Summary
레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.
Abstract
글리오마는 그들의 침략성과 이질성을 특징으로 하는 1 차적인 뇌종양입니다. 의사 팔리세이드, 미세 혈관 증식, 중간엽 변형 및 괴사와 같은 특정 조직학적 패턴은 고급 신경교종의 조직학적 이질성을 특징으로합니다. 우리의 실험실은 온코 스트림이라는 이름의 중간 엽 세포의 높은 밀도의 존재가 종양 악성 종양과 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 우리는 신경교종의 성장과 침략의 기초가 되는 기계장치를 이해하기 위하여 독특한 접근을 개발했습니다. 여기서, 우리는 레이저 포획 미세 내부(LMD) 및 RNA 염기서열 분석을 활용하여 종양 내 이기종 다세포 구조(즉, 중간엽 영역 또는 종양 침윤 영역)의 미분 mRNA 발현을 분석하는 포괄적인 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 좋은 조직 조직학 및 RNA 무결성을 유지합니다. 관류, 동결, 임베딩, 단면화 및 염색은 형태를 보존하고 고품질 레이저 미세 해부 샘플을 얻기 위해 최적화되었습니다. 결과는 30% 자당을 사용하여 신경교종 베어링 마우스의 관류가 좋은 형태와 RNA 질을 제공한다는 것을 표시합니다. 또한, 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신으로 종양 섹션을 염색하면 RNA 무결성을 유지하면서 좋은 핵 및 세포 염색을 초래합니다. 기재된 방법은 민감하고 매우 재현성이 있으며 다양한 종양 모델에서 종양 형태를 연구하는 데 활용될 수 있다. 요약하면, 우리는 고형 종양 내의 이기종 다세포 구조의 분자 특징을 연구하기 위해 시퀀싱을 위한 형태학 및 RNA 품질을 보존하는 LMD를 수행하는 완전한 방법을 설명합니다.
Introduction
신경교종은 중추 신경계의 가장 공격적인 원발성 종양입니다. 그들은 매우 침략적이고 이질적인1. 종양의 세포 및 분자 분대의 분석은 새로운 치료 표적을 드러낼 것입니다.
현재 이용 가능한 다른 방법 들 중에서, 동결 된 뇌 종양 조직의 레이저 캡처 미세 해부 (LMD)는 종양 조직에서 이산 해부학 영역 또는 특정 세포 집단을 분리하여 분자 프로필을 연구 할 수있는 비용 효과적이고 신뢰할 수있는 기술입니다2,,3. LMD는 선택된 단일 세포 또는 다세포구조의mRNA 유전자 발현 프로파일의 분석을4,5. LMD는 종양 진행 도중 일어나는 분자 사건에 관하여 심층적인 기계론적인 지식을 얻기 위하여 이용될 수 있습니다. 종양 조직의 처리개선은 조직 형태와 RNA 품질6의최적의 광학 적 분해능을 얻기 위해 필요하다. 파라포름알데히드 고정이 형태학적 분석을 위한 최선의 선택이지만, RNA 품질은 이러한 조건하에서 영향을 받고 저하되어 RNA-seq 분석을 위한 RNA 품질이 저하됩니다. 동결 된 조직 섹션의 사용은 세포막을 부수고 세포 내의 구멍을 생성 할 수있는 얼음 결정 형성을 피하고 RNA-Seq 분석7을위한최상의 옵션으로 남아 있습니다.
여기서, 우리는 LMD에 대한 동결 마우스 뇌종양 조직을 처리하기 위해 최적화된 단면 고정 및 염색 방법을 설명한다. 얼음 결정이 조직에서 형성되는 것을 방지하기 위해, 우리는 30 % 자당의 용액으로 마우스를 주입했습니다. 이 용액은 극성 물 분자 사이의 상호 작용을 방해하고 얼음 결정의 형성을 방지하여 조직 형태를 보존합니다. 조직 염색은 종양 내의 세포 또는 해부학적으로 명백한 지역의 특정 인구를 분화하고 장악하기 위하여 필요합니다. RNA 무결성을 유지하기 위해 무해한 염료로 조직을 수정하고 염색하는 것이 필수적입니다. 이전에 는 헤마톡신/에오신(H&E)으로 조직을 염색하면 RNA 무결성이 저하되는 것으로 나타났습니다8. 우리는 에탄올, 크레실 바이올렛 4%, 에오신 Y 0.5% 솔루션으로 관심 조직을 고정하고 염색했습니다. 크레실 바이올렛은 진한 청색으로 세포 핵을 더럽는 산성염 염료입니다. Eosin Y는 세포의 기본 성분을 더럽게 하는 호염약 염료로, 세포질및 다른 세포 구조 의 구별을 제공하는8. 두 염료 모두 에탄올에 용해되며 RNA 품질을 저하시키지 않습니다. 조직 손상을 방지하고 세포 구조의 높은 광학 해상도를 유지하기 위해 LMD9이전에 조직 섹션을 장착했습니다.
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Protocol
실험 동물을 사용하는 여기에 설명된 모든 방법은 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: GEMM 또는 안정된 선으로부터 생성된 신경구는 마우스10에서 두개내 종양 생착에 사용될 수 있고 LMD 및 RNA 시퀀싱을 위해 처리될 수 있다. 이러한 세포는 반딧불 루시퍼라아제 및 GFP 단백질을 구성적으로 표현하며, 이는 종양 성장 분석 및 국소화를 위해 더욱 활용될 것이다.
1. 유전자 조작 된 신경교종 모델에서 파생 된 신경구에서 두개내 마우스 신경교종 모델 생성
- 유전자 조작 마우스(GEMM) 모델으로부터 신경구 세포의 1차 배양을 생성하려면, 앞서 설명한 프로토콜 을 사용하여10,,11.
- 설명된 대로 신경구 배양 배지를 준비하십시오: 500 mL의 덜베코의 변형된 독수리 배지 F-12(DMEM/F12)는 50x B-27의 10 mL및 100x N-2 신경 배양 보충제의 5 mL, 100x 항생제 항균제 의 5 mL 및 1 mL의 보충. 신경구를 도금하기 전에, 배양 배지에 20 ng/mL 인간 재조합 EGF 및 FGF를 추가한다.
- 배양 신경교종 신경구는 두개내 종양 생착 전에 2-3일 동안 37°C 및 5%CO2에서 조직 배양 인큐베이터에서.
- 수술 당일, 신경교종 신경구를 수집하고 실온에서 5 분 동안 550 x g에서 회전시십시오. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 제거하십시오.
- 신경구를 해리하기 위해, 세포 분리 용액의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 2-4 분 동안 37 °C 및 5 %CO2에서 배양하십시오. 잠복기 후, 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 1 mL 마이크로 파이펫으로 신경 구를 위아래로 피펫합니다.
- 비보충 DMEM/F12 매체의 10 mL로 신경구 현탁액을 희석하여 세포 분리 솔루션을 비활성화합니다. 실온에서 550 x g에서 5 분 동안 신경 구를 돌이시다. 조심스럽게 장식품을 제거하십시오.
- 보충제 없이 DMEM/F12 용지 100 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시키십시오. 세포 현탁액의 1:50 희석을 만들고, 실행 가능한 세포를 계산하기 위해 Trypan Blue의 50 μL을 추가합니다. 다음 수식을 사용하여 세포의 농도를 확인합니다.
셀/mL = [(정사각형당 계산된 셀) / #제곱 계산) x 50 x 10,000 셀/mL] - 세포 수를 결정한 후, 100 μL 부피에서 30,000 세포/μL의 목표 농도를 달성하려면 신경구를 아래로 돌리고 보충제를 포함하지 않는 적절한 부피인 DMEM/F12에서 다시 중단하십시오.
- 미리 표지된 0.6 mL 튜브에 신경구를 얼음 위에 놓습니다.
- 마취의 작업 솔루션을 준비, 이식 전에 진통제 및 마취 반전: 케타민/덱스메데토미딘 마취의 경우 0.6 mL의 100 mg/mL 염산염과 0.8 mL의 0.8 mL의 덱스메데토미드인염산염을 0.6 mL의 멸균 8.6 mL을 함유하고 있습니다. 부프레노르핀 진통제의 경우, 유리병을 함유하는 NaCl의 9 mL에 0.3 mg/mL 의 1 mL을 추가합니다. 아티파메졸 마취 반전의 경우, 바이알을 함유하는 NaCl의 9 mL에 5 mg/mL 의 atipamezole 1 mL을 추가하십시오.
- 두개내 종양 생착에 6-8주 된 C57BL/6J 암컷 마우스를 사용하십시오.
- 설치류 생존 수술승인된 방에서 두개내 종양 생착에 대한 멸균 용품을 설치하십시오. 탈착식 33G 바늘이 있는 멸균된 10 μL 해밀턴 주사기가 장착된 설치류 스테레오탁시틱 프레임에서 수술을 수행합니다. 비드 멸균기를 사용하여 수술 사이에 도구를 살균합니다.
- 1.11 단계에서 제조 된 마취액의 단일 복강 내 (i.p.) 주사로 마우스를 마취 (케타민 : 75.0 mg / kg 및 덱스 메데토미딘 : 0.5 mg / kg). 대략, 마취 용액의 250 μL 부피는 20 g의 무게의 마우스로 전달될 것입니다.
- 마우스가 깊은 마취 상태에 있으면, 건조를 방지하기 위해 눈에 멸균 가솔린 안과 윤활유를 적용합니다. 마우스 두개골에 모피를 면도. 소독하기 위해 면도 부위에 10 % 포비동 요오드 국소 용액을 바르고 있습니다.
- 마우스의 두개골을 입체 프레임으로 고정합니다. 첫째, 조심스럽게 포셉으로 입을 열고 부드럽게 혀를 당겨 질식을 방지하기 위해 입의 한쪽으로 이동합니다. 포셉으로 입을 열고 상단 절개를 입체 프레임의 치아 바의 열쇠 구멍에 넣습니다.
- 귀에 마우스 머리를 잡고, 포스트 궤도 뼈에 대한 귀 막대를 배치하고 그들을 고정. 마우스의 두개골이 수술 테이블탑과 수평인지 확인하십시오. 두개골에 압력을 가하지 않도록 귀 바를 조심스럽게 고정하십시오. 다음으로, 조심스럽게 코 바를 고정합니다.
- 크기 15 메스 블레이드를 사용하여 마우스 헤드를 따라 절개를하고 두개골을 노출시십시오. Colibri 리트랙터를 사용하여 절개 부위의 피부를 철회하십시오. 멸균 어플리케이터를 사용하여 모든 회음 부 조직을 제거하십시오.
- bregma를 확인하고 직접 위에 해밀턴 주사기의 바늘을 낮춥습니다. 프레임을 사용하여 브레그마의 바늘 1mm 앞쪽과 1.5 mm 측면의 위치를 지정합니다. 26G 바늘을 사용하여 두개골을 채점하여이 자리를 표시하십시오.
- 0.45mm 드릴 비트가 장착된 무선 파워 드릴을 사용하여 대상 부위에 버 구멍을 만듭니다. 기본 경막미에 도달할 때까지 드릴링합니다. 조심스럽게 26G 바늘버 구멍에 남아있는 뼈를 추출합니다.
- 파이펫을 사용하여 세포를 철저히 균질화하고 신경구 현탁액의 7 μL을 주사기에 그립니다. 주사기가 제대로 작동하는지 확인하려면 1 μL의 현탁액을 70% 알코올에 적신 패드에 분배하십시오.
- 바늘을 경막미의 표면으로 낮춥습니다. 주사기를 3.5mm 배반으로 낮추고 0.5mm를 후퇴시보입니다. 이것은 주입될 때 예금하는 신경구를 위한 두뇌에 있는 0.5 mm 공간을 만듭니다.
- 압력 평형을 위해 바늘을 2 분 동안 제자리에 둡니다. 1 분 동안 세포의 1 μL을 천천히 매끄럽게 전달합니다. 세포가 6 분 동안 정착할 수 있게하십시오. 2 분 동안 뇌에서 주사기를 천천히 매끄럽게 제거하십시오.
- 멸균 식염수 용액을 사용하여 두개골 표면을 세 번 씻으하십시오. 주사기에 있는 여분의 세포를 70% 알코올 패드에 분배하고 다른 70% 알코올 패드로 바늘을 깨끗하게 닦으소. 바늘의 막힘을 피하기 위해 멸균 PBS로 주사기를 헹구고.
- 리트랙터를 제거하고 마우스를 입체 프레임에서 조심스럽게 꺼내십시오. 3-0 나일론 봉합사, 집게 및 바늘 드라이버를 사용하여 절개를 닫습니다.
- 20 g 마우스에 대해 약 100 μL의 아티파메졸(1.0 mg/kg)을 투여하십시오. 20 g 마우스에 대해 피하적으로, 약 70 μL의 부프레노르핀(0.1mg/kg 피하)을 투여하십시오. 수술 후 마우스를 깨끗한 회복 케이지에 넣고 경고하고 활성화될 때까지 모니터링합니다.
2. 동물 관류 및 뇌 보존
- 종양 진행을 모니터링하기 위해, 동물이 종양 부담의 징후를 보일 때까지 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 생체 내 생물 발광을 결정합니다. 그들은 사이 신호에 도달 하는 경우 마우스 안락사 106 받는이외 7 광자/s.
- 자궁 내 (즉) 케타민 (75.0mg / kg) 및 덱스 메데토마이딘 (0.5 mg / kg) 용액으로 종양 부담의 징후를 나타내는 마우스를 마취. 무게 20g의 마우스에 약 250 μL을 전달합니다. 그런 다음 마우스가 페달 반사에 반응하지 않는지 확인합니다.
- 집게를 사용하여, 복강 위의 피부를 잡고, 해부 가위의 큰 쌍을 사용하여 복막 벽을 관통하여 "Y"절개를, 횡격막을 천공한 다음 늑골 케이지를 잘라.
- 마우스 심장의 좌심실에 무딘 20G 캐뉼라를 삽입합니다. 그런 다음 심장의 오른쪽 아트리움을 잘라서 흥분을 허용하십시오.
- 산소로 된 티로드용액(0.8% NaCl, 0.0264% CaCl2,0.005% NaH 2 PO 4, 0.1% 포도당, 0.1% NaHCO3,0.02% KCl)이 혈액 제거로 인해 간과 폐가 완전히 제거될 때까지 마우스 순환계를 통해 흐르도록 허용한다( 0.8% NaCl, 0.0264% CaCl 2, 0.005% NaH2PO4.
- 티로드용액에 용해된 30% 자당 용액으로 동물을 15분 간 추가로 투과하십시오. 관류의 성공을 평가하기 위해 목, 꼬리 및 다리가 30 % 자당 순환이 단단한지 확인하십시오.
- 작은 한 쌍의 해부를 사용하여 중간 선에서 두피를 잘라냅니다. 후두 뼈에서 시작하여 주마를 향해 앞으로 일합니다. 이것은 두개골을 드러을 것입니다.
- 한 쌍의 rongeurs를 사용하여, 후두 뼈에서 시작하는 두개골을 돌파하고 완전히 뇌의 표면을 노출하기 위해 앞으로 계속. 그런 다음 머리 쪽을 위로 돌리고 뇌의 기지에서 신경을 해부하여 두개골에서 방출합니다.
- RNase 자유물로 30% 자당 용액을 준비하고 40 μm 나일론 메쉬 필터를 통해 걸러RNA 분해를 줄입니다.
- 자당 용액 침투를 최대화하려면 해부 된 뇌를 30 % 자당 용액에 넣고 밤새 4 °C에 보관하십시오. 추가 처리하기 전에 뇌가 자당 용액을 함유 한 튜브의 바닥에 도달하도록하십시오.
3. 신경교종 종양을 품고 있는 두뇌의 동결 보존
- 뇌를 냉동 보존하기 전에 차가운 이소펜타인/2-메틸부탄으로 채워진 항아리를 준비하고 항아리를 액체 질소로 채워진 용기에 넣습니다. 용매를 식힙니다.
- 30% 자당 용액에서 뇌를 제거하고 필터 종이에 건조 얼룩.
- 영구 마커로 cryomold를 레이블을 지정합니다. 조심스럽게 약 5 mL의 OCT (최적의 절삭 온도 화합물)를 기포를 피하지 않고 극저온의 중심에 추가하십시오.
- 원하는 방향으로 OCT를 포함하는 cryomold에 뇌를 배치합니다. 뇌가 완전히 물에 잠길 때까지 OCT로 금형을 채웁니다. 깨끗한 집게를 사용하여 OCT와 뇌를 차가운 이소펜타네/2-메틸부탄에 빠르게 넣습니다.
- OCT가 굳어지면 (~30-40초), 뇌와 함께 크라오마를 제거하고 드라이 아이스에 놓습니다. 이 고체 OCT에 균열을 일으킬 수 있습니다 2 메틸 부탄 과거 2 메틸 부탄에 뇌를 포함하는 금형을 두지 마십시오. 알루미늄 호일에 뇌와 냉동을 감싸 -80 °C에 저장.
4. 냉동 뇌종양 조직 절제
- 라벨 2 μm 폴리에틸렌 나프탈레이트 (PEN) 샘플 정보와 슬라이드. 조직 단면도는 단면도 다음 이 슬라이드에 직접 배치될 것입니다.
- 저온 챔버의 온도를 -20 ~ -24 °C 사이로 설정합니다. 단면화하기 전에, 시료 블록을 저온 상승 챔버에 놓고 30-60 분 동안 챔버의 온도에 평형화하십시오.
- 저온 유지 챔버와 나이프 홀더를 100% 에탄올로 청소하고 RNase 세척 용액과 함께 사용할 브러시를 스프레이하십시오. 저온 유지 챔버 내부에서 작업, 금형을 제거하고 OCT와 저온 유지 도면 시편 디스크에 뇌를 포함하는 OCT 블록을 부착.
- 일회용 블레이드를 단면 홀더에 설치합니다.
- 10 μm 두께에서 뇌를 섹션. 조직에 줄무늬나 스크래치 라인이 없는지 확인하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 조심스럽게 평평하게하고 절단 표면에 조직을 풀어.
- 조심스럽게 RNase 무료 PEN 유리 슬라이드에 뇌 섹션을 포함하는 조직을 마운트. 포지티브 충전 유리 슬라이드를 손가락으로 티슈 방향으로 뒤집고 유리 슬라이드를 티슈 섹션쪽으로 부드럽게 누릅니다.
참고 : 손의 온도는 조직이 유리에 부착하는 데 도움이됩니다. - 슬라이드에 뇌 섹션을 장착 한 후, 저온 챔버 내부의 상자에 슬라이드를 유지하고 -80 °C에 저장합니다. 슬라이드를 실온에서 유지하지 마십시오.
참고 : 조직의 접이식 및 찢어짐이 일반적입니다. 정확한 후방 분석을 위해 이러한 아티팩트를 최소화하는 것이 중요합니다.
5. 냉동 보존 된 뇌 조직 섹션의 고정 및 염색
- RNA 무결성을 유지하기 위해 RNase 세척 용액과 함께 사용할 모든 기기를 청소하십시오. 연기 후드 내부의 고정 및 염색 프로토콜을 진행합니다.
- 깨끗한 RNase 프리 50 mL 튜브에서 설명된 고정 솔루션을 준비합니다. 얼룩이 묻은 날에 RNase 무료 물로 모든 솔루션을 만드십시오.
- 같은 날 레이저 미세 해부가 수행되어 100 %, 95 %, 70 % 및 50 % 에탄올 용액을 준비합니다. 솔루션을 실온에서 단단히 닫힌 튜브에 보관하십시오.
- 75% 에탄올 용액에 4% 크레실 바이올렛과 0.5% 에오신 Y를 준비합니다. 용액을 1 분 동안 격렬하게 소용돌이시키고 0.45 μm 나일론 필터를 통해 걸러서 용해되지 않은 분말의 흔적을 제거합니다.
- 조직 슬라이드를 용기에 넣고 95% 에탄올을 30초에. 30 s에 대 한 거기 슬라이드를 두고.
- 슬라이드를 50 % 에탄올로 옮기고 25 s 동안 그대로 둡니다. 이 시점에서, OCT는 용해될 것이다. 슬라이드를 20s에 대한 4 % 크레실 바이올렛 용액으로 옮은 다음 5 s에 대한 0.5 % 에오신 Y 용액으로 옮김.
- 염료 용액에서 슬라이드를 꺼내 필터 페이퍼로 슬라이드를 건조시게 합니다. 그런 다음 슬라이드를 25 초에 50 % 에탄올에 놓고 슬라이드를 25 초에 75 % 에탄올로 옮기십시오. 슬라이드를 30 초에 95 % 에탄올로 옮기십시오. 슬라이드를 60 초에 100 % 에탄올로 옮김.
- 실렌으로 슬라이드를 헹입니다. 자일렌용기에 옮기고 3분 기다립니다.
- RNase가 없는 물에 장착 매체(예: 핀포인트 껌)를 준비합니다. 마우스 뇌 섹션을 장착하려면 RNase가 없는 물에 장착 매체를 1:10의 비율로 희석하십시오.
- 실온에서 RNase가 없는 표면에 슬라이드를 10s로 말립니다. 자일렌이 마르기 전에, 조직 섹션으로 슬라이드를 장착하십시오.
- 멸균 및 RNase가 없는 얇은 페인트 브러시로 슬라이드의 티슈 위에 장착 용액을 부드럽게 분산시입니다. 10-20 s를 기다린 다음 즉시 조직 슬라이드를 현미경 현미경 플랫폼으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 기다립니다.
참고: 장착에 사용되는 RNase-free 물매에 대한 장착 매체의 비율은 관심 있는 조직에 따라 다릅니다. 장착 매체 /물 비율은 RNA 무결성에 영향을미치지 않고 레이저 미세 해부에 대한 신경교종 조직 형태를 보존합니다.
6. 레이저 캡처 미세 해부
참고: 레이저 포획 미세 해부 현미경은 종양 조직 내의 관심 있는 특정 영역을 레이저 미세 준해하기 위해 활용될 필요가 있습니다. 조직 레이저 미세 해부에 대한 시간을 최소화하려면 고정 및 염색 전에 LMD 현미경을 준비하십시오.
- 시스템을 시작하려면 먼저 전원 스트립을 켠 다음 레이저를 켭니다. 그런 다음 현미경 컨트롤러와 컴퓨터를 켭니다. LMD 소프트웨어를 시작합니다.
- 현미경 제어에서 10배 배율을 선택합니다. 레이저 제어에서조직 해부에 대한 레이저 매개 변수를 설정합니다. 최상의 절단 결과를 위해 레이저 주파수를 120Hz로 설정합니다. 항상 레이저 전류를 100%로 설정합니다.
- 정확한 레이저 미세 해부를 위해 속도를 10으로 설정하고 조리개 설정을 2.0-10.0 μm로 설정합니다. 더 높은 설정에서 레이저 전원을 사용하면 유리 에칭이 발생할 수 있습니다.
- 해부 다음 조직을 캡처 할 조직 수집기로드. 두 번째 언로드 버튼을 클릭합니다. 빈 수집기와 30 μL의 포염 버퍼가 들어 있는 DNase/RNase 프리 0.5 mL PCR 플랫 헤드 튜브를 컬렉터에 넣습니다. 컬렉터를 다시 기기에 넣고 계속하려면 소프트웨어 계속을 클릭합니다.
- 처리된(고정 및 염색된) 시편을 현미경에 로드합니다. 먼저 LMD 소프트웨어에서 언로드를 클릭합니다. 다음으로 슬라이드 홀더에 샘플을 장착하고 슬라이드 홀더를 스테이지에 놓습니다. 계속하려면 소프트웨어 계속을 클릭합니다.
- 잘라내기 셰이프 창 아래에서 그리기 + 잘라내기를 선택합니다. 현미경 컨트롤을 사용하여 관심 영역을 찾습니다. 관심 영역(ROI)을 그리고 대상 수집기 튜브를 선택합니다. 단일 슬라이드에서 여러 영역을 동시에 해부하여 여러 개의 ROI를 그릴 수 있습니다.
- 잘라내기 시작을 클릭하여 조직 미세 해부로 진행합니다. 관심 영역을 절편 한 후 홀더에서 수집기 튜브를 제거하고 드라이 아이스에 튜브를 배치합니다. 장기간 저장을 위해 -80°C로 수집된 RNA 조직 샘플을 이송한다.
7. 미세 해부 된 신경교종 조직의 RNA 분리
- LMD로부터의 RNA 추출의 경우 작은 시료 및 낮은 RNA 수율에 최적화된 RNA 절연 키트를 사용합니다(재료 표참조). 제조 지침을 따르십시오. 실온(25°C)에서 모든 절연 단계를 수행합니다. RNA 품질을 유지하려면 신속하게 작업하십시오. 제조업체에서 지정한 대로 모든 솔루션을 준비합니다.
- 1% β-메르카포에탄올로 용해 완충액으로 시료 부피를 350 μL로 조정합니다. 시료 점도를 줄이고 RNA 용출 스핀 컬럼 효율을 높이기 위해 40초 동안 시료를 소용돌이치게 한다.
- 샘플 전체를 2 mL 수집 튜브에 배치된 gDNA 제거기 스핀 컬럼으로 옮긴다. 8,000 x g에서30s의 튜브를 원심 분리기. 흐름을 저장하고 원심 분리 다음 컬럼에 액체가 남아 있지 않은지 확인합니다.
- 유동 관통에 70% 에탄올의 350 μL을 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 샘플을 2 mL 수집 튜브에 배치된 RNA 용출 스핀 컬럼으로 이송한다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 8,000 x g에서15초동안 원심분리기를. 흐름을 삭제하여 열을 저장합니다.
- RNA 용출 스핀 컬럼에 700 μL의 RNA 세척 버퍼 1(20% 에탄올, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5)을 추가합니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 15s의 원심 분리기를 8,000 x g에서 스핀 컬럼 멤브레인으로 세척합니다. 흐름을 취소합니다.
- 원심분리 후, 컬럼이 유동관통에 접촉하지 않도록 수집 튜브에서 RNA 용출 스핀 컬럼을 조심스럽게 제거한다.
- 스핀 컬럼에 제2 RNA 세척 완충제(에탄올 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5)의 500 μL을 추가합니다. 컬럼 의 뚜껑을 닫고 20 s에 대해 8,000 x g을 회전하여 컬럼 멤브레인을 세척하십시오. 흐름을 삭제합니다.
- RNA 용출 컬럼을 세척하려면 80 % 에탄올 500 μL을 추가하고 2 분 동안 8000 x g에서 기둥과 원심 분리기의 뚜껑을 닫습니다.
- 새로운 컬렉션 튜브를 사용하여 스핀 컬럼의 뚜껑을 열고 8000 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 열어 열을 건조시십시오. 용출 튜브를 폐기하십시오.
- RNA 용출 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브에 놓습니다. 37°C에서 37°C에서 직접 끓인 RNase 없는 물 12 μL을 스핀 컬럼 멤브레인의 중앙에 직접 추가합니다. RNA를 용해시키기 위해 최고 속도로 4 분 동안 기다렸다가 원심 분리기를 기다립니다.
8. RNA 품질 관리, 라이브러리 준비 및 RNA-Seq 분석
- RNA 추출 및 정제에 이어, RNA를 증폭시키고 제조사 지침에 따라 피코 몰 농도에서 RNA 격리에 적합한 특수 키트를 사용하여 cDNA 라이브러리를생성합니다(재료 표 참조). 제조업체의 지침을 따르십시오. 다른 PCR 제품과의 오염을 방지하고 시료의 뉴클레아제 분해를 방지하기 위해 워크스테이션을 청소하십시오.
- RNA가 RIN 값이 4보다 큰 경우, RNA가 양호한 품질이거나 부분적으로만 분해되었음을 의미하며, 단편화 단계를 진행한다. 얼음에 모든 항목을 준비합니다.
- 표시된 대로 마스터 믹스를만듭니다(표 1). 뉴클레아제 프리 박막 0.2 mL PCR 튜브에 반응 혼합물을 만듭니다. 튜브를 94°C에서 열뚜껑 열 사이클러로 배양합니다. 단편화 배양 시간은 RNA의 품질에 따라 달라집니다. 린 ≥ 7: 4 분, RIN 5-6 : 3 분, RIN 4-5 : 2 분.
- 배양 후, 이전에 -20 °C에서 냉각 된 PCR 냉각기 랙에 튜브를 놓고 2 분 동안 앉게하십시오.
- RNA 샘플의 각 튜브에 대해, 제 1 가닥 합성 반응 마스터 믹스를 준비한다(표2). 표 3에기재된 조건하에서 튜브를 열연 사이클러로 배양한다. cDNA 제품은 다음 단계로 진행하기 전에 2 주 동안 -20 °C에서 동결 될 수있다.
- 표 4에표시된 대로 PCR 마스터 믹스를 만듭니다. 튜브를 뜨거운 뚜껑 열 사이클러에 놓고 표 5에표시된 설정에서 PCR 반응을 실행합니다.
- DNA를 정화하는 데 사용되는 구슬을 실온으로 따뜻하게하십시오. 일단 따뜻해지면 각 샘플에 40 μL의 구슬을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 섞고 잠시 회전하여 튜브 바닥에 액체를 수집합니다. 튜브가 DNA가 구슬에 결합할 수 있도록 8분 동안 실온에서 배양하게 한다.
- 튜브를 자기 분리 장치에 놓고 약 5 분 동안 또는 용액이 완전히 명확해질 때까지 놓습니다. 분리 장치에 튜브를 유지, 구슬을 방해하지 않고 조심스럽게 상판을 제거하기 위해 파이펫을 사용합니다.
- 분리 장치에 튜브를 유지, 구슬을 방해하지 않고 세척 구슬에 갓 만든 80 % 에탄올의 200 μL을 추가합니다. 80% 에탄올을 제거하기 전에 30s를 기다립니다. 이 단계를 반복합니다.
- 튜브를 잠시 회전시키고 튜브를 분리 장치에 다시 놓습니다. 구슬을 방해하지 않고 잔류 80 % 에탄올을 제거하십시오.
- 캡을 5분 동안 열어 놓고 튜브를 공기 건조시키십시오. 구슬이 건조해질 때 더 이상 앉지 마십시오.
- 분리 장치에 튜브를 유지, 구슬을 커버하는 뉴클레아제없는 물 52 μL을 추가합니다. 분리 장치에서 튜브를 제거하고 모든 구슬이 다시 중단 될 때까지 위아래로 피펫을 제거하십시오. 실온에서 5분 만에 배양합니다.
- 용액이 명확해질 때까지 분리 장치에 튜브를 다시 놓고 약 1 분. 결과 상층물의 50 μL을 8 웰 스트립의 우물로 옮김하십시오. 각 샘플에 40 μL의 새 구슬을 추가합니다. 소용돌이를 철저히 섞어 줍니다. 구슬이 실온에서 8분 동안 배양하여 DNA에 결합하도록 허용합니다.
- 이 잠복기 도중, 견본에 존재하는 임의의 rRNA를 위해 이용되는 분대를 해동시작하십시오. 해동되면 얼음 위에 놓습니다. 또한 열 사이클러를 72°C로 예열합니다.
- 용액이 지워지때까지 자기 분리 장치에 샘플을 놓습니다(약 5분). 냉각된 PCR 튜브에 샘플당 프로브의 Aliquot 1.5 μL. 예열된 열 사이클러에 튜브를 2분 및 4°C동안 72°C의 설정하에 놓습니다.
- 자기 분리 장치에 샘플 튜브를 유지, 구슬을 방해하지 않고 파이펫으로 상판을 제거합니다. 그런 다음 구슬을 방해하지 않고 씻을 수 있도록 구슬에 80 % 에탄올을 갓 만든 200 μL을 추가하십시오. 80% 에탄올을 제거하기 전에 30s기다립니다. 이 단계를 반복합니다.
- 튜브를 잠시 회전시키고 튜브를 분리 장치에 다시 놓습니다. 구슬을 방해하지 않고 잔류 80 % 에탄올을 제거하십시오. 캡을 2분 동안 열어 놓고 튜브를 공기 건조시키십시오. 구슬이 건조해질 때 더 이상 앉지 마십시오.
- 제시된 순서대로 다음 성분을 결합하여 모든 샘플에 대한 마스터 믹스를 준비한다(표6).
- 마스터 믹스를 소용돌이로 혼합하고 각 샘플의 말린 구슬에 22 μL의 혼합물을 넣고 완전히 섞어서 다시 중단합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 튜브를 회전시키고 1 분 동안 또는 샘플이 명확해질 때까지 자기 분리 장치에 놓습니다. 새로운 PCR 튜브에 구슬을 방해하지 않고 상수의 20 μL을 전송합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러에 배치하여 표 7의설정 아래에 놓습니다.
- 각 샘플에 대한 반응에 충분한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 표시된 표 8의마스터 믹스에 다음 구성 요소를 추가합니다. 8.20단계에서 각 샘플 튜브에 PCR 마스터 믹스의 80 μL을 추가하고 다음 설정에서 열 사이클러에 놓습니다(표9).
- DNA를 정화하는 데 사용되는 구슬을 실온으로 따뜻하게하십시오. 일단 따뜻해지면 각 샘플에 구슬 100 μL을 추가합니다. 튜브가 DNA가 구슬에 결합할 수 있도록 8분 동안 실온에서 배양하게 한다.
- 튜브를 자기 분리 장치에 놓고 약 5 분 동안 또는 용액이 완전히 명확해질 때까지 놓습니다.
- 분리 장치에 튜브를 유지, 구슬을 방해하지 않고 조심스럽게 상판을 제거하기 위해 파이펫을 사용합니다.
- 분리 장치에 튜브를 유지, 구슬을 방해하지 않고 세척 구슬에 갓 만든 80 % 에탄올의 200 μL을 추가합니다. 80% 에탄올을 제거하기 전에 30s를 기다립니다. 이 단계를 반복합니다.
- 간단히, 튜브를 아래로 회전하고 분리 장치에 다시 튜브를 배치합니다. 구슬을 방해하지 않고 잔류 80 % 에탄올을 제거하십시오.
- 캡을 5분 동안 열어 놓고 튜브를 공기 건조시키십시오. 구슬이 지나치게 건조하기 때문에 더 이상 앉지 마십시오. 파이펫 20 μL의 트리스 버퍼를 건조된 펠릿에. 분리 장치에서 튜브를 제거하고 비펫을 다시 일시 중단하기 위해 파이펫과 철저히 혼합하십시오. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 튜브를 분리 장치에 2분 동안 또는 용액이 명확해질 때까지 놓습니다. 상급체를 획득하여 새 튜브로 옮김. 그런 다음 수집된 용액을 -20°C에 저장합니다.
- 품질 및 수량 제어에 필요한 최종 라이브러리를 확인합니다. 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 페어링된 끝 50nt 읽기로 클러스터된 샘플과 시퀀스를 풀합니다.
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Representative Results
우리의 실험실은 수면 미용 트랜스포사아제 시스템을 사용하여 유전자 조작 마우스 모델(GEMMs)을 생성하였다(그림1A). 이 시스템은 신생아 마우스에 있는 신경 전구 세포의 게놈으로 특정 유전 변경을 통합합니다. 이 변경된 전구 세포는 내인성 신경교종 종양을 형성합니다. 종양을 생성하는 데 사용되는 플라스미드 서열은 다음과 하였다: (1) pT2C-LucPGK-SB100X 슬리핑 뷰티 트랜스포슨 및 루시퍼라제 발현, (2) NRAS 발현을 위한 pT2-NRASSV12, (3) pT2-shp53-GFP4 p53 녹아웃 및 GFP 단백질 발현, 및 (4) ATRX 노크다운을 위한 pT2-shATRx-GFP4. 플라스미드는 앞서11일설명한 바와 같이 1일된 신생아 새끼의 측면 심실에 주입되었다. 플라스미드 섭취량 및 종양 형성은 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 통해 모니터링되었다. 일단 종양을 지탱하는 마우스가 종양 부담의 표시를 표시하면, 그(것)들은 희생되었습니다. 종양은 신경구 배양을 생성하거나 LMD 처리를 위해 직접 저온 보존을 위해 사용되었다(도1A).
GEMM으로부터 시작된 세포 배양은 번역 가능한 신경교종 모델을 생성하기 위해사용되었다(도 1B). GEMM 종양으로부터 유래된 신경구는 면역력이 있는 마우스의 줄무늬내로 배양및 이식하였다. 신경구 배양으로부터 수득된 단세포 현탁액은 당사의 실험실10,,11,,12에의해 이전에 설명된 바와 같이 두개내 이식에 의해 신경교종 종양을 생성하는데 사용되었다. 이 방법론을 통해 마우스당 이식되는 세포 수의 신중한 정량화(30,000개의 세포/1 μL/마우스)를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 실험 이식 사이의 결과의 재현성을 허용합니다. 그러나, 신경구의 이식은 마우스 신경교종 종양 및 후속 LMD 및 RNA-Seq 분석을 생성하는 대안적인 선택권일 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고이 방법은 더 정확한 것으로 간주됩니다. 종양 진행은 생체 내 생물 발광 스펙트럼 이미징 시스템에 의해 모니터링되었다. 종양 부담의 징후를 나타내는 마우스는 백막으로 침전되었고 뇌는 LMD 처리를 위해 저온 보존되었다(도1C).
조직 절편은 글리오마 내의 다세포 구조의 전사체를 특성화하기 위해 레이저 미세 분부되었다. 설명된 관류, 동결 및 임베딩 절차는 조직 형태를 보존하고 레이저 미세 해부 후 양질의 RNA를 얻기 위해 최적화되었습니다. 상이한 관류 접근법은 우수한 형태및 RNA 무결성을 가진 조직을 획득하기 위해 평가되었다(표10). 관심 영역을 해부하기 위해 RNA에 대한 무해한 염료로 조직을 염색할 필요가 있었습니다(그림 2). 우리는 5 분 동안 Tyrode의 용액으로 종양 베어링 마우스를 정중시키고, 15 분 동안 30 % 자당을 관찰한 다음 30 % 자당에서 해부 된 뇌의 밤새 저장하여 종양 조직의 형태및 RNA 무결성을 보존합니다(그림 3D). 30 % 자당 용액을 가진 관류는 조직 내의 얼음 결정 형성을 방지했습니다. 비록, 파라포름알데히드 조직 고정은 고품질 조직 형태를 초래했지만, RNA 무결성은 부정적인 영향을받았다(도 3B). 5분 동안 Tyrode의 용액 또는 15분 동안 30% 자당 용액에 대한 Tyrode의 용액과 같은 다른접근법(그림 3A 및 C)은RNA 품질에 영향을 미치지 않았다. 이러한 조건 하에서, 두뇌에 보존 되지 않았습니다 30% 하룻밤 자당; 우리는 조직 형태에서 감소 된 해상도를 관찰.
RNA 무결성 품질 관리 분석에 이어 다양한 염색 기술을 수행했습니다. 우리는 4% 크레실 바이올렛 과 0.5% eosin Y 염색이 신경교종 다세포 구조를 확인하고 RNA 무결성을 유지하기에 충분하다는 것을 관찰했습니다. 크레실 바이올렛은 진한 청색으로 세포의 핵을 더럽는 산성염 염료입니다. Eosin Y는 세포의 기본적인 분대를 얼룩지는 호염약 염료입니다.
우리는 조직이 장착 매체로 장착되지 않은 경우, 단면도가 탈수되고 형태가 악화되는 것을 관찰했다(그림 4A). 고품질 조직 형태를 유지하기 위해, 우리는 장착 매체와 조직을 장착. 우리는 물에 용해 된 15 % 장착 매체 (물 200 μL에서 30 μL)가 고품질 조직 형태를 유지하는 것을 관찰했습니다(그림 4B).
그림 5A에서는신경교종 이질성이 있는 영역이 도시되어 있습니다. 이미지는 해부 전 레이저 포획 미세해부 현미경을 사용하여 획득되었다. 빨간 선은 풍부한 중간 엽 세포 (길쭉한 세포)를 가진 지역을 묘사합니다. 파란색 선은 중간엽 세포가 없는 영역(둥근 셀)을 도시합니다(그림5A,가운데 이미지). 도 5B는 레이저 미세 해부종양 영역(빨간색 선) 및 정상 뇌 조직 영역(파란색 선)의 이미지를 나타낸다. ROI 선택은 관심 영역을 해부하기 위해이루어집니다(그림 5A 및 B,아래쪽 이미지). 우리는 이러한 이미지에서 선택한 영역의 해부에서 성공을 관찰 할 수 있습니다.
RNA 추출은 상용 키트를 사용하여 수행되었다. 후속 RNA 시퀀싱을 위한 mRNA 추출 및 cDNA 라이브러리 제제에 대해 2.5 x 106-7 x 106 μm2 사이의 해부된 조직의 총 면적이 요구되었다는 것을 확인하였다. RNA 품질 관리는 레이저 미세 해부 후 신경교종 조직에서 6 에서 7 사이의 RIN을 결정했습니다. 6의 RIN은 cDNA 라이브러리 준비에 적합한 것으로 결정되었다. RNA 추출 후, 피코몰 농도에서 RNA 격리를 위한 키트를 사용하여 차세대 염기서열 분석에 적합한 cDNA 라이브러리를 생성했습니다.
| RNA의 0.25 ng - 10 ng (1-8 μL) |
| 5x 퍼스트 스트랜드 버퍼의 4 μL |
| 올리고스 믹스 V2 의 1 μL |
| 13 μL의 최종 부피에 뉴클레아제 없는 물 |
표 1: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 8.3 단계에 대한 마스터 믹스 준비.
| 4.5 μL 믹스 V2 |
| 0.5 μL RNase 억제제 |
| 2 μL 역 전사제 |
| 최종 부피 7 μL |
| RNA 샘플 튜브에 7 μL 추가 |
표 2: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 8.5 단계에 대한 마스터 믹스 준비.
| 42 °C 에서 90 분 |
| 70 °C ( 10 분) |
| 4 °C 홀드 |
표 3: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 단계 8.5에 대한 열사이클러 조건.
| 2 μL 뉴클레아제 없는 물 |
| 25 μL 2x PCR 버퍼 |
| 각 반응에 대해 1 μL DNA 폴리머라제 |
| 부드럽게 섞어서 짧게 스핀다운 |
| 각 샘플 튜브에 마스터 믹스 28 μL 추가 |
| 각 튜브에 각 5'와 3' 프라이머의 1 μL을 추가합니다. |
| 반응을 부드럽게 혼합하고 잠시 아래로 돌기 |
표 4: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 8.6 단계에 대한 마스터 믹스 준비.
| 1사이클 |
| 94 °C (1 분) |
| 5 사이클 |
| 98 °C : 15 s |
| 55 °C : 15 s |
| 30s에 대한 68 °C |
| 1사이클 |
| 68 °C : 2 분, 4 ° C 홀드 |
표 5: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 단계 8.6에 대한 열사이클러 조건.
| 16.8 μL 뉴클레아제 없는 물 |
| 2.2 μL 10x R 버퍼 |
| 1.5 μL R v2 |
| 1.5 μL R-프로브 v2 |
표 6: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 8.18 단계에 대한 마스터 믹스 준비.
| 37 °C 60 분 |
| 72 °C 10 분 |
| 4 °C 홀드 |
표 7: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 단계 8.20에 대한 열사이클러 조건.
| 26 μL 뉴클레아제 없는 물 |
| 50 μL CB PCR 버퍼 |
| 2 μL PCR2 프라이머 v2 |
| 2 μL DNA 폴리머라제 |
표 8: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 8.21 단계에 대한 마스터 믹스 준비.
| 1사이클 |
| 94 °C (1 분) |
| X 사이클 |
| 98 °C : 15 s |
| 55 °C : 15 s |
| 30s에 대한 68 °C |
| 1사이클 |
| 68 °C : 2 분, 4 ° C 홀드 |
표 9: RNA 품질 관리 및 라이브러리 준비: 단계 8.21에 대한 열사이클러 조건.
| 1단계 | 2단계 | 3단계 | |
| 방법 1 | 타이로드의 15' | -- | -- |
| 방법 2 | 티로드의 5' | 자당 30% 15' | -- |
| 방법 3 | 티로드의 5' | 4% PFA 10' | -- |
| 방법 4 | 티로드의 5' | 30% 자당 15' | 하룻밤 동안 30 % 자당에서 뇌 |
표 10: 상이한 관류 접근법에 대한 방법.
그림 1: 레이저 미세 해부에 사용되는 마우스 신경교종 모델. (A)잠자는 아름다움 GEMM은 드 노보 신경교종을 개발하는 데 사용. 이미지는 종양 진행을 표시합니다: (i) 플라스미드 주사를 신생아의 측면 심실로 주입, (ii) 종양 부담. (B)신경교종 세포 배양을 이용한 이식가능한 신경교종 모델의 생성. GEMM에서 배양된 신경구 세포는 줄무늬내로 이식됩니다. (C)관류 다음 관류에 포함 된 뇌의 극저온 절제 의 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 크레실 바이올렛 및 에신과 함께 저온 보존 조직 절편을 염색하는 데 사용되는 방법의 개략적 표현. 염색에 사용되는 슬라이드는 RNase가 없는 물로 세척한 도구로 처리되었습니다. 모든 솔루션은 얼룩이 진 날에 RNase/DNase 무료 물로 준비되었습니다. 크레실 바이올렛은 핵을 얼룩지게 하고 Eosin Y 얼룩 세포질 분홍색. 염료를 70% 에탄올에 용해시켰습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 조직 형태및 RNA 무결성을 보존하기 위한 다양한 관류 접근법의 비교. H&E 이미지는 서로 다른 방법으로 관류를 실시한 뇌 조직의 비교 형태를 나타냅니다:(A)15분 동안 Tyrode의 용액,(B)티로드용 용액은 5분, PFA 는 10분,(C)티로데용은 5분, 30%는 15분,(D)티로데용은 5분, 30%는 15분간 수크로오스를 30% 수크로오스로 15분간 담가주며, 티로데용용액은 30% 수크로오스로. RNA 품질 평가는 각 관류 방법에 대해 표시됩니다. 플롯은 18s 및 28s rRNA 피크와 초기 마커 피크를 묘사합니다. 18s 및 28s rRNA의 비율은 RNA 질을 결정하기 위하여 이용됩니다. RNA 단편의 겔 이미지가 플롯의 오른쪽에 표시됩니다. RNA 품질은 RIN 값을 사용하여 평가되었다. RNA 품질은 방법 A, C 및 D. 조직 형태가 우수한 방법 C 및 D. 이 도면의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 장착 및 비장착 신경교종 조직의 대표적인 이미지. (A)H&E로 염색된 조직의 대표적인 이미지. 이 조직은 마운트되지 않은 상태로 남아 있었고 탈수되어 조직에서 휴식과 함께 가난한 형태를 표시했습니다. (B)H&E로 염색한 티슈의 대표적인 이미지와 마운팅 매체로 장착. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 레이저 미세 해부에 사용되는 신경교종 조직의 대표적인 이미지. (A-B) H&E로 염색된 조직의 대표적인 이미지와 LMD를 위해 선택된 다세포 구조 영역. (a)왼쪽에는 LMD에 대해 길쭉한 세포(적색)와 대조군 영역(파란색)의 영역을 선택하였다. (B)오른쪽에는 집단 침공 영역(빨간색)과 제어 영역(파란색)이 LMD에 선택되었습니다. (C)레이저 미세 해부 영역에 대한 대표적인 RNA 품질 관리. 6.5 x 106 μm2의 총 면적을 미세 하해하였다. 분석은 2,346 pg/μL 및 RNA 무결성 번호 (RIN):6.8의 RNA 농도를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경교종 이질성 및 침략의 근본적인 분자 기전을 이해하는 것은 새로운 치료표적13을밝히는 것이 매우 중요하다. 이 원고에서는 레이저 포획 미세 해부(LMD)를 이용한 신경교종 이질성 및 침범의 분자 경관을 분석하고 전사성 분석을 통해 보다 자세하고 최적화된 방법을 설명합니다.
레이저 포획 미세해부(LMD)는 종양 내의 상이한 영역 또는 단일 세포를 식별하는데 사용될 수 있으며,종양(14)의공간 적 맥락을 유지하는 분자 패턴을 추가로 분석하기 위해 특정 샘플을 제공한다. 이러한 기술은 고형종양에서공간 전사체를 분석하는 데 사용되는 다른 방법에 비해 신뢰할 수 있고 저렴한 가격(15)이다. 우리는 LMD를 사용하여 유전자 조작 마우스 종양 모형 또는 두개내 이식형 모형에 있는 신경교종 이질성 및 침략을 분석했습니다. 이 모형은 신경교종 이질성 및 침략의 연구결과10,,12를허용하는 인간 신경교종의 현저한 특성을 되풀이합니다.
고품질 종양 조직 형태및 RNA 무결성을 유지하는 것은 LMD의 한계 중 하나이다. 조직 형태를 개선하기 위해, 우리는 5 분 동안 Tyrode의 용액으로 마우스를 주입한 다음 동일한 용액에 용해 된 30 %의 자당이 있습니다. 일단 뇌가 해부되면, 우리는 하룻밤 동안 또는 뇌가 저장 용기의 바닥에 도달 할 때까지 RNase / DNase무료 물에 용해 30 %의 자당에 보존. 이러한 단계는 조직의 형태를 크게 개선하고 극저온 보존 중에 조직에서 얼음 결정의 형성을 감소시킵니다. 인간 신경교종 조직이 이 프로토콜에 사용되지 는 않았지만, 밤새 30% 자당 용액에서 인간 샘플을 배양하는 것은 저온절 형태를 개선하는 실행 가능한 방법론일 수 있습니다. LMD에 대한 또 다른 가능한 제한은 RNA 무결성 사후 염색8의보존이다. 다른 연구 팀이 RNA-seq 분석에 의하여 신경교종 조직에 레이저 미세 분면을 수행했더라도 그(것)들은 어떤 RNA 및/또는 형태학을 설명하지 않으며 형태학적인 질, 또는 신경교종 동결단에 대한 특정통제16. 이 프로토콜에서 정확한 형태학적 식별은 글리오마 내의 정확한 거세포 구조를 레이저로 미세화하기 위해 필수적이었습니다. 우리는 에탄올 용액으로 신경교종 조직을 고정하고 4 % 크레실 바이올렛과 0.5 % 에오신 Y가 에탄올 유지 RNA 품질에 용해되어 단일 세포 및 다세포 구조의 현미경 식별을 가능하게하는 것을 관찰했습니다. 우리는 마운팅 용액으로 신경교종 섹션을 장착하는 것이 조직의 균열 및 균열 형성을 방지하는 중요한 단계임을 입증했습니다. 에탄올에 용해된 마운팅 매체를 사용하면 조직 형태가 좋지 않을 수 있으므로 마운팅 매체를 물에 준비해야 합니다. 레이저 미세 해부는 RNase가없는 환경에서 가능한 한 빨리 수행되어야합니다. 또한 RNA 품질 관리 및 전사성 분석을 위해 적절한 양의 RNA를 얻기 위해 최대 2.5 x 106 μm2 총 종양/조직 영역을 절제하는 것이 좋습니다.
LMD는 신경교종 이질성과 침략을 조절하는 분자 신호 경로의 분석을 가능하게 합니다. 이 분석은 전임상 신경교종 모형에 있는 진단, 예후 및 미래 번역 발달을 위한 새로운 잠재적인 표적을 밝힐 수 있었습니다.
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Disclosures
이 백서의 모든 저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작업은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, (NIH / NINDS) 보조금: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 M.G.C.; (NIH/닌드) R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311을 P.R.L.에 부여합니다. (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; 미시간 대학의 로겔 암 센터, 채드터프 재단, 레아의 해피 하트 재단에서 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 생물 의학 그랜트 F046166에 신경 외과의 학과, UL1 TR002240 미시간 임상 및 건강 연구 (MICHR), 연구 및 건강 연구 (MICHR) 프로젝트 F049768 미시간 포브스 암 연구소의 A.C. 대학, 실명을 방지하기 위해 연구에서 의사 - 과학자 상, Inc., Inc.,(RPB), NIH의 NEI에서 R01 EY022633을 부여 (AK), 및 안과 및 시각 과학의 부서에 RPB에서 무제한 보조금. 이 연구는 비전 연구 코어 (P30 EY007003) 및 암 센터 연구 코어 (P30 CA046592)를 활용했습니다. AK는 A. 알프레드 타우브만 의학 연구소에서 부인 윌리엄 데이비슨 신흥 학자 상에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
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