Summary
الليزر المجهري (LMD) هو تقنية حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية التي يمكن استخدامها للكشف عن المسارات التي تتوسط عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. هنا، نحن نصف بروتوكول الأمثل لعزل المناطق المنفصلة من أنسجة الورم الدبقي باستخدام الليزر LMD تليها تحليل النسخ.
Abstract
الأورام الدبقية هي أورام الدماغ الأولية التي تتميز الغازية وعدم التجانس. أنماط النسيج محددة مثل pseudopalisades، وانتشار الأوعية الدموية الدقيقة، والتحول mesenchymal ونخر تميز عدم التجانس النسيجي من الأورام الدبقية عالية الجودة. وقد أثبت مختبرنا أن وجود كثافات عالية من الخلايا الميسنشيمال، واسمه oncostreams، يرتبط مع ورم خبيث. لقد طورنا نهجًا فريدًا لفهم الآليات التي يقوم عليها نمو الورم الدبقي وغزوه. هنا، نحن نصف بروتوكول شامل يستخدم الليزر التقاط microdissection (LMD) وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير mRNA التفاضلية من الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الورم (أي المناطق mesenchymal أو مناطق غزو الورم). تحافظ هذه الطريقة على أنسجة جيدة وسلامة الحمض النووي الريبي. تم تحسين التبرّق والتجميد والتضمين والأقسام وتلطيخ الخلايا للحفاظ على المورفولوجيا والحصول على عينات ميكرودية ليزر عالية الجودة. تشير النتائج إلى أن توبر الفئران التي تحمل الورم الدبقي باستخدام السكروز بنسبة 30٪ يوفر مورفولوجيا جيدة وجودة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي تلطيخ أقسام الورم مع 4٪ كريسيلي بنفسجي و0.5٪ من الإيوسين إلى تلطيخ نووي وخلوي جيد، مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الطريقة الموصوفة حساسة وقابلة للاستنساخ للغاية ويمكن استخدامها لدراسة مورفولوجيا الورم في نماذج الأورام المختلفة. باختصار، نحن نصف طريقة كاملة لأداء LMD التي تحافظ على مورفولوجيا وRNA الجودة لتسلسل لدراسة السمات الجزيئية للهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة داخل الأورام الصلبة.
Introduction
الأورام الدبقية هي الأورام الأولية الأكثر عدوانية في الجهاز العصبي المركزي. فهي شديدة التوغل وغير متجانسة1. تحليل المكونات الخلوية والجزيئية للورم سوف تكشف عن أهداف علاجية جديدة.
من بين الطرق المختلفة المتاحة حاليا، ليزر التقاط microdissection (LMD) من أنسجة ورم الدماغ المجمدة هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، موثوق بها التي تسمح لعزل المناطق التشريحية منفصلة أو مجموعات خلايا محددة من أنسجة الورم لدراسة ملفها الجزيئي2,,3. LMD يسمح بتحليل ملامح التعبير الجيني مرنا من خلايا واحدة مختارة أو هياكل متعددة الخلايا4,5. يمكن استخدام LMD لاكتساب معرفة ميكانيكية متعمقة حول الأحداث الجزيئية التي تحدث أثناء تطور الورم. تحسين في معالجة أنسجة الورم ضروري للحصول على الدقة البصرية المثلى لمورفولوجيا الأنسجة وRNA-الجودة6. على الرغم من أن تثبيت بارافورمالديهايد هو الخيار الأفضل للتحليل المورفولوجي ، تتأثر جودة الحمض النووي الريبي وتتدهور في ظل هذه الظروف ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الحمض النووي الريبي لتحليل RNA-seq. استخدام أقسام الأنسجة المجمدة يتجنب تكوين الكريستال الجليد، والتي يمكن أن تكسر أغشية الخلايا وتنتج ثقوب داخل الخلايا، ويبقى الخيار الأفضل لتحليل الحمض النووي الريبي-Seq7.
هنا، ونحن نصف تثبيت قسم الأمثل وطريقة تلطيخ لمعالجة الأنسجة المجمدة ورم الدماغ الماوس لLMD. لمنع بلورات الثلج من تشكيل في الأنسجة، ونحن perpering الفئران مع حل من السكروز 30٪. هذا الحل يعطل التفاعلات بين جزيئات الماء القطبي ويمنع تشكيل بلورات الجليد، والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. تلطيخ الأنسجة ضروري للتمييز والحصول على مجموعة محددة من الخلايا أو مناطق متميزة تشريحيا داخل الورم. من الضروري إصلاح ووصمة عار الأنسجة مع الأصباغ حميدة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. وقد ثبت سابقا أن تلطيخ الأنسجة مع الهيماتوكسيلين / إيوسين (H & E) يتدهور سلامة الحمض النووي الريبي8. قمنا بإصلاح وتلطيخ الأنسجة ذات الأهمية مع الإيثانول، كريسيلي البنفسجي 4٪ وإيوسين Y 0.5٪ حلول. كريسل البنفسجي هو صبغة حمضية تلطخ نواة الخلية بلون أزرق داكن. إيوسين Y هو صبغة بازوفيلية تلطخ المكونات الأساسية للخلايا ، مما يوفر التمييز بين السيتوبلازم والهياكل الخلوية الأخرى8. كلا الأصباغ قابلة للذوبان في الإيثانول ولا تتدهور نوعية الحمض النووي الريبي. لتجنب تلف الأنسجة والحفاظ على دقة بصرية عالية من الهياكل الخلوية ، قمنا بتركيب أقسام الأنسجة قبل LMD9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات (IACUC) التابعة لجامعة ميشيغان على جميع الطرق الموصوفة هنا التي تستخدم الحيوانات التجريبية.
ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا العصبية الدبقي المتولدة من خطوط GEMM أو مستقرة لتطعيم الورم داخل الجمجمة في الفئران10 ومعالجتها لتسلسل LMD وRNA. هذه الخلايا التعبير عن لوسيفراز اليراعات والبروتينات GFP، والتي سيتم استخدامها بشكل أكبر لتحليل نمو الورم وتوطين.
1- توليد نموذج الورم الدبقي للفأرة داخل الجمجمة من الصاصيات العصبية المستمدة من نماذج الورم الدبقي المعدلة وراثيا
- لتوليد الثقافة الأساسية لخلايا الغلاف العصبي من نموذج الماوس المعدلة وراثيا (GEMM) ، استخدم البروتوكول الموصوف سابقا10،11.
- إعداد الثقافة العصبية المتوسطة كما هو موضح: 500 مل من جلنسر تعديل دلبكو متوسط F-12 (DMEM/F12) تستكمل مع 10 مل من 50x B-27 و 5 مل من 100x N-2 مكملات الثقافة العصبية N-2, 5 مل من 100x مضاد للأحياء الحيوية, و 1 مل من نورموكين. قبل طلاء الاعصاب، إضافة 20 نانوغرام/ مل الإنسان المؤتلف EGF وFGF إلى وسط الثقافة.
- الخلايا العصبية للورم الدبقي في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2-3 أيام قبل تطعيم الورم داخل الجمجمة.
- في يوم الجراحة، قم بجمع الكريات العصبية الدبقية وتدور عند 550 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.
- لفصل الخلايا العصبية، إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من محلول مفرزة الخلية واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 2-4 دقيقة. بعد فترة الحضانة، ماصة الخلايا العصبية صعودا وهبوطا مع ميكروبيبيت 1 مل لضمان تعليق خلية واحدة.
- تعطيل حل مفرزة الخلية عن طريق تخفيف تعليق الغلاف العصبي مع 10 مل من الوسائط DMEM/F12 غير المكملة. تدور الاعصاب في 550 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعناية، وإزالة supernatant.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من الوسائط DMEM/F12 مع عدم وجود ملاحق. جعل 1:50 تخفيف تعليق الخلية، ومن ثم إضافة 50 ميكرولتر من تريبان الأزرق لحساب الخلايا القابلة للحياة. استخدم الصيغة التالية لتحديد تركيز الخلايا:
الخلايا / مل = [()خلايا محسوبة لكل مربع) / # من المربعات المحسوبة) × 50 × 10000 خلية / مل ] - بعد تحديد عدد الخلايا، لتحقيق تركيز الهدف من 30،000 خلية / ميكرولتر في حجم 100 μL، تدور الخلايا العصبية إلى أسفل وإعادة تعليقها في الحجم المناسب من DMEM/F12 لا تحتوي على ملاحق.
- ضع النّابة العصبية في أنبوب مُسمي مسبقًا على الجليد بـ 0.6 مل.
- إعداد حلول العمل من التخدير, مسكن, وعكس التخدير قبل الزرع: للتخدير الكيتامين/ ديكميديتومين, إضافة 0.6 مل من 100 ملغ/ مل الكيتامين هيدروكلوريد و 0.8 مل من 0.5 ملغ/مل ديكسميديتوميدين هيدروكلوريد إلى معقم 8.6 مل من 0.9% NaCl تحتوي على قارورة. لbuprenorphine مسكنة, إضافة 1 مل من 0.3 ملغ / مل buprenorphine إلى 9 مل من 0.9% NaCl تحتوي على قارورة. لعكس التخدير atipamezole, إضافة 1 مل من 5 ملغ / مل atipamezole إلى 9 مل من 0.9% NaCl تحتوي على قارورة.
- استخدام 6-8 أسابيع C57BL/6J الفئران الإناث لتطعيم الورم داخل الجمجمة.
- في غرفة معتمدة لجراحة بقاء القوارض ، قم بإعداد إمدادات معقمة لتطعيم الورم داخل الجمجمة. إجراء العمليات الجراحية على إطار ستيريوتاكلي القوارض مجهزة مع معقم 10 ميكرولتر هاملتون حقنة مع إبرة 33G قابلة للإزالة. استخدام معقم للقُسّم لتعقيم الأدوات بين العمليات الجراحية.
- تخدير الفئران بحقنة واحدة داخل البيريتنية (i.p.) من محلول التخدير الذي تم إعداده في الخطوة 1.11 (الكيتامين: 75.0 ملغ/كجم وديكسميديتوميمين:0.5 ملغم/كجم). تقريبا، سيتم تسليم حجم 250 ميكرولتر من محلول التخدير إلى الماوس وزنها 20 ز. تأكد من أن الماوس لا يستجيب لدواسة منعكس قبل المتابعة.
- مرة واحدة في الماوس هو في حالة من السَنَسالعميق، ضعي زيوت الزيوت المعقمة للعيون بالبنزين على العينين لمنع التجفيف. انزع يفر ّ ة على الجمجمة. تطبيق 10٪ محلول موضعي povidone-اليود إلى المنطقة الوحلة من أجل تطهير.
- تأمين جمجمة الماوس في إطار ستيريو. أولاً، افتحي الفم بعناية مع ملقط واسحبي اللسان بلطف وحركيها إلى جانب واحد من الفم لمنع الاختناق. إبقاء الفم مفتوحا مع ملقط ووضع القواطع أعلى في ثقب المفتاح من شريط الأسنان على إطار ستيريومية.
- عقد رأس الماوس من الأذنين، ووضع قضبان الأذن ضد العظام ما بعد المداري وتأمينها. تأكد من أن جمجمة الماوس هي مستوى مع الطاولة الجراحية. تأمين قضبان الأذن بعناية لا تمارس الضغط ضد الجمجمة. بعد ذلك، قم بتأمين شريط الأنف بعناية.
- باستخدام شفرة مشرط مقاس 15، قم بعمل شق على طول رأس الفأر، مما يعرض الجمجمة. تراجع الجلد في موقع شق باستخدام المناريس Colibri. استخدم مُستعمل معقم لإزالة جميع الأنسجة البيروكرانية.
- تحديد bregma وخفض إبرة حقنة هاملتون مباشرة أكثر من ذلك. باستخدام الإطار، ضع الإبرة 1 مم من البريقة و1.5 مم الجانبي. باستخدام إبرة 26G، ووضع علامة على هذه البقعة عن طريق تسجيل الجمجمة.
- استخدم مثقاب طاقة لاسلكي مجهز بجزء من حفر 0.45 مم لإنشاء ثقب في الموقع المستهدف. حفر حتى الوصول إلى ماتر دورا الكامنة. استخراج بعناية العظام المتبقية في ثقب البور مع إبرة 26G.
- باستخدام ماصة، تجانس الخلايا بدقة ووضع 7 ميكرولتر من تعليق الغلاف العصبي في الحقنة. للتأكد من أن هذه الحقنة تعمل بشكل صحيح، استغني عن 1 ميكرولتر من التعليق على وسادة غارقة في الكحول بنسبة 70٪.
- خفض الإبرة إلى سطح ماتر دورا. خفض الحقنة 3.5 مم البطني واسحب 0.5 ملم. وهذا سيخلق مساحة 0.5 ملم في الدماغ للكرة العصبية لإيداع عند حقنها.
- ترك الإبرة في مكان لمدة 2 دقيقة لتوازن الضغط. ببطء وسلاسة تسليم 1 μL من الخلايا على مدى 1 دقيقة. السماح للخلايا لتسوية لمدة 6 دقيقة. إزالة الحقنة ببطء وسلاسة من الدماغ على مدى 2 دقيقة.
- باستخدام محلول ملاخط معقم، اغسل سطح الجمجمة ثلاث مرات. الاستغناء عن الخلايا الزائدة في الحقنة على وسادة الكحول 70٪، ومسح إبرة نظيفة مع آخر 70٪ وسادة الكحول. شطف الحقنة مع PBS معقم لتجنب انسداد الإبرة.
- إزالة المنتقدين وبعناية أخذ الماوس من الإطار ستيريوتكتيكي. أغلق الشق باستخدام 3-0 خيوط النايلون، الملقط، وسائق إبرة.
- إدارة atipamezole (1.0 ملغ / كجم)، ما يقرب من 100 ميكرولتر لفأرة 20 غرام. إدارة البوبرينورفين (0.1mg/kg تحت الجلد) تحت الجلد، ما يقرب من 70 ميكرولتر لفأرة 20 غرام. ضع فئران ما بعد الجراحة في قفص تعافي نظيف وراقبها حتى تكون يقظة ونشطة.
2. توبر الحيوان والحفاظ على الدماغ
- لمراقبة تطور الورم، حدد في الإضاءة الحيوية باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي حتى تظهر على الحيوانات علامات عبء الورم. القتل الرحيم الفئران عندما تصل إلى إشارة بين 106 إلى 107 فوتون / ثان.
- تُسَدُّ الفئران بعلامات عبء الورم مع حقن الكيتامين (75.0 ملغ/كغ) ومحلول الدكستريديتوميدين (0.5 ملغم/كغ). تسليم ما يقرب من 250 ميكرولتر إلى فأر يزن 20 غرام. ثم تأكد من أن الماوس في عدم الاستجابة لدواسة منعكس.
- باستخدام ملقط، عقد الجلد فوق التجويف الجبقية، واستخدام زوج كبير من مقص تشريح جعل شق "Y" عن طريق اختراق الجدار الجبقية، ثقب الحجاب الحاجز، ومن ثم قطع القفص الصدري.
- أدخل قنية حادة 20G في البطين الأيسر من قلب الماوس. ثم قص الأذين الأيمن من القلب للسماح لexsanguination.
- السماح محلول تايرودي المؤكسج (0.8٪ NaCl، 0.0264٪ CaCl2،0.005٪ NaH2PO4، 0.1٪ الجلوكوز، 0.1٪ NaHCO3، 0.02٪ KCl) للتدفق عبر نظام الدورة الدموية للفأرة حتى يتم مسح الكبد والرئتين تمامًا بسبب إزالة الدم (~ 5 دقيقة).
- مواصلة التبرّح بالحيوان مع محلول السكروز 30% المذاب في محلول Tyrode لمدة 15 دقيقة إضافية. لتقييم نجاح التهوى، تأكد من أن الرقبة والذيل والساقين جامدة بعد 30٪ تداول السكروز.
- باستخدام زوج صغير من مقص تشريح، وقطع فروة الرأس في خط الوسط. بدءا من العظم القذالي والعمل إلى الأمام نحو خطم. هذا سيفضح الجمجمة
- باستخدام زوج من الحشود، واختراق الجمجمة بدءا من العظام القذالي والاستمرار إلى الأمام لفضح تماما أسطح الدماغ. ثم قم بتحويل جانب الرأس إلى الأعلى وتشريح الأعصاب في قاعدة الدماغ لإطلاقه من الجمجمة.
- قم بإعداد محلول السكروز بنسبة 30٪ باستخدام RNase مجانًا من المياه وتصفيته من خلال فلتر شبكة نايلون بسعة 40 ميكرومتر للحد من تدهور الحمض النووي الريبي.
- لتحقيق أقصى قدر من تسلل محلول السكروز ، ضع الأدمغة التشريحة في محلول السكروز بنسبة 30٪ وتخزينها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قبل مزيد من المعالجة ضمان أن الدماغ يصل إلى الجزء السفلي من الأنابيب التي تحتوي على محلول السكروز.
3. الحفظ بالتبريد للأدمغة التي تؤوي أورام الورم الدبقي
- قبل الحفاظ على الأدمغة، قم بإعداد جرة مليئة بإيزوبتان البارد/2-ميثيل بوتان ووضع الجرة في وعاء مليء بالنيتروجين السائل. اسمحوا المذيبات تهدئة.
- إزالة الدماغ من محلول السكروز 30٪ ولطخة يجف على ورقة مرشح.
- تسمية cryomold مع علامة دائمة. بعناية، إضافة ما يقرب من 5 مل من أكتوبر (مركب درجة حرارة القطع الأمثل) في وسط cryomold تجنب فقاعات الهواء.
- ضع الدماغ في cryomold التي تحتوي على OCT في الاتجاه المطلوب. ملء القالب مع أكتوبر حتى يتم غمر الدماغ تماما. باستخدام ملقط نظيفة، ووضع بسرعة cryomold مع أكتوبر والدماغ في isopentane الباردة/2-ميثيل بوتان.
- مرة واحدة في تماسك أكتوبر (~ 30-40 ق)، إزالة cryomold مع الدماغ ووضعه في الجليد الجاف. لا تترك القالب الذي يحتوي على الدماغ في 2-ميثيل بوتان الماضي 2 دقيقة لأن هذا قد يسبب الشقوق في أكتوبر الصلبة التفاف cryomold مع الدماغ في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -80 درجة مئوية.
4. قسمة أنسجة ورم الدماغ المجمدة
- تسمية 2 ميكرون بولي إيثيلين النفتالات (PEN) الشرائح مع معلومات العينة. سيتم وضع أقسام الأنسجة مباشرة على هذه الشرائح التالية المقطع.
- تعيين درجة حرارة غرفة cryostat بين -20 إلى -24 درجة مئوية. قبل المقطع، ضع كتلة العينة في غرفة cryostat واجعلها توازن لدرجة الحرارة في الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- تنظيف غرفة cryostat وحامل السكين مع الإيثانول 100٪ ورذاذ فرش لاستخدامها مع محلول تنظيف RNase. العمل داخل غرفة cryostat، وإزالة القالب وإرفاق كتلة أكتوبر التي تحتوي على الدماغ إلى قرص عينة cryostat مع أكتوبر. ضع كتلة في حامل القرص ومحاذاة كتلة مع شفرة سكين.
- تثبيت شفرة المتاح في حامل المقطع.
- قسم الدماغ في سمك 10 ميكرون. تأكد من عدم وجود خطوط أو خطوط خدش في الأنسجة. باستخدام فرشاة الطلاء، تتسطح بحذر وفك الأنسجة على سطح القطع.
- قم بتركيب الأنسجة التي تحتوي على أقسام الدماغ بعناية على شرائح زجاج PEN الحرة RNase. قم بقلب الشرائح الزجاجية المشحونة الإيجابية بالأصابع في اتجاه الأنسجة واضغط بسلاسة على الشريحة الزجاجية باتجاه قسم الأنسجة.
ملاحظة: درجة حرارة اليدين سوف تساعد الأنسجة نعلق على الزجاج. - بعد تركيب أقسام الدماغ على الشرائح ، احتفظ بالشرائح في صندوق داخل غرفة cryostat ثم قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية. لا تحتفظ بالشرائح في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: طي الأنسجة، وتمزيق شائعة. وللتحليل الخلفي الدقيق، من المهم التقليل إلى أدنى حد من هذه القطع الأثرية.
5. تثبيت وتلطيخ أقسام أنسجة الدماغ cryopreserved
- للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، قم بتنظيف جميع الأدوات لاستخدامها مع محلول تنظيف RNase. المضي قدما في التثبيت وتلطيخ البروتوكول داخل غطاء الدخان.
- إعداد الحلول المثبت الموصوفة في أنابيب RNase الحرة 50 مل نظيفة. جعل جميع الحلول مع المياه مجانا RNase في يوم تلطيخ.
- في نفس اليوم سيتم إجراء الميكروديز القسم بالليزر، وإعداد 100٪، 95٪، 70٪ و 50٪ حلول الإيثانول. الحفاظ على الحلول في أنابيب مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 4٪ كريسيلي البنفسجي و 0.5٪ إيوسين Y في 75٪ حل الإيثانول. دوامة الحل بقوة لمدة 1 دقيقة وتصفيتها من خلال مرشح النايلون 0.45 ميكرون للقضاء على آثار مسحوق غير مذاب.
- وضع شرائح الأنسجة في وعاء مع الإيثانول 95٪ لمدة 30 s. نقل الشرائح إلى أنبوب يحتوي على 75٪ الإيثانول؛ ترك الشرائح هناك لمدة 30 s.
- نقل الشرائح إلى 50٪ الإيثانول وتركها هناك لمدة 25 ق. عند هذه النقطة، سيتم حل أكتوبر. نقل الشريحة إلى 4٪ محلول كريمل البنفسجي لمدة 20 s، ومن ثم نقل إلى 0.5٪ محلول eosin Y لمدة 5 s.
- اتخاذ الشريحة من محلول صبغ ولطخة الشريحة الجافة مع ورقة مرشح. ثم ضع الشرائح في الإيثانول بنسبة 50٪ لمدة 25 ق. نقل الشرائح إلى 75٪ الإيثانول لمدة 25 ق. نقل الشرائح إلى 95٪ الإيثانول لمدة 30 ق. نقل الشرائح إلى الإيثانول 100٪ لمدة 60 ق.
- شطف الشريحة مع الزيلين. نقلها إلى حاوية مع الزلين والانتظار 3 دقيقة.
- إعداد المتوسطة تصاعد (على سبيل المثال، تحديد العلكة) في المياه الخالية من RNase. لتركيب أقسام الدماغ الماوس، تمييع المتوسطة المتصاعدة في المياه الخالية من RNase بنسبة 1:10.
- تجفيف الشرائح على سطح خالية من RNase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 s. قبل أن يجف الزيلين، انتقل إلى تركيب الشرائح مع أقسام الأنسجة.
- تفريق بلطف حل تصاعد على رأس الأنسجة على الشريحة مع فرشاة طلاء رقيقة معقمة وخالية من RNase. انتظر 10-20 ق، ثم نقل على الفور شرائح الأنسجة إلى منصة المجهر microdissection.
ملاحظة: تختلف نسبة المياه المتوسطة المتصاعدة إلى المياه الخالية من RNase المستخدمة في التركيب وفقًا للأنسجة ذات الأهمية. تحافظ نسبة التركيب المتوسطة/المائية على مورفولوجيا أنسجة الورم الدبقي للميكروديليسب بالليزر دون التأثير على سلامة الحمض النووي الريبي.
6. ليزر التقاط microdissection
ملاحظة: يجب استخدام مجهر الميكروديزالقسم بالليزر لميكرويليج الليزر مناطق محددة ذات أهمية داخل أنسجة الورم. لتقليل وقت تشريح الليزر النسيجي، أعد مجهر LMD قبل التثبيت وتلطيخه.
- لبدء تشغيل النظام، قم أولاً بتشغيل شريط الطاقة، متبوعاً بتشغيل الليزر. ثم قم بتشغيل وحدة تحكم المجهر والكمبيوتر. بدء تشغيل برنامج LMD.
- تحت سيطرة المجهر،حدد التكبير 10x. تحت التحكم بالليزر،تعيين معلمات الليزر لتشريح الأنسجة. تعيين تردد ليزر من 120 هرتز للحصول على أفضل نتائج القطع. تعيين دائما تيار الليزر إلى 100٪.
- للحصول على ميكروديس مقطع دقيق بالليزر، قم بتعيين السرعة عند 10 وإعداد الفتحة عند 2.0-10.0 ميكرومتر. قم بتعيين الطاقة إلى 53. قد يؤدي وجود طاقة الليزر في إعداد أعلى إلى نقش الزجاج.
- تحميل جامع الأنسجة التي من شأنها التقاط الأنسجة التالية تشريح. انقر فوق زر إلغاء التحميل الثاني. إزالة جامع فارغة ووضع DNase / RNase مجانا 0.5 مل PCR أنابيب الرأس المسطحة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت lysis في جامع. ضع جامع مرة أخرى في الجهاز وانقر على متابعة البرنامج للمتابعة.
- تحميل العينة المعالجة (الثابتة والملطخة) على المجهر. أولاً، انقر فوق إلغاء تحميل برنامج LMD. بعد ذلك، قم بتحميل العينة على حامل الشريحة ووضع حامل الشريحة على المسرح. انقر على متابعة البرنامج للمتابعة.
- ضمن قص النوافذ الأشكال، حدد رسم + قص. استخدام ضوابط المجهر للعثور على منطقة الاهتمام. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وحدد أنبوب جامع الوجهة. من الممكن رسم إصدارات مختلفة متعددة لتشريح مناطق مختلفة من شريحة واحدة في نفس الوقت.
- انقر فوق ابدأ قطع للمتابعة إلى تشريح الأنسجة الجزئية. بعد أقسام المناطق ذات الاهتمام إزالة أنابيب جامع من حامل ووضع الأنابيب على الجليد الجاف. نقل عينات أنسجة الحمض النووي الريبي التي تم جمعها إلى -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
7. عزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة الدبقي ة تشريح هامة
- لاستخراج الحمض النووي الريبي من LMD استخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الأمثل لعينات صغيرة وانخفاض العائد الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات التصنيع. تنفيذ جميع خطوات العزل في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي، والعمل بسرعة. إعداد جميع الحلول كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
- ضبط حجم العينة إلى 350 ميكرولتر مع المخزن المؤقت الليسيس مع 1٪ α-mercaptoethanol. دوامة العينة لمدة 40 s من أجل تقليل لزوجة العينة وزيادة RNA elution دوران العمود كفاءة.
- نقل كامل العينة إلى عمود دوران gDNA المزيل وضعت في أنبوب جمع 2 مل. طرد مركزي أنبوب لمدة 30 s في 8000 × ز. حفظ التدفق من خلال وتأكد من عدم ترك أي سائل على العمود بعد الطرد المركزي.
- أضف 350 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى التدفق من خلال واخلط جيدًا عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل. نقل العينة، إلى عمود تدور اليوتون RNA وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء بلطف، والطرد المركزي لـ 15 s عند 8000 × ز. تجاهل التدفق من خلال حفظ العمود.
- أضف 700 ميكرولتر من مخزن الغسيل الحمض النووي الريبي 1 (20٪ إيثانول، 900 متر جيتك، 10 mM Tris-HCl pH 7.5) إلى عمود دوران الليوتين RNA. أغلق الغطاء بلطف، وطارد المركز المركزي لمدة 15 s عند 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال.
- بعد الطرد المركزي، قم بإزالة عمود دوران الروتيون من أنبوب التجميع بعناية بحيث لا يتصل العمود بالتدفق.
- أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثاني لغسل الحمض النووي الريبي (الإيثانول 80٪، NaCl 100 mM، Tris-HCl 10 mM pH 7.5) إلى عمود الدوران. أغلق غطاء العمود وتدور 8000 × ز لمدة 20 s لغسل غشاء العمود. تخلص من التدفق من خلال.
- لغسل عمود ELUTION RNA، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪، وأغلق غطاء العمود والطرد المركزي عند 8000 × ز لمدة دقيقتين. ارمي الأنابيب بمحلول elution.
- استخدم أنبوب تجميع جديد، وافتح غطاء عمود الدوران والطرد المركزي عند 8000 × ز لمدة 5 دقيقة لتجفيف العمود. تخلص من أنبوب اليويون.
- ضع عمود دوران اليوتون في أنبوب جمع جديد بـ 1.5 مل. أضف 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase الذي يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية مباشرة إلى مركز غشاء العمود الدوراني. انتظر 4 دقيقة والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة لelute RNA.
8. الحمض النووي الريبي مراقبة الجودة، وإعداد المكتبة وتحليل RNA-Seq
- بعد استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية، تضخيم الحمض النووي الريبي وإنشاء مكتبة cDNA باستخدام مجموعة خاصة مناسبة لعزل الحمض النووي الريبي في تركيزات بيكو المولي اتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات الشركة المصنعة. محطة عمل نظيفة من أجل تجنب التلوث مع غيرها من منتجات PCR وتدهور nuclease من العينات.
- إذا كان الحمض النووي الريبي لديه قيمة RIN أكبر من 4، وهذا يعني الحمض النووي الريبي هو من نوعية جيدة أو المتدهورة جزئيا فقط، والمضي قدما في خطوة التجزئة. إعداد جميع العناصر على الجليد.
- إنشاء مزيج رئيسي كما هو مبين(الجدول 1). إنشاء خليط رد فعل في أنبوب ثنائي الجدران رقيقة خالية من nuclease 0.2 مل PCR. احتضان الأنابيب في 94 درجة مئوية في الدراجات الحرارية الساخنة الغطاء. يعتمد وقت الاحتضان التجزئة على جودة الحمض النووي الريبي. RIN ≥ 7: 4 دقيقة، RIN 5-6: 3 دقيقة، RIN 4-5: 2 دقيقة.
- بعد الحضانة، ضع الأنابيب على رف مبرد PCR الذي تم تبريده مسبقًا عند -20 درجة مئوية واتركه على الجلوس لمدة دقيقتين.
- لكل أنبوب من عينة الحمض النووي الريبي، وإعداد أول حبلا توليف التفاعل الرئيسي مزيج(الجدول 2). احتضان الأنابيب في الدراجات الحرارية ذات الغطاء الساخن في ظل الظروف الموضحة في الجدول 3. يمكن تجميد منتجات cDNA عند -20 درجة مئوية حتى لمدة أسبوعين قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- إنشاء المزيج الرئيسي PCR كما هو مبين في الجدول 4. ضع الأنابيب في دورة حرارية للغطاء الساخن واركض رد فعل PCR تحت الإعدادات المشار لها في الجدول 5.
- السماح للحبات، والتي سيتم استخدامها لتنقية الحمض النووي، لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة تدفأ، إضافة 40 ميكرولتر من الخرز إلى كل عينة. دوامة أنابيب لخلط وتدور لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. السماح للأنابيب احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقيقة للسماح للحمض النووي لربط الخرز.
- ضع الأنابيب على جهاز فصل مغناطيسي واترك الجلوس لمدة 5 دقيقة ، أو حتى يصبح الحل واضحًا تمامًا. حفظ الأنابيب على جهاز الفصل، واستخدام ماصة لإزالة supernatant بعناية دون إزعاج الخرز.
- حفظ الأنابيب على جهاز الفصل، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج ة 80٪ إلى الخرز لغسل دون إزعاج الخرز. انتظر 30 ق قبل إزالة الإيثانول 80٪. كرر هذه الخطوة.
- تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب ووضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز الفصل. إزالة أي الإيثانول المتبقية 80٪ دون إزعاج الخرز.
- دع الأنابيب تجف مع القبعات مفتوحة لمدة 5 دقيقة. لا تدع الجلوس لفترة أطول كما سوف الخرز أكثر من الجافة.
- حفظ الأنابيب على جهاز الفصل، إضافة 52 ميكرولتر من المياه خالية من nuclease لتغطية الخرز. إزالة الأنابيب من جهاز الفصل وpipette صعودا وهبوطا حتى يتم إعادة تعليق جميع الخرز. احتضان في 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز الفصل حتى يصبح الحل واضحًا ، حوالي 1 دقيقة. نقل 50 ميكرولتر من supernatant الناتجة إلى آبار شريط 8 بئر. إضافة 40 ميكرولتر من الخرز الجديد إلى كل عينة. دوامة جيدا لخلط. السماح للحبات لربط الحمض النووي عن طريق احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقيقة.
- خلال فترة الحضانة هذه ، ابدأ في إذابة المكونات التي سيتم استخدامها لأي rRNA موجودة في العينات. بمجرد إذابتها، ضعها على الجليد. أيضا، ما قبل تسخين الدراجات الحرارية إلى 72 درجة مئوية.
- ضع العينات على جهاز الفصل المغناطيسي حتى يتم مسح الحل (حوالي 5 دقيقة). Aliquot 1.5 μL من المسابير لكل عينة إلى أنبوب PCR المبردة. ضع الأنبوب في الدورة الحرارية المحمّسة مسبقاً تحت إعدادات 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين و4 درجات مئوية.
- حفظ أنابيب العينة في جهاز الفصل المغناطيسي، وإزالة supernatant مع pipet دون إزعاج الخرز. ثم إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج 80٪ إلى الخرز لغسل دون إزعاج الخرز. انتظر 30 ق قبل إزالة الإيثانول 80٪. كرر هذه الخطوة.
- تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب ووضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز الفصل. إزالة أي الإيثانول المتبقية 80٪ دون إزعاج الخرز. دع الأنابيب تجف مع القبعات مفتوحة لمدة 2 دقيقة. لا تدع الجلوس لفترة أطول كما سوف الخرز أكثر من الجافة.
- إعداد مزيج رئيسي لجميع العينات من خلال الجمع بين المكونات التالية بالترتيب المعروض(الجدول 6).
- مزيج المزيج الرئيسي عن طريق الدوامة وإضافة 22 ميكرولتر من المزيج إلى الخرز المجفف من كل عينة وتخلط جيدا لإعادة تعليق. السماح لها احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة.
- تدور أسفل الأنابيب ووضعها على جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة أو حتى تصبح العينات واضحة. نقل 20 ميكرولتر من supernatant، دون إزعاج الخرز إلى أنابيب PCR جديدة. ضع الأنابيب في دورة حرارية مُسخّنة مسبقًا تحت إعدادات الجدول 7.
- إعداد مزيج رئيسي PCR لما يكفي لردود الفعل لكل عينة. إضافة المكونات التالية إلى المزيج الرئيسي في الجدول المشار إليه 8. أضف 80 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لـ PCR إلى كل من أنابيب العينة من الخطوة 8.20 ووضعها في cycler الحراري في الإعدادات التالية(الجدول 9).
- السماح الخرز، والتي سيتم استخدامها لتنقية الحمض النووي، لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة تدفأ، إضافة 100 ميكرولتر من الخرز إلى كل عينة. السماح للأنابيب احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقيقة للسماح للحمض النووي لربط الخرز.
- ضع الأنابيب على جهاز فصل مغناطيسي واترك الجلوس لمدة 5 دقيقة ، أو حتى يصبح الحل واضحًا تمامًا.
- حفظ الأنابيب على جهاز الفصل، واستخدام ماصة لإزالة supernatant بعناية دون إزعاج الخرز.
- حفظ الأنابيب على جهاز الفصل، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج ة 80٪ إلى الخرز لغسل دون إزعاج الخرز. انتظر 30 ق قبل إزالة الإيثانول 80٪. كرر هذه الخطوة.
- لفترة وجيزة، تدور أسفل الأنابيب ووضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز الفصل. إزالة أي الإيثانول المتبقية 80٪ دون إزعاج الخرز.
- دع الأنابيب تجف مع القبعات مفتوحة لمدة 5 دقيقة. لا تدع الجلوس لفترة أطول كما سوف الخرز overdry. مابيت 20 ميكرولتر من تريس عازلة إلى بيليه المجففة. إزالة أنبوب من جهاز الفصل وتخلط جيدا مع أنبوب لإعادة تعليق الخرز. السماح لها احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة.
- ضع الأنابيب على جهاز الفصل لمدة دقيقتين، أو حتى يصبح الحل واضحًا. الحصول على supernatant ونقله إلى أنابيب جديدة. ثم تخزين الحل الذي تم جمعه في -20 درجة مئوية.
- تحقق من المكتبات النهائية تحتاج إلى مراقبة الجودة والكمية. قم بتجميع العينات، المجمعة والتسلسل، كما يقرأ 50 nt المقترن نهاية، وفقا ً للبروتوكولات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد ولدت مختبرنا نماذج الماوس المهندسة وراثيا (GEMMs) باستخدام نظام transposase الجمال النائم(الشكل 1A). يتضمن هذا النظام تعديلات وراثية محددة في جينوم الخلايا السلف العصبي في الفئران الوليدية. تشكل هذه الخلايا السلف المعدلة أورام الورم الدبقي الذاتي. وكانت تسلسل Plasmid المستخدمة لتوليد الأورام: (1) pT2C-LucPGK-SB100X للجمال النائم transposon & تعبير luciferase، (2) pT2-NRASSV12 للتعبير NRAS، (3) pT2-shp53-GFP4 لp53 ضرب أسفل والتعبير البروتين GFP، و (4) pT2-shATRx-GFP4 لATRX ضرب أسفل. تم حقن البلازميدات في البطين الجانبي من الجراء الوليدية القديمة لمدة يوم واحد كما هو موضح سابقا11. تم رصد تناول البلازميد وتشكيل الورم عن طريق نظام تصوير الإضاءة الحيوية في الجسم الحي. مرة واحدة الفئران تحمل الورم أظهرت علامات عبء الورم، تم التضحية بهم. تم استخدام الأورام إما لتوليد ثقافات الغلاف العصبي أو محمية بالتبريد مباشرة لمعالجة LMD(الشكل 1A).
تم استخدام ثقافات الخلية التي بدأت من GEMM لتوليد نموذج الورم الدبقي القابل للترجمة(الشكل 1B). تم استزراع الصاجين العصبية الدبقي المستمدة من أورام GEMM وزرعها داخل الجمجمة في مخطط الفئران المختصة بالمناعة. تم استخدام تعليق الخلية الواحدة التي تم الحصول عليها من ثقافة الخلايا العصبية لتوليد أورام الورم الدبقي عن طريق الزرع داخل الجمجمة كما هو موضح من قبل مختبرنا10،11،12. تسمح هذه المنهجية بالقياس الكمي الدقيق لعدد الخلايا التي سيتم زرعها لكل فأر (30,000 خلية/1 ميكرولتر/فأر). يسمح هذا البروتوكول باستنساخ النتائج بين عمليات الزرع التجريبية المختلفة. ومع ذلك، يمكن أن يكون زرع الاعصاب خيارا بديلا لتوليد أورام الدبقي الماوس وLMD لاحقة وتحليل RNA-Seq. ومع ذلك، تعتبر هذه الطريقة أكثر دقة. تم رصد تطور الورم من قبل في الجسم الحي الإضاءة العضوية نظام تصوير الطيف. الفئران التي تظهر علامات عبء الورم كانت متدلّية بشكل عابر والدماغ كان بالتبريد المحفوظة لمعالجة LMD(الشكل 1C).
تم تحليل أجزاء الأنسجة بالليزر لتوصيف النسخ من الهياكل متعددة الخلايا داخل الأورام الدبقية. تم تحسين إجراءات التبرّق والتجميد والتضمين الموصوفة للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة والحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة بعد استئصال الدقيق بالليزر. تم تقييم طرق التَّوبر المختلفة من أجل اكتساب الأنسجة ذات المورفولوجيا المتفوقة وسلامة الحمض النووي الريبي(الجدول 10). لتشريح المناطق ذات الاهتمام ، كان من الضروري تلطيخ الأنسجة بأصباغ غير ضارة للرنا(الشكل 2). لاحظنا أن تقبير الورم مع المحلول التيرودي لمدة 5 دقيقة، ثم 30٪ السكروز لمدة 15 دقيقة، تليها التخزين بين عشية وضحاها من الدماغ تشريح في 30٪ السكروز يحافظ على مورفولوجيا والحمض النووي الريبي سلامة أنسجة الورم(الشكل 3D). التروية مع محلول السكروز 30٪ منع تكوين الجليد الكريستال داخل الأنسجة. على الرغم من أن تثبيت أنسجة بارافورمايدهايد أدى إلى مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة ، تأثرت سلامة الحمض النووي الريبي سلبًا(الشكل 3B). لم تؤثر طرق أخرى مثل حل Tyrode لمدة 5 دقيقة أو حل Tyrode لـ 5 دقيقة + 30٪ من محلول السكروز لمدة 15 دقيقة(الشكل 3A و C)على جودة الحمض النووي الريبي. في ظل هذه الظروف، لم يتم الحفاظ على العقول في 30٪ السكروز بين عشية وضحاها. لاحظنا انخفاض القرار في مورفولوجيا الأنسجة.
قمنا بتنفيذ تقنيات تلطيخ مختلفة تليها تحليل مراقبة الجودة نزاهة الحمض النووي الريبي. لاحظنا أن 4٪ كريسيلي البنفسجي و 0.5٪ إيوسين Y تلطيخ كان كافيا لتحديد الهياكل متعددة الخلايا الدبقي والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. كريسل البنفسجي هو صبغة حمضية تلطخ نواة الخلايا بلون أزرق داكن. إيوسين Y هو صبغة بازوفيلية تلطخ المكونات الأساسية للخلايا.
لاحظنا أنه إذا لم يتم تركيب الأنسجة مع المتوسطة المتصاعدة ، أصبحت المقاطع المجففة وتدهور المورفولوجيا(الشكل 4A). للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة ، قمنا بتركيب الأنسجة مع المتوسط المتصاعد. لاحظنا أن 15٪ تصاعد المتوسطة الذائبة في الماء (30 ميكرولتر في 200 ميكرولتر من الماء) حافظت على مورفولوجيا الأنسجة عالية الجودة(الشكل 4B).
في الشكل 5A، تظهر مناطق عدم تجانس الورم الدبقي. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مجهر التقاط الليزر المجهري قبل تشريح. الخطوط الحمراء تصور المناطق مع خلايا mesenchymal وفيرة (خلايا ممدود). الخطوط الزرقاء تصور المناطق التي لا تحتوي على خلايا mesenchymal (الخلايا المستديرة)(الشكل 5A، الصورة الوسطى). يُظهر الشكل 5B صورًا لمناطق الورم المصغرة بالليزر (الخطوط الحمراء) ومناطق أنسجة الدماغ الطبيعية (الخطوط الزرقاء). يتم اختيار عائد الاستثمار لتشريح مجالات الاهتمام(الشكل 5A و B، صور أقل). يمكننا أن نلاحظ في هذه الصور النجاح في تشريح المناطق المختارة.
تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تجارية. وتقرر أن هناك حاجة إلى مساحة إجمالية من الأنسجة التشريحة بين 2.5 × 106 - 7 × 106 ميكرومتر2 لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحضير مكتبة cDNA لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق. حددت مراقبة جودة الحمض النووي الريبي RIN بين 6 إلى 7 في أنسجة الورم الدبقي بعد المجهر بالليزر. وتقرر أن RIN من 6 أن تكون مناسبة لإعداد مكتبة cDNA. بعد استخراج الحمض النووي الريبي، تم استخدام مجموعة لعزل الحمض النووي الريبي في تركيزات بيكومولار لتوليد مكتبة cDNA مناسبة لتسلسل الجيل القادم.
| 0.25 نانوغرام - 10 نانوغرام (1-8 ميكرولتر) من الحمض النووي الريبي |
| 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x أول ستراند |
| 1 ميكرولتر من أوليغوس ميكس V2 |
| المياه الخالية من النوكليس إلى الحجم النهائي البالغ 13 ميكرولتر |
الجدول 1: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: إعداد ماجستير ميكس للخطوة 8-3.
| 4.5 ميكرولتر ميكس V2 |
| مثبط اتّصال RNase 0.5 ميكرولتر |
| 2 ميكرولتر النسخ العكسي |
| الحجم النهائي من 7 ميكرولتر |
| إضافة 7 ميكرولتر إلى أنبوب عينة الحمض النووي الريبي |
الجدول 2: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: إعداد ماجستير ميكس للخطوة 8.5.
| 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة |
| 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة |
| 4 درجة مئوية عقد |
الجدول 3: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: شروط الحرارية للخطوة 8.5.
| 2 ميكرولتر مياه خالية من النوكليس |
| 25 ميكرولتر 2x PCR المخزن المؤقت |
| 1 ميكرولتر بوليميراز الحمض النووي لكل رد فعل |
| اخلط بلطف وتدور لفترة وجيزة |
| إضافة 28 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل من أنابيب العينة |
| إضافة 1 μL من كل 5 ' و 3 ' التمهيدي إلى كل أنبوب |
| خلط ردود الفعل بلطف وتدور إلى أسفل لفترة وجيزة |
الجدول 4: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: إعداد ماجستير ميكس للخطوة 8.6.
| دورة واحدة |
| 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة |
| 5 دورات |
| 98 درجة مئوية لـ 15 سنة |
| 55 درجة مئوية لـ 15 سنة |
| 68 درجة مئوية لمدة 30 سنة |
| دورة واحدة |
| 68 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 4 درجات مئوية |
الجدول 5: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: شروط الحرارية للخطوة 8.6.
| 16.8 ميكرولتر مياه خالية من النوكليس |
| 2.2 ميكرولتر 10x R المخزن المؤقت |
| 1.5 ميكرولتر R v2 |
| 1.5 ميكرولتر R-مسابير v2 |
الجدول 6: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: إعداد ماجستير ميكس للخطوة 8-18.
| 37 درجة مئوية 60 دقيقة |
| 72 درجة مئوية 10 دقيقة |
| 4 درجة مئوية عقد |
الجدول 7: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: شروط الحرارية للخطوة 8.20.
| 26 ميكرولتر مياه خالية من النوكليس |
| 50 ميكرولتر CB PCR المخزن المؤقت |
| 2 ميكرولتر PCR2 التمهيديات v2 |
| 2 ميكرولتر بوليميراز الحمض النووي |
الجدول 8: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: إعداد ماجستير ميكس للخطوة 8-21.
| دورة واحدة |
| 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة |
| X دورات |
| 98 درجة مئوية لـ 15 سنة |
| 55 درجة مئوية لـ 15 سنة |
| 68 درجة مئوية لمدة 30 سنة |
| دورة واحدة |
| 68 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 4 درجات مئوية |
الجدول 9: مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وإعداد المكتبة: شروط الحرارية للخطوة 8-21.
| الخطوة الأولى | الخطوة الثانية | الخطوة الثالثة | |
| الطريقة الأولى | تايرود 15' | -- | -- |
| الطريقة الثانية | تايرود 5' | سكروز 30% 15' | -- |
| الطريقة الثالثة | تايرود 5' | 4% PFA 10' | -- |
| الطريقة الرابعة | تايرود 5' | 30% سكروز 15' | الدماغ في 30% سكروز بين عشية وضحاها |
الجدول 10: أساليب اتباع نهج التروية المختلفة.
الشكل 1: نماذج الأورام الدبقية الماوس المستخدمة لميكروديز بالليزر. (أ)الجمال النائم جيم تستخدم لتطوير دي نوفو دبقية. تعرض الصور تطور الورم: (1) حقن البلازميد في البطين الجانبي للمواليد، (2) عبء الورم. (ب)توليد نموذج الورم الدبقي القابل للزرع باستخدام ثقافات خلايا الورم الدبقي. يتم زرع خلايا الغلاف العصبي المستزرعة من GEMM داخل الجمجمة في السترياتوم. (C)تصوير المقاطع بالتبريد من الدماغ جزءا لا يتجزأ من التوجه التاجي بعد التبرّاب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للطريقة المستخدمة لتلطيخ أقسام الأنسجة المحفوظة بالتبريد مع كريسيل البنفسجي وإيوسين. تم التعامل مع الشرائح المستخدمة للتلطيخ مع أدوات تنظيفها مع المياه الخالية من RNase. تم إعداد جميع الحلول مع RNase / DNase المياه الحرة في يوم تلطيخ. كريسل البنفسجي البقع النوى البنفسجي وإيوسين Y البقع السيتوبلازم الوردي. تم حل الأصباغ في 70٪ من الإيثانول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين مختلف أساليب التروية للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة وسلامة الحمض النووي الريبي. تمثل صور H & E مورفولوجيا مقارنة لأنسجة الدماغ التي تعرضت للتهوى تحت أساليب مختلفة:(أ)حل Tyrode لمدة 15 دقيقة،(ب)حل Tyrode لمدة 5 دقيقة، 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة،(C)حل Tyrode لمدة 5 دقيقة، 30٪ سكروز لمدة 15 دقيقة، و (D)حل Tyrode لمدة 5 دقيقة، 30٪ سكروز لمدة 15 دقيقة مع الانغماس بين عشية وضحاها في السكروز 30٪. يتم عرض تقييم جودة الحمض النووي الريبي لكل طريقة للتتسرب. ترسم المؤامرات قمم 18s و 28s rRNA وذروة العلامة الأولية. يتم استخدام نسبة 18s و 28s rRNA لتحديد نوعية الحمض النووي الريبي. يتم عرض صورة هلام من شظايا الجيش الملكي النيبالي على يمين المؤامرات. تم تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام قيم RIN. كانت جودة الحمض النووي الريبي عالية في الطرق A و C و D. كان مورفولوجيا الأنسجة متفوقة في الأساليب C و D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية لأنسجة الورم الدبقي المركبة وغير المركبة. (أ)صور تمثيلية للأنسجة الملطخة بـ H & E. ترك هذا النسيج غير محمول وأصبح المجففة عرض مورفولوجيا الفقراء مع فواصل في الأنسجة. (ب)صور تمثيلية للأنسجة الملطخة بـ H & E والمركبة بمتوسطة التركيب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية لأنسجة الورم الدبقي المستخدمة في استئصال الدقيق بالليزر. (A-B) صور تمثيلية للأنسجة الملطخة بـ H & E ومناطق الهياكل متعددة الخلايا المختارة لـ LMD. (أ)على اليسار، تم اختيار مناطق من الخلايا الممدودة (الأحمر) ومناطق التحكم (الأزرق) لLMD. (ب)على اليمين، تم اختيار مناطق الغزو الجماعي (الأحمر) ومناطق السيطرة (الأزرق) لLMD. (C)ممثل الجيش الملكي النيبالي مراقبة الجودة للمناطق microdissected الليزر. تم تشريح مساحة إجمالية قدرها 6.5 × 106 ميكرومتر2. ويبين التحليل تركيز الحمض النووي الريبي البالغ 346 2 بيكوغرام/ميكرولتر ورقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN): 6.8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم تجانس الورم الدبقي والغزو ذات أهمية حاسمة للكشف عن الأهداف العلاجية الجديدة13. في هذه المخطوطة، نصف طريقة مفصلة ومحسنة لتحليل المشهد الجزيئي لعدم تجانس الورم الدبقي والغزو باستخدام المجهر التقاط الليزر (LMD) يليه تحليل النسخ.
يمكن استخدام عملية الالتقاط المجهري بالليزر (LMD) لتحديد مناطق مختلفة أو خلايا مفردة داخل الورم ، مما يوفر عينة محددة لمزيد من التحليل للنمط الجزيئي الذي يحافظ على السياق المكاني للورم14. هذه التقنية موثوقة ومنخفضة السعر مقارنة بالطرق الأخرى المستخدمة لتحليل النسخ المكاني في الأورام الصلبة15. قمنا بتحليل عدم تجانس الورم الدبقي والغزو في نماذج ورم الفئران المعدلة وراثيا أو النماذج القابلة للزرع داخل الجمجمة باستخدام LMD. هذه النماذج خلاصة الخصائص البارزة للأورام الدبقية البشرية، مما يسمح لدراسة عدم تجانس الورم الدبقي والغزو10,12.
الحفاظ على الأنسجة الورم عالية الجودة مورفولوجيا وسلامة الحمض النووي الريبي هي واحدة من القيود لLMD. لتحسين مورفولوجيا الأنسجة ، قمنا بغرس الفئران مع حل Tyrode لمدة 5 دقائق ، تليها 30٪ من السكروز المذاب في نفس الحل. بمجرد تشريح الدماغ ، حافظنا عليه في 30٪ من السكروز المذاب في المياه الخالية من RNase / DNase بين عشية وضحاها أو حتى وصل الدماغ إلى الجزء السفلي من حاوية التخزين. هذه الخطوات تحسن بشكل كبير مورفولوجيا الأنسجة وخفضت تشكيل بلورات الثلج في الأنسجة أثناء الحفاظ على التبريد. على الرغم من عدم استخدام أنسجة الورم الدبقي البشري لهذا البروتوكول ، فإن احتضان العينات البشرية في محلول السكروز بنسبة 30٪ بين عشية وضحاها يمكن أن يكون منهجية مجدية لتحسين مورفولوجيا أقسام التبريد. آخر قيود محتملة لLMD هو الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي بعد تلطيخ8. على الرغم من أن فرق البحث الأخرى قد أجريت ميكروديليسمقطع الليزر على أنسجة الورم الدبقي تليها تحليل RNA-seq أنها لا توضح أي الحمض النووي الريبي و / أو مورفولوجيا ولا تعلق على نوعية مورفولوجية، أو ضوابط خاصة للأقسام المجمدة الدبقي16. في هذا البروتوكول تحديد المورفولوجية دقيقة كان ضروريا من أجل الليزر microdissect هياكل الماكروالخلوية الدقيقة داخل الأورام الدبقية. لاحظنا أن إصلاح أنسجة الورم الدبقي مع محلول الإيثانول وتلطيخه مع 4٪ من البنفسج كريسيلي و 0.5٪ إيوسين Y يذوب في جودة الحمض النووي الريبي التي يتم الحفاظ عليها من الإيثانول ومكن التحديد المجهري للخلايا المفردة والهياكل متعددة الخلايا. أظهرنا أن تركيب أقسام الورم الدبقي مع حل تصاعد هو خطوة حاسمة التي تمنع تكسير وتشكيل شق في الأنسجة. يرجى ملاحظة أن المتوسطة المتصاعدة تحتاج إلى إعدادها في الماء ، حيث أن استخدام المتوسط المتصاعد المذاب في الإيثانول سيؤدي إلى ضعف مورفولوجيا الأنسجة. يجب إجراء الميكروديز القسم بالليزر في أسرع وقت ممكن في بيئة خالية من RNase. نوصي أيضًا بالقسم حتى 2.5 × 106 ميكرومتر2 إجمالي مساحة الورم / الأنسجة من أجل الحصول على كميات مناسبة من الحمض النووي الريبي ، سواء لمراقبة جودة الحمض النووي الريبي والتحليل النسخي.
LMD تمكن من تحليل مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم عدم تجانس الورم الدبقي والغزو. يمكن أن يكشف هذا التحليل عن أهداف محتملة جديدة للتشخيص والتكهن والتطوير التحريري المستقبلي في نماذج الورم الدبقي قبل السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع مؤلفي هذه الورقة يعلنون عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
ودعمت المنح التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة): R37-NS094804، R01-NS105556، R21-NS107894 إلى M.G.C.؛ (المعاهد القومية الوطنية للصحة / NINDS) المنح R01-NS076991، R01-NS096756، R01-NS082311 إلى P.R.L.; (المعاهد القومية الوطنية للصحة/المعهد الوطني للبناء القومي): R01-EB022563؛ (المعاهد القومية للصحة/NCI) U01CA224160; قسم جراحة الأعصاب، مركز روجل للسرطان في جامعة ميشيغان، مؤسسة تشادترو، ومؤسسة ليا قلوب سعيدة إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي منحة الطب الحيوي F046166 إلى المعاهد الوطنية للصحة M.G.C. ، UL1 TR002240 لمعهد ميشيغان للبحوث السريرية والصحية (MICHR)، بعد الدكتوراه برنامج علماء الترجمة (PTSP) منحة، مشروع F049768 إلى جامعة ميشيغان فوربس معهد أبحاث السرطان، وجائزة الطبيب والعالم من البحوث لمنع العمى، وشركة (RPB)، منحة R01 EY022633 من NEI من المعاهد القومية للصحة (AK)، ومنحة غير مقيدة من RPB إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية. استخدم هذا البحث نواة أبحاث الرؤية (P30 EY007003) ، ونواة أبحاث مركز السرطان (P30 CA046592). ويدعم AK من قبل السيدة وليام ديفيدسون جائزة الباحث الناشئة من معهد أ. ألفريد تاوبمان للبحوث الطبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
- Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Rabien, A., Kristiansen, G. Tissue Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).
- Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection. Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).
- Núñez, F. J., et al. IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response. Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Brat, D. J., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing. Science. 358 (6359), 64-69 (2017).
- Gagner, J. P., Zagzag, D. Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).
