Summary
La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.
Abstract
I gliomi sono tumori cerebrali primari caratterizzati dalla loro invasività e eterogeneità. Modelli istologici specifici come pseudopalisades, proliferazione microvascolare, trasformazione mesenchymic e necrosi caratterizzano l'eterogeneità istologica dei gliomi di alta qualità. Il nostro laboratorio ha dimostrato che la presenza di alte densità di cellule mesenchymal, chiamate oncostream, correla con la malignità tumorale. Abbiamo sviluppato un approccio unico per comprendere i meccanismi alla base della crescita e dell'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo completo che utilizza la microdissezione di cattura laser (LMD) e il sequenziamento dell'RNA per analizzare l'espressione mRNA differenziale delle strutture multicellulari eterogenee intra-tumorali (cioè aree mesenchymal o aree di invasione del tumore). Questo metodo mantiene una buona istologia dei tessuti e l'integrità dell'RNA. Perfusione, congelamento, incorporamento, sezionamento e colorazione sono stati ottimizzati per preservare la morfologia e ottenere campioni di microdissezione laser di alta qualità. I risultati indicano che la perfusione di topi portanti con glioma utilizzando il 30% di saccarosio fornisce una buona morfologia e qualità dell'RNA. Inoltre, colorare le sezioni tumorali con 4% Cresyl viola e 0.5% eosina si traduce in una buona colorazione nucleare e cellulare, pur preservando l'integrità dell'RNA. Il metodo descritto è sensibile e altamente riproducibile e può essere utilizzato per studiare la morfologia tumorale in vari modelli tumorali. In sintesi, descriviamo un metodo completo per eseguire LMD che conserva la morfologia e la qualità dell'RNA per il sequenziamento per studiare le caratteristiche molecolari delle strutture multicellulari eterogenee all'interno dei tumori solidi.
Introduction
I gliomi sono i tumori primari più aggressivi del sistema nervoso centrale. Sono altamente invasivi ed eterogenei1. L'analisi dei componenti cellulari e molecolari del tumore rivelerà nuovi bersagli terapeutici.
Tra i diversi metodi attualmente disponibili, la microdissezione di cattura laser (LMD) del tessuto tumorale del cervello congelato è una tecnica affidabile e conveniente che consente l'isolamento di aree anatomiche discrete o specifiche popolazioni cellulari dai tessuti tumorali per studiare il loro profilo molecolare2,3. LMD consente l'analisi dei profili di espressione genica mRNA di singole cellule selezionate o strutture multicellulari4,5. LMD può essere utilizzato per acquisire conoscenze meccanicistiche approfondite sugli eventi molecolari che si svolgono durante la progressione del tumore. Il miglioramento nella lavorazione dei tessuti tumorali è necessario per ottenere una risoluzione ottica ottimale della morfologia dei tessuti e della qualità dell'RNA6. Anche se la fissazione della paraformaldeide è l'opzione migliore per l'analisi morfologica, la qualità dell'RNA è influenzata e degradata in queste condizioni, con conseguente scarsa qualità dell'RNA per l'analisi RNA-seq. L'uso di sezioni di tessuto congelato evita la formazione di cristalli di ghiaccio, che potrebbero rompere le membrane cellulari e produrre fori all'interno delle cellule, e rimane l'opzione migliore per l'analisi RNA-Seq7.
Qui, descriviamo un metodo ottimizzato di fissazione e colorazione delle sezioni per elaborare i tessuti tumorali del cervello del topo congelato per LMD. Per evitare che i cristalli di ghiaccio si formino nel tessuto, abbiamo perfuso i topi con una soluzione di saccarosio del 30%. Questa soluzione interrompe le interazioni tra molecole di acqua polare e impedisce la formazione di cristalli di ghiaccio, preservando la morfologia dei tessuti. La colorazione dei tessuti è necessaria per differenziare e ottenere una popolazione specifica di cellule o aree anatomicamente distinte all'interno del tumore. È essenziale fissare e macchiare il tessuto con coloranti innocui per mantenere l'integrità dell'RNA. È stato precedentemente dimostrato che la colorazione del tessuto con ematossina/eosina (H&E) deteriora l'integrità dell'RNA8. Abbiamo fissato e macchiato il tessuto di interesse con etanolo, Cresyl viola 4% e eosin Y 0.5% soluzioni. Cresyl violet è un colorante acidofilo che macchia il nucleo cellulare con un colore blu scuro. Eosin Y è un coloranti basofilo che macchia i componenti di base delle cellule, fornendo una distinzione tra citoplasma e altre strutture cellulari8. Entrambi i coloranti sono solubili in etanolo e non deteriorano la qualità dell'RNA. Per evitare danni ai tessuti e mantenere un'elevata risoluzione ottica delle strutture cellulari, abbiamo montato le sezioni di tessuto primadell'LMD 9.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui che utilizzano animali sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
NOTA: le neurosfere di Glioma generate da un GEMM o linee stabili possono essere utilizzate per l'innesto del tumore intracranico nei topi10 e lavorate per il sequenziamento di LMD e RNA. Queste cellule estuono constitutivemente luciferata e proteine GFP, che saranno ulteriormente utilizzate per l'analisi della crescita del tumore e la localizzazione.
1. Generazione di un modello di glioma a topo intracranico da neurosfere derivate da modelli di glioma geneticamente ingegnerizzati
- Per generare una coltura primaria di cellule della neurosfera da un modello di topo geneticamente ingegnerizzato (GEMM), utilizzare il protocollo descritto in precedenza10,11.
- Preparare il mezzo di coltura della neurosfera come descritto: 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 (DMEM/F12) integrato con 10 mL di 50x B-27 e 5 mL di integratori di coltura neuronale 100x N-2, 5 mL di 100x Antibiotic-Antimycotic e 1 mL di Normocin. Prima di placcare le neurosfere, aggiungere 20 ng/mL ricombinante umano EGF e FGF al mezzo di coltura.
- Neurosfere di glioma di coltura in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 2-3 giorni prima dell'innesto tumorale intracranico.
- Il giorno dell'intervento, raccogliere le neurosfere del glioma e ruotarle a 550 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Per dissociare le neurosfere, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di distacco cellulare e incubare a 37 c e 5% di CO2 per 2-4 min. Dopo il periodo di incubazione, pipette le neurosfere su e giù con una micropipetta da 1 mL per garantire una sospensione a singola cellula.
- Disattivare la soluzione di distacco delle celle diluindo la sospensione della neurosfera con 10 mL di supporti DMEM/F12 non integrati. Girare le neurosfere a 550 x g per 5 min a temperatura ambiente. Con attenzione, rimuovere il super-natante.
- Risospendere il pellet cellulare in 100 -L di supporti DMEM/F12 senza integratori. Fare una diluizione 1:50 della sospensione cellulare, quindi aggiungere 50 -L di Trypan Blue per contare le cellule vitali. Utilizzare la seguente formula per determinare la concentrazione delle cellule:
cells/mL : [((celle contate per quadrato) / numero di quadrati contati) x 50 x 10.000 celle/mL] - Dopo aver determinato il numero di cellule, per raggiungere una concentrazione obiettivo di 30.000 cellule/L in volume 100, ruotare le neurosfere verso il basso e rispenderle nel volume appropriato di DMEM/F12 senza supplementi.
- Posizionare le neurosfere in un tubo pre-etichettato da 0,6 mL sul ghiaccio.
- Preparare soluzioni di lavoro di anestesia, analgesica, e anestesia prima dell'impianto: per l'anestesia ketamanzia/dexmedetomidine, aggiungere 0,6 mL di 100 mg/mL di idrocloruro di ketamina e 0,8 mL di 0,5 mg/mL di idrocchloride dexmedetomidine a sterile 8,6 mL di 0,9% NaCl contenente vial. Per l'analgesica buprenorfine, aggiungere 1 mL di 0,3 mg/mL di buprenorphine a 9 mL di 0,9% NaCl contenente fiala. Per l'inversione dell'anestesia dell'anestesia atipamezolo, aggiungere 1 mL di atipamezolo 5 mg/mL a 9 mL di 0,9% NaCl contenente fiala.
- Utilizzare topi femminili C57BL/6J di 6-8 settimane per l'innesto di tumore intracranico.
- In una stanza omologata per la chirurgia di sopravvivenza dei roditori, impostare forniture sterili per l'innesto di tumore intracranico. Eseguire interventi chirurgici su un telaio stereotassico roditore dotato di una siringa sterilizzata da 10 l Hamilton con un ago 33G rimovibile. Utilizzare uno sterilizzatore di perline per sterilizzare gli strumenti tra gli interventi chirurgici.
- Anestetizza i topi con una singola iniezione intraperitoneale (i.p.) della soluzione anestetica preparata al passo 1.11 (ketamina:75.0 mg/kg e dexmedetomidine:0.5 mg/kg). Approssimativamente, un volume di 250 l della soluzione anestetico sarà consegnato a un mouse del peso di 20 g. Assicurarsi che il mouse non risponda al riflesso del pedale prima di procedere.
- Una volta che il topo è in uno stato profondamente anetizzato, applicare lubrificante sterile petrolato oftalmico agli occhi per evitare l'essiccazione. Rasare la pelliccia sul cranio del topo. Applicare 10% povidone-iodio soluzione topica per l'area rasata al fine di disinfettare.
- Fissare il cranio del mouse in una cornice stereotassica. In primo luogo, aprire con attenzione la bocca con pinze e tirare delicatamente la lingua e spostarlo su un lato della bocca per evitare soffocamento. Tenere la bocca aperta con le pinze e posizionare gli incisivi superiori nel buco della serratura della barra dei denti sul telaio stereotassico.
- Tenendo la testa del topo per le orecchie, posizionare le barre dell'orecchio contro le ossa postorbitali e fissarle. Assicurarsi che il cranio del mouse sia livellato con il tavolo chirurgico. Fissare le barre dell'orecchio con attenzione senza applicare pressione contro il cranio. Successivamente, fissare con attenzione la barra del naso.
- Utilizzando una lama bisturi di taglia 15, fare un'incisione lungo la testa del mouse, esponendo il cranio. Ritrarre la pelle nel sito di incisione utilizzando retrattili Colibri. Utilizzare un applicatore sterile per rimuovere tutto il tessuto pericranico.
- Identificare il bregma e abbassare l'ago della siringa Hamilton direttamente su di esso. Utilizzando il telaio, posizionare l'ago 1 mm anteriore del bregma e 1,5 mm laterale. Utilizzando un ago 26G, segnare questo punto segnando il cranio.
- Utilizzare un trapano di potenza cordless dotato di una punta di perforazione da 0,45 mm per creare un foro di bava nel sito di destinazione. Forare fino a raggiungere la dura mater sottostante. Estrarre con cura l'osso rimanente nel foro della bava con un ago da 26G.
- Utilizzando una pipetta, omogeneizzare accuratamente le cellule e disegnare 7 L della sospensione della neurosfera nella siringa. Per assicurarsi che la siringa funzioni correttamente, erogare 1 o più di una sospensione su un cuscinetto ammollato di alcol al 70%.
- Abbassare l'ago alla superficie della dura mater. Abbassare la siringa 3,5 mm ventrale e ritrarre 0,5 mm. Questo creerà uno spazio di 0,5 mm nel cervello per le neurosfere da depositare quando iniettato.
- Lasciare l'ago in posizione per 2 min per l'equilibratione. Lentamente e senza intoppi fornire 1 L l delle cellule nel corso di 1 min.
- Utilizzando soluzione salina sterile, lavare la superficie del cranio tre volte. Distribuisci le cellule in eccesso nella siringa su un tampinno allievio del 70% e pulisci l'ago con un altro tamponitta alcool del 70%. Sciacquare la siringa con PBS sterile per evitare intasamenti dell'ago.
- Rimuovere i retrattori e prendere con attenzione il mouse fuori dal telaio stereotassico. Chiudere l'incisione utilizzando suture di nylon 3-0, pinze e un driver ad ago.
- Amministrare l'atomezolo (1,0 mg/kg), circa 100 -L per un topo da 20 g. Somministrare buprenorfine (0,1 mg/kg sottocutaneo) sottocutaneamente, circa 70 l per un topo da 20 g. Mettere i topi post-chirurgici in una gabbia di recupero pulita e monitorarli fino a quando non sono all'erta e attivi.
2. Perfusione animale e conservazione del cervello
- Per monitorare la progressione del tumore, determinare la bioluminescenza in vivo utilizzando un sistema di imaging in vivo fino a quando gli animali mostrano segni di carico tumorale. Eutanasia i topi quando raggiungono un segnale compreso tra 106 a 107 fotone/s.
- Anestesizza i topi che mostrano segni di carico tumorale con iniezione intraperitoneale (i.p.) di ketamina (75,0mg/kg) e dexmedetomidine (0,5 mg/kg). Consegnare circa 250 l a un topo del peso di 20 g. Quindi, assicurarsi che il mouse non risponda al riflesso del pedale.
- Usando le pinze, tenere la pelle sopra la cavità peritoneale, e utilizzando un grande paio di forbici di scremazione fare un'incisione "Y" penetrando la parete peritoneale, forare il diaframma, e poi tagliare la gabbia toracica.
- Inserire una cannula da 20G smussata nel ventricolo sinistro del cuore del mouse. Quindi snip l'atrio destro del cuore per consentire l'essanguinazione.
- Consentire alla soluzione di Tyrode ossigenato (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl2, 0,005% NaH2PO4, 0,1% glucosio, 0,1% NaHCO3, 0,02% KCl) di fluire attraverso il sistema circolatorio del topo fino a quando il fegato e i polmoni non si sono completamente eliminati a causa della rimozione del sangue (5min).
- Continuare a perfondere l'animale con una soluzione di saccarosio del 30% disciolta nella soluzione di Tyrode per ulteriori 15 min. Per valutare il successo della perfusione, confermare che il collo, la coda e le gambe sono rigide post 30% circolazione di saccarosio.
- Utilizzando un piccolo paio di forbici dissezione, tagliare il cuoio capelluto alla linea mediana. Partendo dall'osso occipitale e lavorando in avanti verso il muso. Questo esporrà il cranio.
- Utilizzando un paio di rongeurs, sfondare il cranio a partire dall'osso occipitale e continuare in avanti per esporre totalmente le superfici del cervello. Quindi girare il lato della testa verso l'alto e sezionare i nervi alla base del cervello per rilasciarlo dal cranio.
- Preparare una soluzione di saccarosio al 30% con acqua libera da RNase e filtrarla attraverso un filtro a rete di nylon da 40 m per ridurre la degradazione dell'RNA.
- Per massimizzare l'infiltrazione della soluzione di saccarosio, posizionare i cervelli sezionati in una soluzione di saccarosio del 30% e conservarli a 4 gradi durante la notte. Prima di un'ulteriore elaborazione assicurarsi che il cervello raggiunga il fondo dei tubi contenenti la soluzione di saccarosio.
3. Crioconservazione del cervello che ospita tumori del glioma
- Prima di crioconservare il cervello, preparare un barattolo pieno di freddo èopentane/2-methylbutane e mettere il vaso in un contenitore pieno di azoto liquido. Lasciare raffreddare il solvente.
- Togliere il cervello dalla soluzione di saccarosio 30% e asciugarlo su una carta da filtro.
- Etichettare il criomuff con un pennarello permanente. Con attenzione, aggiungere circa 5 mL di OCT (composto di temperatura di taglio ottimale) al centro del criomuffare bolle d'aria.
- Posizionare il cervello in criomuffare contenente OCT nell'orientamento desiderato. Riempire lo stampo con OCT fino a quando il cervello è completamente immerso. Utilizzando pinze pulite, posizionare rapidamente il criostampo con OCT e il cervello nel freddo èopentane/2-metilbutane.
- Una volta che il OCT si solidifica (30-40 s), rimuovere il criostampo con il cervello e metterlo nel ghiaccio secco. Non lasciare lo stampo contenente il cervello in 2-metilbutane oltre 2 min in quanto ciò può causare crepe nel solido OCT. Avvolgere il criomuff con il cervello in un foglio di alluminio e conservarlo a -80 gradi centigradi.
4. Sezionamento dei tessuti tumorali cerebrali congelati
- Etichetta 2 diapositive di naftalato di polietilene m (PEN) con le informazioni di esempio. Le sezioni tissutali saranno posizionate direttamente su queste diapositive seguendo la sezionamento.
- Impostare la temperatura della camera criostatica compresa tra -20 e -24 gradi centigradi. Prima di sezionare, posizionare il blocco campione nella camera criostat e lasciare che ecchesca alla temperatura nella camera per 30-60 min.
- Pulire la camera criostatista e il portacoltelli con 100% etanolo e spruzzare le spazzole da utilizzare con la soluzione di pulizia RNase. Lavorando all'interno della camera criostatta, rimuovere lo stampo e collegare il blocco dello STRUMENTO di personalizzazione di Office contenente il cervello al disco del campione criostato con l'OCT. Posizionare il blocco nel supporto del disco e allineare il blocco con la lama del coltello.
- Installare una lama usa e getta nel supporto di sezionamento.
- Sezionare il cervello a 10 m di spessore. Assicurarsi che non ci siano striature o linee di graffio nel tessuto. Utilizzando un pennello, appiattire con cautela e sbarrare il tessuto sulla superficie di taglio.
- Montare con attenzione il tessuto contenente le sezioni cerebrali su vetrini di vetro PEN liberi rNase. Capovolgere i vetrini di vetro caricati positivi con le dita in direzione del tessuto e premere agevolmente il vetro scivolare verso il basso verso la sezione del tessuto.
NOTA: La temperatura delle mani aiuterà il tessuto ad attaccarsi al vetro. - Dopo aver montato le sezioni cerebrali sui vetrini, tenere i vetrini in una scatola all'interno della camera criostatta e poi conservarli a -80 gradi centigradi. Non tenere mai gli scivoli a temperatura ambiente.
NOTA: Piegatura del tessuto e lacerazione sono comuni. Per un'accurata analisi posteriore, è importante ridurre al minimo questi artefatti.
5. Fissazione e colorazione delle sezioni del tessuto cerebrale crioconservato
- Per preservare l'integrità dell'RNA, pulire tutti gli strumenti da utilizzare con la soluzione di pulizia RNase. Procedere con il protocollo di fissaggio e colorazione all'interno di un cofano di fumi.
- Preparare le soluzioni fissative descritte in tubi RNase free 50 mL puliti. Rendi tutte le soluzioni con RNase acqua libera il giorno della colorazione.
- Stesso giorno verrà eseguita la microdissezione laser, preparare soluzioni 100%, 95%, 70% e 50% etanolo. Conservare le soluzioni in tubi ben chiusi a temperatura ambiente.
- Preparare il 4% di Violet Cresyl e lo 0,5% eosin Y nella soluzione 75% di etanolo. Vorticare vigorosamente la soluzione per 1 min e filtrarli attraverso un filtro di nylon 0,45 m per eliminare tracce di polvere non disciolta.
- Mettere i vetrini di tessuto in un contenitore con 95% etanolo per 30 s. Trasferire i vetrini al tubo contenente 75% etanolo; lasciare diapositive lì per 30 s.
- Trasferire le diapositive al 50% di etanolo e lasciarli lì per 25 s. A questo punto, lo Strumento di personalizzazione di Office verrà sciolto. Trasferire la soluzione di scorrimento al 4% Cresyl violetto per 20 s, quindi trasferire a 0.5% eosin Y soluzione per 5 s.
- Togliere il vetrino dalla soluzione di tintura e asciugare il vetrino con una carta da filtro. Quindi, inserire i vetrini nel 50% di etanolo per 25 s. Trasferire le diapositive al 75% di etanolo per 25 s. Trasferire le diapositive al 95% di etanolo per 30 s. Trasferire i vetrini al 100% etanolo per 60 s.
- Sciacquare lo scivolo con lo xilene. Trasferirli in un contenitore con xilene e attendere 3 min.
- Preparare il supporto di montaggio (ad esempio, la gomma Pinpoint) in acqua priva di RNase. Per montare le sezioni del cervello del topo, diluire il supporto di montaggio in acqua senza RNase con un rapporto di 1:10.
- Asciugare i vetrini su una superficie senza RNase a temperatura ambiente per 10 s. Prima che lo xilene si sciolda, procedere al montaggio dei vetrini con le sezioni del tessuto.
- Disperdere delicatamente la soluzione di montaggio sopra il tessuto sullo scivolo con un pennello sottile sterile e senza RNase. Attendere 10-20 s, quindi trasferire immediatamente i vetrini del tessuto alla piattaforma di microscopia al microscopio.
NOTA: Il rapporto tra il supporto di montaggio e l'acqua senza RNase utilizzata per il montaggio varia a seconda del tessuto di interesse. Il rapporto medio/acqua di montaggio mantiene la morfologia del tessuto glioma per la microdisezione laser senza influire sull'integrità dell'RNA.
6. Microdissezione di cattura laser
NOTA: Un microscopio a microdissezione di cattura laser deve essere utilizzato per microdissect laser specifiche aree di interesse all'interno del tessuto tumorale. Per ridurre al minimo il tempo necessario per la microdissezione laser tissutale, preparare il microscopio LMD prima della fissazione e della colorazione.
- Per avviare il sistema, accendere prima la striscia di alimentazione, seguita dall'accensione del laser. Quindi, accendere il controller del microscopio e il computer. Avviare il software LMD.
- In Controllo microscopioselezionare l'ingrandimento 10volte. In Controllo laser, impostare i parametri laser per la dissezione dei tessuti. Impostare una frequenza laser di 120 Hz per ottenere i migliori risultati di taglio. Impostare sempre la corrente laser al 100%.
- Per una microdissezione laser accurata, impostare la velocità a 10 e un'impostazione di apertura a 2,0-10,0 m. Impostare la potenza su 53. Avere la potenza laser ad un'impostazione superiore può causare l'incisione del vetro.
- Caricare il collettore di tessuti che catturerà il tessuto dopo la dissezione. Fare clic sul secondo pulsante di scaricamento. Rimuovere il collettore vuoto e posizionare i tubi di testa piana da 0,5 mL PCR liberi da 0,5 mL contenenti 30 - L di tampone di lisi nel collettore. Posizionare nuovamente il raccoglitore nella macchina e fare clic su Continua sul software per procedere.
- Caricare il campione lavorato (fisso e macchiato) al microscopio. Innanzitutto, fare clic su Scarica sul software LMD. Successivamente, montare il campione sul supporto scorrevole e posizionarlo sullo stage. Fare clic su Continua sul software per procedere.
- In Finestre Taglia forme, selezionare Disegna e Taglia. Utilizzare i controlli del microscopio per trovare l'area di interesse. Disegnare la regione di interesse (ROI) e selezionare un tubo di raccolta di destinazione. È possibile disegnare più ROI per micro sezionare diverse aree da una singola diapositiva allo stesso tempo.
- Fare clic su Avvia taglio per procedere alla micro dissezione dei tessuti. Dopo aver sezionato le aree di interesse rimuovere i tubi di raccolta dal supporto e posizionare i tubi sul ghiaccio secco. Trasferire i campioni di tessuto di RNA raccolti a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
7. Isolamento dell'RNA del tessuto glioma micro-sezionato
- Per l'estrazione di RNA da LMD utilizzare un kit di isolamento RNA ottimizzato per piccoli campioni e bassa resa dell'RNA (vedere Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni di fabbricazione. Eseguire tutte le fasi di isolamento a temperatura ambiente (25 gradi centigradi). Per mantenere la qualità dell'RNA, lavorare rapidamente. Preparare tutte le soluzioni come indicato dal produttore.
- Regolare il volume del campione a 350 gradi con il buffer di lisi con 1% di mercaptoetanolo. Vorticare il campione per 40 s al fine di ridurre la viscosità del campione e aumentare l'efficienza della colonna di spin di eluizione dell'RNA.
- Trasferire l'intero campione in una colonna di spin dell'eliminatore gDNA collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare il tubo per 30 s a 8.000 x g. Salvare il flow-through e assicurarsi che nessun liquido è lasciato sulla colonna dopo la centrifugazione.
- Aggiungere al flusso attraverso il flusso e mescolare bene pipettando su e giù. Trasferire il campione in una colonna di spin di eluizione dell'RNA collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g. Eliminare il flow-through, salvando la colonna.
- Aggiungete 700 l di buffer di lavaggio dell'RNA 1 (20% di etanolo, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) alla colonna di spin di elizione dell'RNA. Chiudere delicatamente il coperchio e centrifugare per 15 s a 8.000 x g per lavare la membrana della colonna di spin. Eliminare il flusso attraverso.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione la colonna di spin di eluizione dell'RNA dal tubo di raccolta in modo che la colonna non contatti il flusso attraverso.
- Aggiungere 500 l del secondo buffer di lavaggio dell'RNA (etanolo 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) alla colonna di spin. Chiudere il coperchio della colonna e girare 8.000 x g per 20 s per lavare la membrana della colonna. Eliminare il flusso attraverso.
- Per lavare la colonna di eluizione dell'RNA, aggiungere 500 lun dell'80% di etanolo, chiudere il coperchio della colonna e centrifugare a 8000 x g per 2 min. Gettare i tubi con la soluzione di eluizione.
- Utilizzare un nuovo tubo di raccolta, aprire il coperchio della colonna di spin e centrifugare a 8000 x g per 5 min per asciugare la colonna. Eliminare il tubo di eguagliazione.
- Posizionare la colonna di spin di eluzione dell'RNA in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungete 12 gradi di acqua libera da RNase riscaldata a 37 gradi centigradi direttamente al centro della membrana della colonna di spin. Attendere 4 min e centrifugare per 1 min a piena velocità per eluire l'RNA.
8. Controllo della qualità dell'RNA, preparazione della libreria e analisi RNA-Seq
- Dopo l'estrazione e la purificazione dell'RNA, amplificare l'RNA e creare una libreria cDNA utilizzando un kit speciale adatto per l'isolamento dell'RNA alle concentrazioni pico-molare seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del produttore. Pulire la postazione di lavoro per evitare la contaminazione con altri prodotti PCR e la degradazione nucleata dei campioni.
- Se l'RNA ha un valore RIN maggiore di 4, il che significa che l'RNA è di buona qualità o solo parzialmente degradato, procedere con la fase di frammentazione. Preparare tutti gli elementi sul ghiaccio.
- Create una combinazione principale come indicato (Tabella 1). Creare una miscela di reazione in un tubo PCR senza nuclesi. Incubare i tubi a 94 gradi centigradi in un ciclore termico a caldo. Il tempo di incubazione della frammentazione dipende dalla qualità dell'RNA. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
- Dopo l'incubazione, posizionare i tubi su un rack di refrigeratori PCR che è stato precedentemente raffreddato a -20 gradi centigradi e lasciarlo seduto per 2 min.
- Per ogni campione di tubo di RNA, preparare il primo mix master di reazione di sintesi del filamento (Tabella 2). Incubare i tubi in un ciclore termico a caldo a condizioni descritte nella tabella 3. I prodotti cDNA possono essere congelati a -20 gradi centigradi fino a due settimane prima di procedere al passo successivo.
- Create la combinazione principale PCR come indicato nella tabella 4. Posizionare i tubi in un riciclatore termico del coperchio caldo ed eseguire la reazione PCR nelle impostazioni indicate nella tabella 5.
- Lasciare che le perline, che verranno utilizzate per purificare il DNA, si scaldino a temperatura ambiente. Una volta riscaldato, aggiungere 40 l delle perline ad ogni campione. Vorticare i tubi per mescolare e girare verso il basso brevemente per raccogliere il liquido sul fondo del tubo. Lasciare che i tubi incubano a temperatura ambiente per 8 min per consentire al DNA di legarsi alle perline.
- Posizionare i tubi su un dispositivo di separazione magnetica e lasciare in sedile per circa 5 min, o fino a quando la soluzione diventa completamente chiara. Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante con attenzione senza disturbare le perline.
- Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline da lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
- Ruotare brevemente i tubi e riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline.
- Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 5 min. Non lasciate stare più a lungo come le perline saranno su asciutto.
- Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 52 l'acqua senza nuclesino per coprire le perline. Rimuovere i tubi dal dispositivo di separazione e pipetta su e giù fino a quando tutte le perline sono risospese. Incubare a 5 min a temperatura ambiente.
- Riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione fino a quando la soluzione non diventa chiara, circa 1 min. Trasferire 50 gradi l del supernatale risultante ai pozzi di una striscia di 8 pozze. Aggiungere 40 -L di nuove perline ad ogni campione. Vortice accuratamente per mescolare. Lasciare che le perline si leghino al DNA incubando a temperatura ambiente per 8 min.
- Durante questo periodo di incubazione, iniziare a scongelare i componenti da utilizzare per qualsiasi rRNA presente nei campioni. Una volta scongelati, metteteli sul ghiaccio. Inoltre, preriscaldare un ciclore termico a 72 gradi centigradi.
- Posizionare i campioni sul dispositivo di separazione magnetica fino a quando la soluzione non si schiarisce (circa 5 min). Aliquota 1,5 l di sonde per campione a un tubo PCR refrigerato. Collocare il tubo nel ciclore termico preriscaldato sotto le impostazioni di 72 gradi centigradi per 2 e 4 gradi centigradi.
- Mantenendo i tubi campione nel dispositivo di separazione magnetica, rimuovere il supernatante con un pipet senza disturbare le perline. Quindi aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline per lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
- Ruotare brevemente i tubi e riposizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline. Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 2 min. Non lasciatevi sarescire più a lungo come le perline saranno su asciutto.
- Preparare la combinazione principale per tutti i campioni combinando i seguenti componenti nell'ordine indicato(Tabella 6).
- Mescolare il master colmo vortice ndolo e aggiungere 22 l del mix alle perline essiccate di ogni campione e mescolare accuratamente per risospendere. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Ruotare i tubi e posizionarli sul dispositivo di separazione magnetica per 1 minuto o fino a quando i campioni diventano chiari. Trasferire 20 l del supernatante, senza disturbare le perline su nuovi tubi PCR. Posizionare i tubi in un riscaldatore termico preriscaldato sotto le impostazioni della tabella 7.
- Preparare un master mix PCR per un numero sufficiente di reazioni per ogni campione. Aggiungere i seguenti componenti alla combinazione principale nella tabella 8indicata. Aggiungete 80 l della miscela master PCR a ciascuno dei tubi campione dal punto 8.20 e posizionatelo nel termotermico alle seguenti impostazioni (Tabella 9).
- Consentire alle perline, che verranno utilizzate per purificare il DNA, riscaldare a temperatura ambiente. Una volta riscaldato, aggiungere 100 l di perline ad ogni campione. Lasciare che i tubi incubano a temperatura ambiente per 8 min per consentire al DNA di legarsi alle perline.
- Posizionare i tubi su un dispositivo di separazione magnetica e lasciare in sedile per circa 5 min, o fino a quando la soluzione diventa completamente chiara.
- Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante con attenzione senza disturbare le perline.
- Mantenendo i tubi sul dispositivo di separazione, aggiungere 200 l di etanolo appena fatto 80% alle perline da lavare senza disturbare le perline. Attendere 30 s prima di rimuovere l'80% di etanolo. Ripetere questo passaggio.
- In breve, ruotare verso il basso i tubi e posizionare i tubi sul dispositivo di separazione. Rimuovere qualsiasi etanolo residuo dell'80% senza disturbare le perline.
- Lasciare asciugare l'aria dei tubi con i tappi aperti per 5 min. Non lasciatevi sarescire più a lungo come le perline si asciugano troppo. Pipette 20 L di Tris Buffer al pellet essiccato. Rimuovere il tubo dal dispositivo di separazione e mescolare accuratamente con un pipet per risospendere le perline. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare i tubi sul dispositivo di separazione per 2 min, o fino a quando la soluzione diventa chiara. Acquisire il supernatante e trasferirlo in nuovi tubi. Quindi conservare la soluzione raccolta a -20 gradi centigradi.
- Controllare le librerie finali necessarie per il controllo della qualità e della quantità. Raggruppare i campioni, raggruppati e sequenza, come ad accoppiamento-end 50 nt letture, secondo i protocolli consigliati dal produttore.
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Representative Results
Il nostro laboratorio ha generato un modello murino geneticamente ingegnerizzato (GEMM) utilizzando il sistema di trasposasi di bellezza del sonno (Figura 1A). Questo sistema incorpora specifiche alterazioni genetiche nel genoma delle cellule progenitrici neurali nei topi neotopatici. Queste cellule progenitrici alterate formano tumori glioma endogeni. Le sequenze di plasmide utilizzate per generare i tumori erano: (1) pT2C-LucPGK-SB100X per trasposoni di Sleeping Beauty & luciferasi espressione, (2) pT2-NRASSV12 per l'espressione NRAS, (3) pT2-shp53-GFP4 per l'espressione di proteina p53 knock-down e GFP e (4) pT2-shATRx-GFP4 per knock-down ATRX. I plasmidi sono stati iniettati nel ventricolo laterale di cuccioli neonatale di 1 giorno, come descritto in precedenza11. L'assorbimento e la formazione di tumori sono stati monitorati tramite il sistema di imaging a bioluminescenza in vivo. Una volta che i topi portatori di tumore mostravano segni di peso tumorale, venivano sacrificati. I tumori sono stati usati per generare colture di neurosfera o direttamente crioconservati per l'elaborazione LMD (Figura 1A).
Le colture cellulari iniziate dal GEMM sono state utilizzate per generare un modello di glioma traducibile (Figura 1B). Le neurosfere di Glioma derivate dai tumori GEMM sono state coltivate e impiantate intracranicamente nello striato di topi immuno-competenti. Sospensioni a singola cellula ottenute dalla coltura delle neurosfere sono state utilizzate per generare tumori del glioma mediante impianto intracranico come descritto in precedenza dal nostro laboratorio10,11,12. Questa metodologia consente un'attenta quantificazione del numero di cellule da impiantare per topo (30.000 cellule/1 l/mouse). Questo protocollo consente la riproducibilità dei risultati tra diversi impianti sperimentali. Tuttavia, l'impianto delle neurosfere potrebbe essere un'opzione alternativa per generare tumori del glioma del topo e successive analisi LMD e RNA-Seq. Tuttavia, questo metodo è considerato più accurato. La progressione del tumore è stata monitorata dal sistema di imaging dello spettro di bioluminescenza in vivo. I topi che mostrano segni di carico tumorale sono stati transcardialmente perfusi e il cervello è stato crioconservato per l'elaborazione LMD (Figura 1C).
Le sezioni di tessuto sono state microdissecazioni laser per caratterizzare il trascrittoma delle strutture multicellulari all'interno dei gliomi. Le procedure di perfusione, congelamento e incorporamento descritte sono state ottimizzate per preservare la morfologia dei tessuti e ottenere RNA di buona qualità dopo la microdissezione laser. Sono stati valutati diversi approcci di perfusione al fine di acquisire tessuti con morfologia superiore e integrità dell'RNA(tabella 10). Per sezionare le aree di interesse, è stato necessario macchiare il tessuto con coloranti innocui per l'RNA (Figura 2). Abbiamo osservato che perfondere il tumore che porta il topo con la soluzione di Tyrode per 5 min, e poi 30% saccarosio per 15 min, seguito da stoccaggio notturno del cervello sezionato nel 30% di saccarosio conserva morfologia e integrità dell'RNA del tessuto tumorale (Figura 3D). La perfusione con soluzione di saccarosio del 30% ha impedito la formazione di cristalli di ghiaccio all'interno del tessuto. Anche se, la fissazione del tessuto di paraformaldeide ha portato ad una morfologia tissutale di alta qualità, l'integrità dell'RNA è stata influenzata negativamente (Figura 3B). Altri approcci come la soluzione di Tyrode per 5 min o la soluzione di Tyrode per una soluzione di 5 min - 30% di saccarosio per 15 min (Figura 3A e C) non hanno influenzato la qualità dell'RNA. In queste condizioni, i cervelli non sono stati conservati nel 30% di saccarosio durante la notte; abbiamo osservato una risoluzione ridotta nella morfologia dei tessuti.
Abbiamo eseguito varie tecniche di colorazione seguite dall'analisi del controllo della qualità dell'integrità dell'RNA. Abbiamo osservato che il 4% di VioletCresyl e lo 0,5% di colorazione eosinA Y erano sufficienti per identificare le strutture multicellulari del glioma e mantenere l'integrità dell'RNA. Il violettacre cresilo è un colorante acidofilo che macchia il nucleo delle cellule di colore blu scuro. Eosin Y è un coloranti basofilo che macchia i componenti di base delle cellule.
Abbiamo osservato che se il tessuto non era montato con il mezzo di montaggio, le sezioni si sono disidratate e la morfologia si è deteriorata (Figura 4A). Per mantenere la morfologia dei tessuti di alta qualità, abbiamo montato il tessuto con il mezzo di montaggio. Abbiamo osservato che il 15% del mezzo di montaggio disciolto in acqua (30 gradi in 200 l di acqua) ha mantenuto la morfologia dei tessuti di alta qualità (Figura 4B).
Nella Figura 5Avengono illustrate le aree di eterogeneità del glioma. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio di microdissezione laser di cattura precedente alla dissezione. Le linee rosse raffigurano aree con abbondanti cellule mesenchymal (cellule allungate). Le linee blu rappresentano aree senza celle mesenchymal (celle arrotondate) (Figura 5A, immagine media). Figura 5B mostra immagini di aree tumorali laser micro-sezionate (linee rosse) e aree normali del tessuto cerebrale (linee blu). La selezione del ROI viene effettuata per sezionare le aree di interesse (Figura 5A e B, immagini inferiori). Possiamo osservare in queste immagini il successo nella dissezione delle aree selezionate.
L'estrazione dell'RNA è stata eseguita utilizzando un kit commerciale. È stato determinato che per l'estrazione dell'mRNA e la preparazione della libreria cDNA era necessaria una superficie totale del tessuto sezionato tra 2,5 x 106 - 7 x10 6 m2 per l'estrazione dell'mRNA e la preparazione della libreria cDNA per il successivo sequenziamento dell'RNA. Il controllo della qualità dell'RNA ha determinato un RIN tra 6 e 7 nel tessuto glioma dopo la microdissezione laser. Un RIN di 6 è stato ritenuto appropriato per la preparazione della libreria cDNA. Dopo l'estrazione dell'RNA, è stato utilizzato un kit per l'isolamento dell'RNA a concentrazioni di picomolare per generare una libreria cDNA adatta per il sequenziamento di prossima generazione.
| 0,25 ng - 10 ng (1-8 ) di RNA |
| 4 l'l del buffer 5x First-Strand |
| 1 - L dell'Oligos Mix V2 |
| Acqua senza nuclesino fino al volume finale di 13 l |
Tabella 1: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Preparazione Master Mix per il passaggio 8.3.
| 4,5 -L Mix V2 |
| 0,5 l inibitore di RNase |
| 2 - Trascrizione inversa |
| Volume finale di 7 l |
| Aggiungere il 7: l'l al tubo del campione di RNA |
Tabella 2: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Preparazione Master Mix per il passaggio 8.5.
| 42 gradi centigradi per 90 min |
| 70 gradi centigradi per 10 min |
| Blocco a 4 gradi centigradi |
Tabella 3: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Condizioni del termociclore per il passaggio 8.5.
| 2 acqua senza nuclesino |
| 25 -L 2x buffer PCR |
| 1 -L Polimerasi del DNA per ogni reazione |
| Mescolare delicatamente e girare verso il basso brevemente |
| Aggiungere 28 l del mix master a ciascuno dei tubi campione |
| Aggiungere 1 l l di ogni 5' e 3' primer ad ogni tubo |
| Mescolare delicatamente le reazioni e scendere brevemente |
Tabella 4: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Preparazione Master Mix per il passaggio 8.6.
| 1 ciclo |
| 94 gradi centigradi per 1 min |
| 5 cicli |
| 98 gradi centigradi per 15 s |
| 55 gradi centigradi per 15 s |
| 68 gradi centigradi per 30 s |
| 1 ciclo |
| 68 gradi centigradi per 2 min, 4 gradi centigradi |
Tabella 5: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Condizioni del termociclore per il passaggio 8.6.
| 16,8 l'acqua senza nucle |
| 2,2 -L 10x Buffer R |
| 1,5 R v2 |
| 1,5 R-Probe v2 |
Tabella 6: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Preparazione Master Mix per il passaggio 8.18.
| 37 gradi centigradi 60 min |
| 72 gradi centigradi 10 min |
| Blocco a 4 gradi centigradi |
Tabella 7: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Condizioni del termociclore per il passaggio 8.20.
| 26 acqua senza nuclesino |
| Buffer PCR CB da 50 lla |
| 2 Primer PCR2 v2 |
| 2 -L DNA Polymerase |
Tabella 8: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Preparazione Master Mix per il passaggio 8.21.
| 1 ciclo |
| 94 gradi centigradi per 1 min |
| Cicli X |
| 98 gradi centigradi per 15 s |
| 55 gradi centigradi per 15 s |
| 68 gradi centigradi per 30 s |
| 1 ciclo |
| 68 gradi centigradi per 2 min, 4 gradi centigradi |
Tabella 9: Controllo della qualità dell'RNA e preparazione della libreria: Condizioni del termociclore per il passaggio 8.21.
| Fase 1 | Fase 2 | Fase 3 | |
| Metodo 1 | Tyrode's 15' | -- | -- |
| Metodo 2 | Tyrode's 5' | Saccaro3% 15' | -- |
| Metodo 3 | Tyrode's 5' | 4% PFA 10' | -- |
| Metodo 4 | Tyrode's 5' | 30% Dicarosio 15' | Cervello nel 30% di saccarosio durante la notte |
Tabella 10: Metodi per diversi approcci di perfusione.
Figura 1: Modelli di glioma del topo utilizzati per la microdissezione laser. (A)Bellezza addormentata GEMM utilizzata per sviluppare de novo glioma. Le immagini mostrano progressione tumorale: (i) iniezione di plasmide nel ventricolo laterale dei neonati, (ii) carico tumorale. (B) Generazione di un modello di glioma trapiantato con colture cellulari al glioma. Le cellule della Neurosfera coltivate a base di GEMM vengono impiantate intracranicamente nello striato. (C) Rappresentazione di crio-sezione del cervello incorporato nell'orientamento coronale dopo la perfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica del metodo utilizzato per macchiare le sezioni di tessuto crioconservato con Cresyl violet ed Eosin. I vetrini utilizzati per la colorazione sono stati maneggiati con utensili puliti con acqua senza RNase. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua gratuita RNase/DNase il giorno della colorazione. Cresyl macchie viola nuclei viola e eosina Y macchie citoplasma rosa. I coloranti sono stati sciolti nel 70% di etanolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto di vari approcci perfusione per preservare la morfologia dei tessuti e l'integrità dell'RNA. Le immagini H&E rappresentano la morfologia comparativa del tessuto cerebrale sottoposto a perfusione con diversi metodi: (A) La soluzione di Tyrode per 15 min, (B) Soluzione di Tyrode per 5 min, 4% PFA per 10 min, (C) La soluzione di Tyrode per 5 min, 30% saccarosio per 15 min, e (D) Soluzione di Tyrode per 5 min, 30% saccarosio per 15 min con pernottamento in immersione 30% saccarosio. Per ogni metodo di perfusione viene visualizzata la valutazione della qualità dell'RNA. I grafici raffigurano picchi di rRNA 18 e 28 s e il picco marcatore iniziale. Il rapporto di rRNA 18s e 28s viene utilizzato per determinare la qualità dell'RNA. Un'immagine gel dei frammenti di RNA viene visualizzata a destra delle trame. La qualità dell'RNA è stata valutata utilizzando i valori RIN. La qualità dell'RNA era elevata nei metodi A, C e D. La morfologia dei tessuti era superiore nei metodi C e D. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: Immagini rappresentative del tessuto glioma montato e non montato. (A) Immagini rappresentative dei tessuti macchiati di H&E. Questo tessuto è stato lasciato smontato ed è diventato disidratato mostrando scarsa morfologia con rotture nel tessuto. (B) Immagini rappresentative del tessuto macchiato con H&E e montato con supporto di montaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini rappresentative del tessuto glioma utilizzato per la microdisezione laser. (A-B) Immagini rappresentative di tessuto macchiato con H&E e aree di strutture multicellulari selezionate per LMD. (A) A sinistra, sono state selezionate aree di celle allungate (rosso) e aree di controllo (blu) per LMD. (B) Sulla destra sono state selezionate aree di invasione collettiva (rosso) e aree di controllo (blu) per LMD. (C) Controllo rappresentativo della qualità dell'RNA per le aree microdisseche laser. Una superficie totale di 6,5 x 106 m2 è stata microdissecata. L'analisi mostra la concentrazione di RNA di 2.346 pg/L e RNA Integrity Number (RIN): 6.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Comprendere i meccanismi molecolari alla base dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma è di fondamentale importanza per scoprire nuovi obiettivi terapeutici13. In questo manoscritto, descriviamo un metodo dettagliato e ottimizzato per analizzare il paesaggio molecolare dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma usando la microdissezione di cattura laser (LMD) seguita dall'analisi trascrittomica.
La microdissezione di cattura laser (LMD) può essere utilizzata per identificare diverse aree o singole cellule all'interno del tumore, fornendo un campione specifico per analizzare ulteriormente il modello molecolare mantenendo il contesto spaziale del tumore14. Questa tecnica è affidabile e a basso prezzo rispetto ad altri metodi utilizzati per analizzare il trascrittoma spaziale nei tumori solidi15. Abbiamo analizzato l'eterogeneità del glioma e l'invasione nei modelli tumorali del topo geneticamente ingegnerizzati o nei modelli impiantabili intracranici utilizzando LMD. Questi modelli ricapitolano le caratteristiche salienti dei gliomi umani, permettendo lo studio dell'eterogeneità e dell'invasione del glioma10,,12.
Mantenere la morfologia del tessuto tumorale di alta qualità e l'integrità dell'RNA è una delle limitazioni per l'LMD. Per migliorare la morfologia dei tessuti, abbiamo perfuso i topi con la soluzione di Tyrode per 5 minuti, seguiti dal 30% di saccarosio sciolto nella stessa soluzione. Una volta sezionato il cervello, l'abbiamo conservato nel saccarosio del 30% disciolto nell'acqua senza RNase/DNase durante la notte o fino a quando il cervello non ha raggiunto il fondo del contenitore di stoccaggio. Questi passaggi migliorano significativamente la morfologia del tessuto e hanno ridotto la formazione di cristalli di ghiaccio nel tessuto durante la crioconservazione. Anche se il tessuto glioma umano non è stato utilizzato per questo protocollo, l'incubazione di campioni umani nella soluzione di saccarosio del 30% durante la notte potrebbe essere una metodologia fattibile per migliorare la morfologia delle criosezioni. Un'altra possibile limitazione per l'LMD è la conservazione dell'integrità dell'RNA post-colorazione8. Anche se altri team di ricerca hanno eseguito microdissezione laser sul tessuto glioma seguita da analisi RNA-seq, non illustrano alcunRNA e/o morfologia né commentano la qualità morfologica, o controlli particolari per le sezioni congelate del glioma16. In questo protocollo l'identificazione morfologica accurata era essenziale per microdissect laser precise strutture macrocellulari all'interno dei gliomi. Abbiamo osservato che il fissaggio del tessuto glioma con soluzione di etanolo e colorazione con 4% Cresyl viola e 0.5% eosin Y disciolto in qualità di RNA mantenuto etanolo e ha permesso l'identificazione microscopica di singole cellule e strutture multicellulari. Abbiamo dimostrato che il montaggio di sezioni di glioma con soluzione di montaggio è un passo critico che impedisce la formazione di fessurazioni e fessure nel tessuto. Si prega di notare che il mezzo di montaggio deve essere preparato in acqua, come utilizzando il mezzo di montaggio disciolto in etanolo si tradurrà in scarsa morfologia dei tessuti. La microdissezione laser deve essere eseguita il più velocemente possibile in un ambiente privo di RNase. Si consiglia inoltre di sezionare fino a 2,5 x 106 m2 area totale tumorale/tessuto al fine di ottenere quantità appropriate di RNA, sia per il controllo della qualità dell'RNA che per l'analisi trascrittomica.
LMD consente l'analisi dei percorsi di segnalazione molecolare che regolano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Questa analisi potrebbe rivelare nuovi potenziali obiettivi per la diagnosi, la prognosi e il futuro sviluppo traslazionale in modelli di glioma preclinico.
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Disclosures
Tutti gli autori di questo documento non dichiarano potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni dei National Institutes of Health (NIH/NINDS): R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Concede R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; il Dipartimento di Neurochirurgia, il Rogel Cancer Center dell'Università del Michigan, la Fondazione ChadTough e la Fondazione Happy Hearts di Leah a M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 a M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 per l'Istituto per la ricerca clinica e sanitaria (MICHR), il programma di borse di studio per la traduzione post-istituzionale (PTSP), grant, Grant, Grant, Grant, Grant, Il progetto F049768 presso l'Università del Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Physician-Scientist Award della Research to Prevent Blindness, Inc. (RPB), concede R01 EY022633 dal NEI del NIH (AK), e una sovvenzione illimitata di RPB al Dipartimento di Oftalimologia e Scienze Visive. Questa ricerca ha utilizzato il Vision Research Core (P30 EY007003) e il Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK è sostenuto dal premio William Davidson Emerging Scholar Award dell'A. Alfred Taubman Medical Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
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