行消毒。
- 将鼠标的头骨固定在立体战术框架中。首先，用钳子小心地张开嘴，轻轻拉舌，并将其移到嘴的一侧，以防止窒息。用钳子保持嘴张，并将顶部切口放入立体战术框架上的齿杆锁孔中。
- 用耳朵握住鼠标头，将耳杆放在后轨道骨骼上并固定。确保小鼠的颅骨与手术桌面平和。小心地固定耳杆，不要对头骨施加压力。接下来，小心地固定鼻杆。
- 使用大小为 15 的手术刀刀片，沿小鼠头部切开，露出颅骨。使用科利布里收缩器收回切口部位的皮肤。使用无菌施用器去除所有颅内组织。
- 识别布雷格玛，将汉密尔顿注射器的针头直接放下。使用框架，将针前 1 mm 和 1.5 mm 横向放置。使用 26G 针，通过打分颅骨来标记此点。
- 使用配备 0.45 mm 钻头的无绳电源钻头在目标位置创建毛刺孔。钻，直到到达底层的杜拉母体。用 26G 针小心地提取毛刺孔中的剩余骨骼。
- 使用移液器，将细胞彻底均匀化，并将神经球悬浮液的7μL绘制到注射器中。为确保注射器正常工作，请将 1 μL 的悬浮液分配到 70% 酒精浸湿垫上。
- 将针头降至杜拉母体表面。降低注射器 3.5 mm 通风口，缩回 0.5 mm。这将在大脑中创造一个0.5毫米的空间，供注射时的神经球沉积。
- 将针头留在原位 2 分钟，以便进行压力平衡。在1分钟内缓慢而顺利地输送1μL的细胞。让细胞沉淀6分钟。在2分钟内缓慢而顺利地从大脑中取出注射器。
- 使用无菌盐水溶液，洗涤三次颅面。将注射器中的多余细胞分配到 70% 的酒精垫上，并用另外 70% 的酒精垫擦拭针头。用无菌PBS冲洗注射器，以避免针堵塞。
- 拆下缩回器并小心地将鼠标从立体战术框架中取出。使用 3-0 尼龙缝合线、钳子和针刀关闭切口。
- 施用阿提帕梅索（1.0毫克/千克），约100μL，用于20克小鼠。施用丁丙诺啡（0.1mg/kg皮下）皮下，约70 μL为20克小鼠。将手术后小鼠放入干净的恢复笼中，并监测它们，直到警觉和活跃。
2. 动物灌注和大脑保护
- 要监测肿瘤进展，使用体内成像系统确定体内生物发光，直到动物出现肿瘤负担迹象。当小鼠达到106至107光子/s之间的信号时，对它们进行安乐死。
- 麻醉小鼠，通过注射氯胺酮（75.0mg/kg）和脱胺（0.5毫克/千克）溶液，显示肿瘤负担迹象。向重量为 20 g 的鼠标提供约 250 μL。然后，确保鼠标在无响应踏板反射。
- 使用钳子，将皮肤保持在穿孔腔上方，并使用一对大解剖剪刀，通过穿透围锥壁、刺穿隔膜，然后切割肋骨笼，使"Y"切口变得"Y"切口。
- 在老鼠心脏的左心室插入一个钝20G的导管。然后剪下心脏的右中庭，以便进行切除。
- 允许含氧Tyrode的溶液（0.8%NaCl，0.0264%CaCl 2，0.005%NaH2PO4，0.1%葡萄糖，0.1%NaHCO3，0.02%KCl）流经小鼠循环系统，直到肝脏和肺部因抽血完全清除（±5分钟）。2
- 继续用30%的蔗糖溶液溶解在Tyrode溶液中，再用15分钟。要评估灌注的成功与否，确认颈部、尾部和腿部是刚性后30%蔗糖循环。
- 使用一把小剪断剪刀，在中线切开头皮。从骨骼开始，朝鼻突向前工作。这将暴露颅骨。
- 使用一对龙骨，从骨骼开始突破颅骨，然后继续向前完全暴露大脑的表面。然后把头向上转动，解剖大脑底部的神经，使其从颅骨中释放。
- 使用无RNase无水制备30%蔗糖溶液，并通过40μm尼龙网过滤器过滤，以减少RNA降解。
- 为了最大化蔗糖溶液的渗透，将解剖的大脑放入30%的蔗糖溶液中，并在4°C下储存过夜。在进一步处理之前，确保大脑到达含有蔗糖溶液的管子的底部。
3. 窝藏胶质瘤肿瘤的大脑冷冻保存
- 在冷冻保存大脑之前，准备一个装满冷苯丙胺/2-甲基丁烷的罐子，并将罐子放入一个装满液氮的容器中。让溶剂冷却。
- 从30%的蔗糖溶液中取出大脑，在滤纸上将其晒干。
- 用永久标记标记墓穴。小心地将大约 5 mL 的 OCT（最佳切割温度化合物）添加到低温中心，避免气泡。
- 将大脑放入含有OCT的低温中，以所需的方向。用 OCT 填充模具，直到大脑完全浸没。使用干净的钳子，快速将带有OCT的低温和大脑放入冷的opentane/2-甲基丁烷中。
- 一旦OCT凝固（+30-40s），用大脑取出低温，并将其放入干冰中。请勿将含有大脑的霉菌留在2-甲基丁烷超过2分钟，因为这可能导致固体OCT出现裂纹。
4. 分割冷冻脑肿瘤组织
- 标签 2 μm 聚乙烯石酸酯 （PEN） 滑动与样品信息。解剖后，组织部分将直接放置在这些幻灯片上。
- 将低温室的温度设置为 -20 至 -24 °C。切片前，将样品块放在低温室中，使其与腔室的温度平衡30-60分钟。
- 用 100% 乙醇清洁冷冻室和刀柄，并喷洒刷子以与 RNase 清洁溶液一起使用。在冷冻室内工作，取出模具，并将包含大脑的 OCT 块连接到带有 OCT 的低温试样盘上。将块放在盘架中，并将块与刀刃对齐。
- 将一次性刀片安装到切片支架中。
- 以10μm的厚度分割大脑。确保组织中没有条纹或划痕线。使用画笔，小心地将组织平展并解开切割表面。
- 小心地将包含大脑部分的组织安装到无 RNase 自由笔玻璃幻灯片上。将带正电荷的玻璃滑梯与手指朝组织方向翻转，然后平稳地将玻璃滑向组织部分。
注：手的温度将帮助组织附着在玻璃上。 - 将大脑部分安装到幻灯片上后，将幻灯片保存在冷冻室内的一个盒子里，然后以-80°C储存。切勿将幻灯片保持在室温下。
注：折叠组织，撕裂是常见的。为了进行准确的后分析，将这些人工制品最小化非常重要。
5. 冷冻保存的脑组织部分的固定和染色
- 为了保持RNA的完整性，清洁所有与RNase清洗溶液一起使用的仪器。继续在烟头内进行固定和染色协议。
- 在清洁的 RNase 自由 50 mL 管中准备描述的固定解决方案。在染色当天使用无 RNase 无水制作所有解决方案。
- 当天将进行激光微解剖，准备100%、95%、70%和50%乙醇溶液。将溶液保持在室温下紧闭的管中。
- 在75%乙醇溶液中制备4%的克西尔紫罗兰和0.5%的欧辛Y。大力涡旋溶液1分钟，并通过0.45μm尼龙过滤器过滤，以消除未溶解粉末的痕迹。
- 将组织滑轨放入装有95%乙醇的容器中，30s。将幻灯片保留 30 s。
- 将滑轨转移到 50% 乙醇，并把它们留在那里 25 s。此时，OCT 将被解散。将幻灯片转移到4%的克西尔紫罗兰溶液20s，然后转移到0.5%eosin Y溶液5s。
- 将滑块从染料溶液中拉出，用滤纸将滑片擦干。然后，将幻灯片放入50%乙醇中25s。将幻灯片转移到75%乙醇25s。将幻灯片转移到95%乙醇30s。将幻灯片转移到100%乙醇60s。
- 用二甲苯冲洗幻灯片。将它们转移到装有二甲苯的容器中，等待 3 分钟。
- 在无纳斯水中制备安装介质（例如，定点胶）。要安装小鼠脑部分，请将无RNase水中的安装介质以1：10的比例稀释。
- 在室温下干燥 10 s 的无 RNase 表面上的滑轨。在二甲苯干燥之前，继续用组织部分安装幻灯片。
- 使用无菌和无 RNase 薄画笔轻轻分散滑道上组织顶部的安装溶液。等待 10-20 s，然后立即将组织幻灯片转移到显微镜微切除平台。
注：用于安装的安装介质与无RNase水的比例因感兴趣的组织而异。安装介质/水比可保持胶质瘤组织形态，用于激光微解剖，而不影响RNA的完整性。
6. 激光捕获微解剖
注：需要利用激光捕获微切解剖显微镜对肿瘤组织内的特定感兴趣区域进行激光解剖。为了尽量减少组织激光微切解剖的时间，在固定和染色之前准备LMD显微镜。
- 要启动系统，请先打开电源条，然后打开激光。然后，打开显微镜控制器和计算机。启动 LMD 软件。
- 在显微镜控制下，选择10倍放大倍率。在激光控制下，设置组织解剖的激光参数。将激光频率设置为 120 Hz，以获得最佳切割效果。始终将激光电流设置为 100%。
- 要获得精确的激光微解剖，将速度设置为 10，光圈设置为 2.0-10.0 μm。将功率设置为 53。在较高设置处使用激光功率可能会导致玻璃蚀刻。
- 加载组织收集器，在解剖后捕获组织。单击第二个卸载按钮。拆下空收集器，并将含有 30 μL 的压网缓冲液的 0.5 mL PCR 扁平头管免费放入收集器中。将收集器放回机器，然后单击"继续"软件以继续操作。
- 将加工（固定和染色）试样加载到显微镜上。首先，单击LMD软件上的卸载。接下来，将样品安装在滑架上，并将滑块放在舞台上。单击"继续"软件以继续。
- 在"剪切形状"窗口下，选择"绘制 + 剪切"。使用显微镜控制装置查找感兴趣区域。绘制感兴趣区域 （ROI）并选择目标收集器管。可以同时绘制多个 RO 可从单个幻灯片中微缩解剖不同区域。
- 单击"开始切割"以进行组织微解剖。分割感兴趣区域后，从支架上拆下收集管，并将管放在干冰上。将采集的RNA组织样本转移到-80°C，用于长期储存。
7. 微解剖胶质瘤组织的RNA分离
- 对于从LMD提取RNA，请使用针对小样品和低RNA产量优化的RNA分离试剂盒（参见材料表）。按照制造说明操作。在室温 （25 °C） 下执行所有隔离步骤。为了保持RNA质量，工作迅速。按照制造商指示准备所有解决方案。
- 使用 1% β-甲醇的乳液缓冲液将样品体积调整到 350 μL。将样品涡旋为40s，以降低样品粘度，提高RNA洗脱自柱效率。
- 将整个样品转移到放置在 2 mL 收集管中的 gDNA 消除器旋转柱。将管子离心30 s，在8，000 x g。保存流，并确保离心后柱上没有液体。
- 在流道中加入350 μL的70%乙醇，并通过上下移液很好地混合。将样品转移到放置在 2 mL 收集管中的 RNA 洗脱旋转柱。轻轻关闭盖子，在 8，000 x g下将离心机 15 s。丢弃流通，保存列。
- 将700μL的RNA洗涤缓冲液1（20%乙醇，900 mM GITC，10 mM Tris-HCl pH 7.5）添加到RNA洗脱旋转柱。轻轻关闭盖子，在 8，000 x g下将离心机 15 s 清洗旋转柱膜。丢弃流通。
- 离心后，小心地从收集管中取出RNA洗脱旋转柱，使该柱不接触流通。
- 将第二RNA洗涤缓冲液（乙醇80%，NaCl 100 mM，Tris-HCl 10 mM pH 7.5）的500μL添加到自旋柱中。关闭柱盖，旋转 8，000 x g 20 s 以清洗柱膜。处置流式处理。
- 要清洗RNA洗脱柱，加入500μL的80%乙醇，关闭柱盖，在8000 x g下离心2分钟。
- 使用新的收集管，打开旋转柱的盖子，并在 8000 x g下打开离心机 5 分钟，使该柱干燥。丢弃洗脱管。
- 将RNA洗脱旋转柱放入新的 1.5 mL 收集管中。将12μL的无RNase水直接加入自旋柱膜的中心，在37°C下加热。等待4分钟，离心机全速1分钟，以分离RNA。
8. RNA质量控制、库制备和RNA-Seq分析
- 在RNA提取和纯化之后，放大RNA，并使用一种特殊试剂盒在制造商说明下用于在皮科-摩尔浓度下分离的RNA，并创建一个cDNA库（参见材料表）。按照制造商的说明操作。清洁工作站，以避免与其他PCR产品污染和样品的核酸酶降解。
- 如果RNA的RIN值大于4，这意味着RNA质量良好或仅部分降解，则继续分片步骤。准备冰上所有物品。
- 创建指示的主组合 （表 1）。在无核酸薄壁 0.2 mL PCR 管中创建反应混合物。在热盖热循环器中以94°C孵育管。碎片孵育时间取决于RNA的质量。RIN = 7： 4 分钟， RIN 5-6： 3 分钟， RIN 4-5： 2 分钟.
- 孵育后，将管子放在 PCR 冷水机组机架上，该机架以前在 -20°C 下冷却，然后让它坐 2 分钟。
- 对于RNA样本的每个管，制备第一股合成反应主混合物（表2）。在表3所述条件下，将管子孵育在热盖热循环器中。cDNA产品可以在-20°C下冷冻，直到两周，然后再继续下一步。
- 创建 PCR 主组合，如表 4所示。将管放入热盖热循环器中，并在表 5所示的设置下运行 PCR 反应。
- 让用于净化DNA的珠子温暖到室温。加热后，在每个样品中加入40μL的珠子。涡旋管混合和旋转短暂收集液体在管的底部。让管子在室温下孵育8分钟，让DNA与珠子结合。
- 将管子放在磁分离装置上，让坐约5分钟，或直到溶液完全清晰。将管子保持在分离装置上，使用移液器小心地去除上清剂，而不会干扰珠子。
- 将管留在分离装置上，在珠子上加入200μL的新鲜制造的80%乙醇，以洗涤，而不会干扰珠子。等待 30s，然后取出 80% 乙醇。重复此步骤。
- 短暂旋转管，并将管放回分离装置上。去除任何残留的80%乙醇，而不会干扰珠子。
- 让管在盖子打开 5 分钟后晾干。不要让它坐得更久，因为珠子会过干。
- 将管留在分离装置上，加入52 μL的无核酸水覆盖珠子。从分离装置上取管，上下移液器，直到所有珠子重新悬浮。在室温下5分钟孵育。
- 将管放回分离装置上，直到溶液变清，约1分钟。将产生的上清液的50μL转移到8口带的井中。在每个样品中加入 40 μL 的新珠子。涡旋彻底混合。让珠子在室温下孵育8分钟，使珠子与DNA结合。
- 在此孵育期间，开始解冻用于样品中任何rRNA的成分。解冻后，把它们放在冰上。此外，将热循环器预热至 72°C。
- 将样品放在磁分离设备上，直到溶液清除（约 5 分钟）。每个样品的探头为 1.5 μL，用于冷冻 PCR 管。将管子置于预热的热循环器中，在72°C的设置下，温度为2分钟和4°C。
- 将样品管保持在磁性分离装置中，用移液器去除上清液，而不会干扰珠子。然后加入200μL的新鲜制造的80%乙醇到珠子洗涤，而不会干扰珠子。等待 30s，然后取出 80% 的乙醇。重复此步骤。
- 短暂旋转管，并将管放回分离装置上。去除任何残留的80%乙醇，而不会干扰珠子。让管在盖子打开 2 分钟后晾干。不要让坐得更久，因为珠子会变干。
- 通过按显示的顺序组合以下组件，为所有样品准备主组合（表6）。
- 通过涡旋混合主混合物，并将混合物的 22 μL 添加到每个样品的干珠中，然后彻底混合以重新悬挂。让它在室温下孵育5分钟。
- 向下旋转管，并将其放在磁分离装置上 1 分钟或直到样品变清楚。将上清液的20μL转移，而不会干扰珠子到新的PCR管。在表 7中的设置下，将管置于预热的热循环器中。
- 准备 PCR 主组合，以便为每个样品提供足够的反应。将以下组件添加到指示的表 8中的主组合中。从步骤 8.20 到每个样品管中加入 PCR 主混合的 80 μL，并在以下设置下放入热循环器中（表 9）。
- 让用于净化DNA的珠子温暖到室温。加热后，在每个样品中加入 100 μL 的珠子。让管子在室温下孵育8分钟，让DNA与珠子结合。
- 将管子放在磁分离装置上，让坐约5分钟，或直到溶液完全清晰。
- 将管子保持在分离装置上，使用移液器小心地去除上清剂，而不会干扰珠子。
- 将管留在分离装置上，在珠子上加入200μL的新鲜制造的80%乙醇，以洗涤，而不会干扰珠子。等待 30s，然后取出 80% 乙醇。重复此步骤。
- 简单地说，向下旋转管，并将管放回分离装置上。去除任何残留的80%乙醇，而不会干扰珠子。
- 让管在盖子打开 5 分钟后晾干。不要让坐得更久，因为珠子会过干。移液器 20 μL 的三酯缓冲液到干燥的颗粒。从分离装置上取下管，并与移液器彻底混合，重新悬挂珠子。让它在室温下孵育5分钟。
- 将管放在分离装置上 2 分钟，或直到溶液变清晰。获取上清液并将其转移到新管中。然后在 -20°C 处存储收集的溶液。
- 检查质量和数量控制所需的最终库。根据制造商的建议协议，将样品（聚入和序列）池成成成端 50 nt 读取。
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Representative Results
我们的实验室使用睡美人转座系统（图1A）生成了一种基因工程小鼠模型（GemM）。该系统将特定的基因改变纳入新生儿小鼠神经祖细胞的基因组中。这些改变的后代细胞形成内源性胶质瘤肿瘤。用于产生肿瘤的质粒序列是：（1）pT2C-LucPGK-SB100X用于睡眠美人转子和; （2） pT2-NRASSV12 用于 NRAS 表达，（3） pT2-shp53-GFP4 用于 p53 击倒和 GFP 蛋白表达，（4） pT2-shATRx-GFP4 用于 ATRX 下击倒。质粒被注射到1天大新生儿的侧心室，如前所述的11。通过体内生物发光成像系统监测质粒吸收和肿瘤形成。一旦肿瘤小鼠表现出肿瘤负担的迹象，它们就会被牺牲。肿瘤要么用于产生神经球培养物，要么直接低温保存，用于LMD处理（图1A）。
从GEMM开始的细胞培养用于生成可翻译的胶质瘤模型（图1B）。从GEMM肿瘤中提取的胶质瘤神经球在颅内培养并植入免疫能力强小鼠的纹状体中。从神经球培养中获得的单细胞悬浮液，通过颅内植入产生胶质瘤肿瘤，如我们的实验室10、11、1211,12所述。10这种方法可以仔细量化每只小鼠（30，000个细胞/1 μL/小鼠）的细胞数量。该协议允许不同实验植入之间结果的可重复性。然而，植入神经球可能是产生小鼠胶质瘤肿瘤和随后的LMD和RNA-Seq分析的替代方案。然而，这种方法被认为更准确。肿瘤进展通过体内生物发光光谱成像系统进行监测。显示肿瘤负担迹象的小鼠被转卡渗透，大脑被冷冻保存，用于LMD处理（图1C）。
组织部分被激光微解剖，以表征胶质瘤内多细胞结构的转录。所述灌注、冷冻和嵌入程序经过优化，以保存组织形态，在激光微解剖后获得高质量的RNA。为了获得具有优异形态和RNA完整性的组织，对不同的灌注方法进行了评价（表10）。为了解剖感兴趣的区域，有必要用无害的染料来污渍组织，以产生RNA（图2）。我们观察到，用Tyrode溶液渗透肿瘤轴承小鼠5分钟，然后30%蔗糖15分钟，然后隔夜储存解剖大脑在30%蔗糖保存肿瘤组织的形态和RNA完整性（图3D）。灌注30%蔗糖溶液，防止组织内形成冰晶。虽然，甲醛组织固定导致高质量的组织形态，RNA完整性受到负面影响（图3B）。其他方法，如Tyrode的溶液5分钟或Tyrode的溶液5分钟+ 30%蔗糖溶液15分钟（图3AA和C）不影响RNA质量。在这种情况下，大脑不是一夜之间保存在30%蔗糖中;我们观察到组织形态的分辨率降低。
我们进行了各种染色技术，然后进行了RNA完整性质量控制分析。我们观察到，4%的克里西尔紫罗兰和0.5%的eosin Y染色足以识别胶质瘤多细胞结构并保持RNA完整性。克西尔紫罗兰是一种嗜酸性染料，用深蓝色染色细胞核。Eosin Y 是一种嗜血性染料，可染色细胞的基本成分。
我们观察到，如果组织没有安装安装介质，部分就脱水，形态恶化（图4A）。为了保持高质量的组织形态，我们用安装介质安装组织。我们观察到，溶解在水中的15%的安装介质（200μL水中30μL）保持了高质量的组织形态（图4B）。
在图5A中，显示了胶质瘤异质性区域。图像是在解剖前使用激光捕获微解剖显微镜获得的。红线描绘了具有丰富中皮细胞（长细胞）的区域。蓝线描绘没有间质细胞（圆形单元格）的区域（图5A，中间图像）。图5B显示了激光微解剖肿瘤区域（红线）和正常脑组织区域（蓝线）的图像。ROI 选择是为了剖析感兴趣的领域（图 5A和B，下图）。我们可以在这些图像中观察所选区域的解剖成功。
RNA 提取使用商业套件进行。确定 mRNA 提取和 cDNA 库准备后续RNA测序需要 2.5 x 106 - 7 x 106 μm2之间的解剖组织总面积。RNA质量控制在激光微切片后确定胶质瘤组织中的RIN在6至7之间。确定6的RIN适合cDNA库的制备。RNA提取后，利用一种用于皮莫拉浓度RNA分离的试剂盒，生成适合下一代测序的cDNA库。
| 0.25 纳克 - 10 纳克 （1-8 μL） 的RNA |
| 5x 第一链缓冲液的 4 μL |
| 1 μL 的奥利戈斯混合 V2 |
| 无核酸水最终体积为13μL |
表1：RNA质量控制和库制备：步骤8.3的主混合制备。
| 4.5 μL 混合 V2 |
| 0.5 μL RNase抑制剂 |
| 2 μL 反向转录酶 |
| 最终体积为 7 μL |
| 将7μL添加到RNA样品管中 |
表2：RNA质量控制和库制备：步骤8.5的主混合制备。
| 42 °C 90 分钟 |
| 70 °C 10 分钟 |
| 4 °C 保持 |
表3：RNA质量控制和库制备：步骤8.5的热循环器条件。
| 2 μL无核酸酶水 |
| 25 μL 2x PCR 缓冲器 |
| 每个反应1μLDNA聚合酶 |
| 轻轻混合，短暂旋转 |
| 将主混合的 28 μL 添加到每个样品管中 |
| 在每个管中加入每根5'和3'底漆的1 μL |
| 轻轻混合反应，短暂旋转 |
表4：RNA质量控制和库制备：步骤8.6的主混合制备。
| 1 个周期 |
| 94 °C 1分钟 |
| 5 个周期 |
| 98 °C 15 s |
| 55 °C 15 s |
| 68 °C 30 s |
| 1 个周期 |
| 68 °C 2 分钟，4 °C 保持 |
表5：RNA质量控制和库制备：步骤8.6的热循环器条件。
| 16.8 μL无核酸水 |
| 2.2 μL 10x R 缓冲器 |
| 1.5 μL R v2 |
| 1.5 μL R-探头 v2 |
表6：RNA质量控制和库制备：步骤8.18的主混合制备。
| 37 °C 60 分钟 |
| 72 °C 10分钟 |
| 4 °C 保持 |
表7：RNA质量控制和库制备：步骤8.20的热循环器条件。
| 26 μL 无核酸酶水 |
| 50 μL CB PCR 缓冲器 |
| 2 μL PCR2 引漆 v2 |
| 2 μL DNA聚合酶 |
表8：RNA质量控制和库制备：步骤8.21的主混合制备。
| 1 个周期 |
| 94 °C 1分钟 |
| X 周期 |
| 98 °C 15 s |
| 55 °C 15 s |
| 68 °C 30 s |
| 1 个周期 |
| 68 °C 2 分钟，4 °C 保持 |
表9：RNA质量控制和库制备：步骤8.21的热循环器条件。
| 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 3 | |
| 方法 1 | 泰罗德的15' | -- | -- |
| 方法 2 | 泰罗德的5' | 蔗糖 30% 15' | -- |
| 方法 3 | 泰罗德的5' | 4% PFA 10' | -- |
| 方法 4 | 泰罗德的5' | 30% 蔗糖 15' | 大脑在30%蔗糖过夜 |
表10：不同灌注方法的方法。
图1：用于激光微解剖的小鼠胶质瘤模型。（A） 睡美人 GEMM 用于开发脱毛胶质瘤。图像显示肿瘤进展：（i） 质粒注射到新生儿的侧心室，（ii） 肿瘤负担。（B） 利用胶质瘤细胞培养物生成可移植胶质瘤模型.从GEMM培养的神经球细胞在颅内植入纹状体。（C） 在灌注后，嵌入在日冕方向中的大脑的低温切片描述。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：用克雷西尔紫罗兰和Eosin染色低温保存组织部分的方法的原理图表示。用于染色的幻灯片使用用无 RNase 水清洁的工具进行处理。所有解决方案都准备了RNase/DNase自由水在染色当天。克雷西尔紫罗兰染色核紫罗兰和欧辛Y染色细胞质粉红色。染料溶解在70%乙醇中。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：比较各种灌注方法，以保持组织形态和RNA完整性。H&E图像代表在不同方法下灌注的脑组织的比较形态：（A）Tyrode溶液15分钟， （B） Tyrode 的溶液为 5 分钟，4% PFA 为 10 分钟，（C）Tyrode 的溶液为 5 分钟，30% 蔗糖溶液为 15 分钟，Tyrode的解决方案为 5 分钟，30% 蔗糖为 15 分钟，隔夜浸入 30% 蔗糖中。显示每种灌注方法的RNA质量评估。图描绘了 18 和 28s rRNA 峰值和初始标记峰。18 和 28s rRNA 的比率用于确定 RNA 质量。RNA片段的凝胶图像显示在地块的右侧。使用 RIN 值评估 RNA 质量。RNA质量在方法A，C和D是优越的方法C和D。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图 4：已安装和非安装胶质瘤组织的代表性图像。（A） 带有 H&E 污染的组织代表性图像。这种组织被未安装，变得脱水，显示不良的形态与在组织破裂。（B） 带有 H&E 染色并安装安装介质的组织代表性图像。请点击此处查看此图形的较大版本。
图5：用于激光微解剖的胶质瘤组织的代表性图像。（A-B）涂有H&E污染的组织代表性图像和为LMD选择的多细胞结构区域。（A） 在左侧，为 LMD 选择了拉长细胞（红色）和控制区域（蓝色）。（B） 右侧为 LMD 选定了集体入侵区域（红色）和控制区域（蓝色）。（C） 激光微解剖区域的代表性RNA质量控制。共6.5 x 106 μm2进行微解剖。分析表明RNA浓度为2，346皮克/μL和RNA完整性数（RIN）：6.8。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
了解胶质瘤异质性和入侵背后的分子机制对于揭示新的治疗目标13至关重要。在本手稿中，我们描述了一种详细而优化的方法，使用激光捕获微解剖 （LMD） 以及转录分析来分析胶质瘤异质性和入侵的分子图谱。
激光捕获微切切（LMD）可用于识别肿瘤内的不同区域或单个细胞，提供特定的样本，以进一步分析维持肿瘤空间背景的分子模式14。与分析实体肿瘤空间转录术的其他方法相比，该技术可靠且价格低廉。我们分析了使用LMD的转基因小鼠肿瘤模型或颅内植入模型中的胶质瘤异质性和入侵。这些模型重述了人类胶质瘤的显著特征，允许研究胶质瘤异质性和入侵10，12。10,
保持高质量的肿瘤组织形态和RNA完整性是LMD的局限性之一。为了改善组织形态，我们给小鼠注入Tyrode溶液5分钟，然后在同一溶液中溶解30%的蔗糖。一旦大脑被解剖，我们将其保存在30%的蔗糖中溶解在无RNase/DNase水中过夜，或直到大脑到达储存容器的底部。这些步骤显著改善了组织的形态，减少了在冷冻保存期间组织中冰晶的形成。虽然人类胶质瘤组织没有用于此方案，但一夜之间将人类样本孵育到30%的蔗糖溶液中可能是改善低温科形态的可行方法。LMD的另一个可能的限制是保存RNA完整性后染色8。虽然其他研究小组对胶质瘤组织进行了激光微切除，然后进行了RNA-seq分析，但他们没有说明任何RNA和/或形态学，也没有评论形态质量，或胶质瘤冷冻部分16的特定控制。在该协议中，精确的形态识别对于激光微解剖胶质瘤内精确的大细胞结构至关重要。我们观察到，用乙醇溶液固定胶质瘤组织，用4%的克里西尔紫罗兰和0.5%的eosin Y溶解在乙醇维持的RNA质量中，从而能够对单细胞和多细胞结构进行微观鉴定。我们证明，使用安装溶液安装胶质瘤部分是防止组织开裂和裂隙形成的关键步骤。请注意，安装介质需要在水中制备，因为使用溶解在乙醇中的安装介质会导致组织形态不良。激光微解剖必须在无RNasE环境中尽可能快地进行。我们还建议将肿瘤/组织总面积的截面高达2.5 x 106 μm2，以获得适当量的RNA，用于RNA质量控制和转录分析。
LMD 能够分析调节胶质质质质质和入侵的分子信号通路。这种分析可以揭示临床前胶质瘤模型诊断、预后和未来转化发展的新的潜在目标。
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Disclosures
本文的所有作者都声明不存在潜在的利益冲突。
Acknowledgments
工作得到了国家卫生研究院（NIH/NINDS）赠款的支持：R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894到M.G.C.;（NIH/NINDS）将 R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311 授予 P.R.L.;（NIH/NIBI）：R01-EB022563;（NIH/NCI）U01CA224160;密歇根大学罗格尔癌症中心神经外科系、查德·福基金会和Leah的快乐心基金会授予M.G.C.和P.R.L.RNA生物医学基金F046166，授予M.G.C.国家卫生研究院，UL1 TR002240，资助密歇根州临床与健康研究所（MICHR），博士后翻译学者计划（PTSP）资助， F049768项目授予密歇根大学福布斯癌症研究所，预防失明研究（RPB）颁发的医生-科学家奖，从NIHNEI（AK）获得R01 EY022633，以及RPB向眼科和视觉科学系提供的无限制赠款。本研究利用了视觉研究核心（P30 EY007003）和癌症中心研究核心（P30 CA046592）。AK得到阿尔弗雷德·陶布曼医学研究所的威廉·戴维森夫人新兴学者奖的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
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